معلومة

كيف يتم اقتران الفلوروكرومات مع البروتينات مثل الجسم المضاد؟

كيف يتم اقتران الفلوروكرومات مع البروتينات مثل الجسم المضاد؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

كيف يتم ربط الفلوروكرومات مثل FITC بالأجسام المضادة؟ هل هم مرتبطون تساهميًا؟ إذا كانت مرتبطة تساهميًا ، فهل ستكسر درجة الحرارة المنخفضة (-20 درجة مئوية أو أقل) الروابط التساهمية وتفصل ملصق الفلوروكروم عن البروتين؟


ترتبط الفلوروكرومات تساهميًا بالأجسام المضادة لتكوين جزيئات ذات علامات ثابتة. تصفها هذه الورقة بتفصيل كبير ، من الملخص:

يمكن اقتران الفلوروكرومات تساهميًا مع الأجسام المضادة من خلال التفاعلات مع مجموعات الثيول أو الأمين. بشكل نموذجي ، يتم اتحاد الفلوروكرومات المحتوية على أيزوثيوسيانات ، إستر سكسينيميديل ، أو مجموعات تفاعلية كلوريد السلفونيل مع الأمينات الموجودة على جزيئات الجسم المضاد.

هذه الروابط التساهمية مستقرة في درجة حرارة الغرفة وتكون أيضًا عند -20 درجة مئوية. من المرجح أن تؤدي دورات التجميد-الذوبان المتكررة إلى تلف الجسم المضاد.


الفلوروفور والأصباغ

على الرغم من أن مضان الصبغة يتم تقييمه بشكل شائع في قياس التدفق الخلوي ، يمكن تحديد المعلومات القيمة من مستويات التألق الذاتي للخلايا غير الملوثة. الخلايا ذاتية التألق بشكل طبيعي ، خاصة عند الأطوال الموجية المنخفضة للطيف المرئي ، ويمكن للضوء المنتشر أن يوفر معلومات عن حجم الخلية ، ودرجة الحبيبات ، والتضاريس السطحية ، والنووية: نسبة السيتوبلازم. على سبيل المثال ، يسمح تحليل خلايا الدم البيضاء بتحديد أنواع مختلفة من الكريات البيض.

ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى من تجارب قياس التدفق الخلوي تتضمن استخدام الفلوروكروم. هذه جزيئات عضوية صغيرة أو بروتينات مثل ألوفيكوسيانين (APC) بخصائص فلورية. غالبًا ما يتم اقتران الفلوروكرومات بالأجسام المضادة الأولية أو الثانوية لتحديد الأهداف أو المؤشرات الحيوية. يتمثل أحد البدائل لتلطيخ الأجسام المضادة في استخدام الخلايا التي تعبر ، إما بشكل ثابت أو عابر ، عن بروتينات مهمة مدمجة مع البروتينات الفلورية مثل GFP أو Venus أو mRFP.

يعتمد اختيار الفلوروكروم على الإعداد التجريبي:

لتقليل التداخل الطيفي ، تجنب استخدام الفلوروكروميات ذات أطياف الإثارة المماثلة إذا كانت متحمسة بنفس الليزر.

تضيف بعض الفلوروكرومات وزنًا جزيئيًا كبيرًا إلى كواشف وضع العلامات - قد يقلل هذا من قدرتها على اختراق غشاء الخلية لتلطيخ الأهداف داخل الخلايا.

تأكد من التعامل بشكل صحيح مع الأصباغ الترادفية - تجنب دورات التجميد والذوبان والتعرض للضوء لتقليل الفصل.

إذا تم استخدام كواشف الفلوروفور ، يتم تلطيخ الخلايا ثم غسلها قبل التحليل لإزالة فائض الأصباغ غير المقيدة. الجدول 1 يعرض نصائح حول إجراءات التلوين بكواشف الفلوروفور المختلفة. النفاذية مطلوبة لتحليل البروتينات داخل الخلايا باستخدام الأجسام المضادة.

الجدول 1. أنواع الكواشف الفلورية المستخدمة بشكل شائع في قياس التدفق الخلوي.

كاشف مثال الخلايا الحية الخلايا الثابتة نفاذية
أصباغ حيوية يوديد البروبيديوم نعم لا لا
علامات أبوتوتيك الملحق المسمى الفلورسنت في الخامس نعم لا لا
تعبر الخلايا عن البروتينات الفلورية GFP-LC3 نعم نعم غير مطلوب
الأجسام المضادة الفلورية ضد البروتينات خارج الخلية E-cadherin (انظر الشكل 2) نعم نعم غير مطلوب
الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية ضد البروتينات داخل الخلايا Lamin A / C (انظر الشكل 2) تحدي تقنيًا نعم مطلوب

الشكل 2. قياس التدفق الخلوي مناسب لتحليل كل من الأهداف خارج الخلية وداخلها.

اليسار: تم تلوين 1X10 ^ 6 خلايا HepG2 بجسم مضاد 2ug E-cadherin (20874-1-AP ، أحمر) وجسم مضاد للتحكم (أزرق). تم إصلاحه مع 90٪ MeOH مسدود مع 3٪ BSA (30 دقيقة). Alexa Fluor ™ 488- مترافق AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) مع تخفيف 1: 1000.

حق: تم تلوين 1X10 ^ 6 خلايا HEK-293T باستخدام 0.2 ميكروغرام من الجسم المضاد Lamin A / C (10298-1-AP ، أحمر) وجسم مضاد (أزرق). تم إصلاحه مع 90٪ MeOH مسدود مع 3٪ BSA (30 دقيقة). Alexa Fluor ™ 488- مترافق AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) مع تخفيف 1: 1000.


الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع DyLight® Fluorochrome

تُظهر الفلوركرومات DyLight® كثافة عالية في الفلورة ، واستقرار ضوئي وقابلية للذوبان في الماء وتظل فلوريًا من درجة الحموضة 4.0 ودرجة الحموضة 9.0. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح قابلية الذوبان في الماء لـ DyLight® fluorochromes بتحقيق نسبة عالية من الصبغة إلى الجسم المضاد دون التسبب في ترسيب الاتحادات.

تتميز فلوروكرومات DyLight® بحد أقصى للامتصاص يتراوح من 350 نانومتر إلى 777 نانومتر ، تغطي طيف الضوء المرئي بأكمله. تتوافق كل من خصائص الامتصاص والانبعاث الخاصة بـ DyLight® fluorochromes مع الإثارة والكشف عن أطوال موجات أجهزة التألق الشائعة.

يتضمن الكتالوج الخاص بنا أجسامًا مضادة ثانوية مقترنة بـ DyLight ® 488 و DyLight ® 550 و DyLight ® 594 و DyLight® 650.

الشكل 1. أطياف انبعاث الضوء الداكن®​ الفلوروكرومات المتاحة في الكتالوج الخاص بنا.

يبرز متقارن الأجسام المضادة

  • مجموعة كبيرة من الخصائص المختلفة
  • مُحسَّن للأداء المُقترن - الأجسام المضادة المُنقاة بالتقارب أو المُمتزة مسبقًا
  • ثابت ومستقر - مستقر لمدة عام عند 4 درجات مئوية ، مما يوفر أداءً ثابتًا طوال مدة الاستخدام

مزايا

  • مضان ساطع - يوفر الانبعاث الشديد حساسية عالية
  • أطياف الانبعاث الضيقة - نزف ضئيل بين قنوات الفلوروكروم يجعل التصوير متعدد الألوان أمرًا سهلاً
  • مقاوم للضوء بدرجة عالية - مقاومة أفضل لتبييض الصور
  • مستقر تمامًا في المحاليل المعيارية التي تتراوح من درجة الحموضة 4.0-9.0
  • توافق الأداة - يمكن تصور DyLight® باستخدام إعدادات الفلتر والليزر الشائعة

خصائص صبغ DyLight®

الفلوركرومات DyLight® مناسبة للفحص المجهري الفلوري وقياس التدفق الخلوي.

الفلوروكروماللونالسابق / مأطيافالأصباغ المكافئة طيفية
DyLight® 488
493/518عرض الرسم البيانيFITC ، Cy2®
DyLight® 550
562/576عرض الرسم البيانيCy3® ، TRITC
ديلايت® 594
593/618عرض الرسم البيانيتكساس ريد®
DyLight® 650
652/672عرض الرسم البيانيCy5®

الجدول 1. الخصائص الطيفية لـ DyLight®​ الفلوروكرومات.

ε: معامل الانقراض المولي عند أقصى امتصاص

لمزيد من المعلومات أو المساعدة ، اتصل بفريق الدعم العلمي لدينا.

ديلايت®​ هي علامة تجارية لشركة Thermo Fisher Scientific Inc. والشركات التابعة لها. ساي®​ و CyDye® هي علامات تجارية لشركة GE Healthcare Limited.


كيف يتم اقتران الفلوروكرومات مع البروتينات مثل الجسم المضاد؟ - مادة الاحياء

مبادئ قياس التدفق الخلوي

يستخدم قياس التدفق الخلوي عادةً لتحليل التعبير عن الجزيئات داخل الخلايا والسطحية ، وتوصيف وتحديد أنواع الخلايا المختلفة في مجموعة خلايا غير متجانسة ، وتقييم نقاء المجموعات السكانية الفرعية المعزولة وكذلك تحليل حجم الخلية وحجمها.

كما هو مبين في الشكل 1 ، في خطوة إعداد العينة ، يتم تسمية الخلايا ذات الأهمية بالفلوروكرومات. يتم بعد ذلك حقن الخلايا المعلقة في تيار رقيق متمركز بشكل هيدروديناميكي عن طريق الحقن المشترك لتدفق الغلاف ، وضربه بأشعة الليزر. يتم الكشف عن تشتت الضوء بواسطة أجهزة الكشف عن الصور الأمامية والجانبية. يتم فرز الإسفار في المقعد البصري باستخدام مرايا ومرشحات ثنائية اللون واكتشافها وتضخيمها بواسطة المضاعفات الضوئية. ثم يتم تحليل الإشارات بواسطة برنامج معين.

الشكل 1 مبادئ قياس التدفق الخلوي. (Depince-Berger ، 2016)

الفلوروفور

Fluorophores هم علامات uorescent فلوريدا المستخدمة للكشف عن التعبير من الأحماض النووية أو البروتينات. يقبلون وظيفيًا الطاقة الضوئية بطول موجي معين ويعيدون إرسالها بطول موجي أطول. هناك نوعان من أنواع رئيسية من uorophores فلوريدا مع تطبيق امكانات كبيرة في التدفق الخلوي.

كانت الأصباغ المنفردة مثل فلورسين إيزوثيوسيانات (FITC) ، ألوفيكوسيانين (APC) ، و Phycoerythrin (PE) متاحة لسنوات عديدة. تشتمل الأصباغ الترادفية على حمة شحمية صغيرة مقترنة تساهميًا بحفرة شحم أخرى. عندما تكون الصبغة الأولى متحمسة وتصل إلى أقصى حد لها من الحالة المفردة الإلكترونية ، يتم نقل طاقتها إلى الصبغة الثانية. هذا ينشط uorophore فلوريدا الثانية، والتي تنتج ثم انبعاث uorescence فل.

أصبحت البروتينات الفلورية ، مثل البروتينات الخضراء (GFP) ، والبروتين الأصفر (YFP) ، والبروتين الفلوري الأحمر (RFP) ، و mCherry مستخدمة على نطاق واسع لتحليل التدفق الخلوي وفرز الخلايا. البروتينات uorescent فلوريدا وغالبا ما تكون شارك التعبير عن أو كنسبة الانصهار مع بروتين من الفائدة.

الأجسام المضادة المقترنة في قياس التدفق الخلوي: وضع العلامات المباشر مقابل غير المباشر بالفلوروفور

بشكل عام ، فإن الفلوروفورات المستخدمة كقراءات في تجربة قياس التدفق الخلوي مرتبطة تساهميًا بجسم مضاد. عندما يتم استخدام جسم مضاد مترافق في اختبار قائم على الخلية ، فإن الضوء المنبعث من الفلوروفور يعمل كمؤشر مباشر لكمية الجسم المضاد الموجود في الخلية أو عليها. باستخدام الاتحادات التي ترتبط على وجه التحديد بالبروتين ، يمكن للباحث تحديد هدف الاهتمام مباشرة في كل خلية ، بناءً على مستوى التألق المنبعث من تلك الخلية. يشار إلى هذه العملية باسم الكشف المباشر ، أو قياس التدفق الخلوي المباشر.

النهج البديل ، التدفق الخلوي غير المباشر ، يستخدم جسم مضاد ثانوي موجه ضد الغلوبولين المناعي (Igs) من المضيف الذي تم فيه تكوين الجسم المضاد الأولي. في هذه الطريقة ، يتم اقتران الجسم المضاد الثانوي بحامل الفلور ، تاركًا الجسم المضاد الأولي دون تعديل.

الشكل 2 التألق المناعي المباشر وغير المباشر.

التلوين المباشر مقابل غير المباشر لقياس التدفق الخلوي

  • يمكن إجراء مضاعفة مباشرة للأجسام المضادة من نفس المضيف
  • بروتوكول أسرع بسبب عدد أقل من خطوات الحضانة والغسيل
  • قادرة على استخدام العديد من الأجسام المضادة المختلفة في اختبار واحد ، مما يتيح قراءة عدد كبير من نقاط النهاية في وقت واحد
  • لا يوجد تضخيم إشارة من جسم مضاد ثانوي
  • قد يحسن اكتشاف الأهداف الموجودة بكثرة منخفضة ، حيث يوفر حساسية أعلى بسبب التضخيم الثانوي
  • مفيد للتحقق الأولي من الجسم المضاد الأساسي عندما لا يتوفر اتحاد مباشر بعد
  • العدد المحدود من الأجسام المضادة التي يمكن دمجها في التجربة
  • تلطيخ من خطوتين
  • قد تتفاعل الأجسام المضادة الثانوية مع أنواع أخرى غير الهدف
  • قد يكون قياس التدفق الخلوي غير المباشر مفضلًا على قياس التدفق الخلوي المباشر عندما يتسبب اقتران الجسم المضاد الأولي في حدوث تغيرات فاصلة تؤثر على الخصوصية والوظيفة.
  • يمكن أيضًا تفضيل قياس التدفق الخلوي غير المباشر عند الرغبة في زيادة الإشارة. يمكن أن يرتبط أكثر من جسم مضاد ثانوي بجسم مضاد أولي ، وبالتالي يتم تضخيم الإشارة المشتقة من كل جزيء مستضد مرتبط بالجسم المضاد الأولي.

تحليل البيانات

يعتمد تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي بشكل أساسي على مبدأ البوابة. يتم وضع البوابات والمناطق حول مجموعات الخلايا ذات الخصائص المشتركة ، عادةً مبعثر للأمام (FSC) ، مبعثر جانبي (SSC) وتعبير علامة. يمكن تحديد حجم وتفصيل الخلايا على أساس خصائص FSC و SSC. يمكن أن يكون التمييز بين مجموعات الخلايا بشكل مستقيم للأمام نسبيًا لخطوط الخلايا حيث يوجد نوع واحد فقط من الخلايا ، ولكن يمكن أن يكون أكثر تعقيدًا بالنسبة للعينات التي توجد بها أنواع خلايا متعددة.

غالبًا ما يكون للحطام والخلايا الميتة مستوى أقل من FSC وتوجد في الركن الأيسر السفلي من مخطط الكثافة. يمكن أيضًا عرض الأحداث كمخطط نقطي حيث لا يتم عرض معلومات الكثافة أو كخريطة محيطية لإظهار الكثافة النسبية لأنماط التشتت. يعود الأمر إلى تفضيل المستخدم فيما يتعلق بالعرض المفضل ، ولكن في بعض الأحيان يكون من الأسهل تصور مجموعات الخلايا المنفصلة في المخططات الكنتورية.

الشكل 3 قياس FSC و SSC.

التطبيقات المشتركة

الاستخدام الأكثر شيوعًا لقياس التدفق الخلوي هو تحديد العلامات الموجودة على الخلايا. يمكن أن يكون التنميط المناعي ببساطة هو تحديد خلية عن طريق علامة واحدة أو تحديد أكثر تعقيدًا للخلايا ، باستخدام ملف تعريف التوجيه ، وحالات التنشيط وإطلاق السيتوكين في لوحة واحدة. نتيجة لذلك ، غالبًا ما تكون البروتوكولات التجريبية مزيجًا من تلطيخ السطح وداخل الخلايا.

واحدة من أكثر سمات موت الخلايا المبرمج شيوعًا التي يمكن قياسها عن طريق قياس التدفق الخلوي هي إخراج الفوسفاتيديل سيرين (PS) ، وهو فوسفوليبيد موجود في الغشاء الداخلي للخلايا السليمة. يربط Annexin V لسيرين الفوسفاتيديل وبالتالي V annexin المسمى مع uorophores فلوريدا تسمح الخلايا ليتم تقييمها، وعادة في توليفة مع بقاء صبغ مثل يوديد propidium (PI) للتمييز بين أفكارك من خلايا الميتة.

يمكن أيضًا قياس تجزئة الحمض النووي ، الذي يحدث خلال المراحل المتأخرة من موت الخلايا المبرمج ، عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام مقايسة sub-G1. تتسرب شظايا الحمض النووي الصغيرة الناتجة أثناء موت الخلايا المبرمج من الخلايا ، مما يقلل من محتوى الحمض النووي الكلي للخلايا المبرمج. عن طريق تلطيخ الحمض النووي باستخدام PI ، يمكن حساب الخلايا المبرمجية تحت الجلد في ذروة G1 الفرعية من الرسم البياني PI. إلى جانب ذلك ، يمكن أيضًا قياس موت الخلايا المبرمج المبكر بواسطة الأصباغ الفعالة التي تقيم إمكانات الميتوكوندريا المنخفضة للخلايا ، مثل JC-1 و tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) و tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). تتجمع هذه الأصباغ في الميتوكوندريا للخلايا غير المبرمجة وتتألق بشكل مشرق. عندما تنهار إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، تتشتت الصبغة في السيتوبلازم في شكله الأحادي مما يؤدي إلى تقليل التألق أو تغيير اللون.

يمكن قياس تكاثر الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام عدة طرق. تتمثل إحدى الطرق في تلطيخ الجسم المضاد بعلامة انتشار مثل Ki67 أو MCM2. إلى جانب ذلك ، يمكنك احتضان خلاياك باستخدام BrdU ، والذي يدمج في الحمض النووي أثناء المرحلة S من دورة الخلية. يمكن الكشف عن BrdU المدمجة باستخدام الأجسام المضادة لـ BrdU المسمى uorescently. عندما يقترن بصبغة الحمض النووي مثل PI ، يمكن تحديد النسبة النسبية للخلايا في المرحلة S.

تطبيقات أخرى

  • انفجار مونوسيتي التأكسدي
  • انفجار مؤكسد العدلات
  • البلعمة الوحيدات
  • البلعمة العدلة
  • التحليل الميكروبيولوجي
  • الاتجار بالخلايا
  • الخلوية والجسم المضاد أو السمية الخلوية بوساطة مكملة
  • الفرز على أساس التشكل (FSC أو SSC) و / أو خصائص uorescent

الأقسام ذات الصلة بقياس التدفق الخلوي

تقدم Creative Biolabs عرضًا تقديميًا لا يقدر بثمن للمبتدئين في قياس التدفق الخلوي ويكون بمثابة ملخص مليء بالحقائق لأولئك منكم المهتمين بتعليم الآخرين حول مزايا هذا التطبيق القوي. لمزيد من المساعدة في التعلم ، قدمنا ​​الأقسام التالية لتستعرضها. يتم توفير دليل البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها تحت كل نهج تجريبي. يرجى الرجوع إلى القسم المقابل للحصول على التفاصيل.


الأجسام المضادة المقترنة بالإنزيمات والكرومات الفلورية وغيرها

تعتبر الأجسام المضادة المقترنة أداة بحث مفيدة في مجموعة متنوعة من التطبيقات ، بدءًا من اللطخة الغربية إلى قياس التدفق الخلوي. نحن في Novus Biologicals نقدم العديد من الأجسام المضادة الأولية المقترنة بالإنزيمات مثل HRP ، و fluorochromes مثل FITC ، وغيرها بما في ذلك أصباغ البيوتين والسيانين.

معمل الأجسام المضادة الخاص بنا مشغول دائمًا بمشاريع اقتران الأجسام المضادة المخصصة. في الأسبوع الماضي ، أجرى المختبر العديد من عمليات الاقتران ، بما في ذلك الجسم المضاد لمستقبل LDL للبيوتين ، وجسم مضاد لـ HMGB1 لـ HRP ، وجسم مضاد لـ Actin لـ DyLight 488 ، وجسم مضاد لـ CD133 لـ DyLight 549.

عندما سُئل عن الفرق بين اقتران الجسم المضاد بـ HRP والبيوتين وصبغات DyLight ، أوضح أحد فنيي مختبر Novus ، David Kuroki ، أحد الفروق فقط:

"يتم استخدام غسيل الكلى لإزالة الأمينات الأولية وأي أزيد الصوديوم قد يكون موجودًا. بالنسبة لـ HRP و Biotin ، يكون محلول غسيل الكلى PBS ، درجة الحموضة 7.4. بالنسبة لفلور DyLight ، يكون محلول غسيل الكلى 50 ملي مولار بورات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.5. الفرق في أوقات الحضانة ، 30 دقيقة للبيوتين ، 1 ساعة لفلور DyLight و 3 ساعات لـ HRP ".

ذكر كوروكي أيضًا أن اقتران الأجسام المضادة يمكن أن يستغرق من 3 إلى 6 ساعات ، اعتمادًا على الاتحاد المحدد. أولاً ، يتم قياس كمية الجسم المضاد لنقطة مرجعية ، ثم يتم تحويله إلى المخزن المؤقت المناسب. بعد ذلك ، يتم تركيز الجسم المضاد ، إذا لزم الأمر ، ثم تحديد كميته مرة أخرى لتحديد كفاءة الاسترداد. بعد الانتهاء من هذه الخطوات ، يحدث الاقتران الفعلي.

تصفح الأجسام المضادة المقترنة التي نقدمها من خلال زيارة صفحة الأجسام المضادة الأساسية لدينا واستخدام المرشح المترافق في الجانب السفلي الأيسر من الشاشة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بسهولة بتسمية أي جسم مضاد بوقت استخدام يدوي لمدة 30 ثانية فقط باستخدام مجموعات وضع العلامات على الجسم المضاد Lightning-Link.


كيف يتم اقتران الفلوروكرومات مع البروتينات مثل الجسم المضاد؟ - مادة الاحياء

الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC)

الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) هي تقنية قوية تستخدم الارتباط المحدد بين مولد الضد والجسم المضاد لاكتشاف وتحديد مستضدات معينة في الخلايا والأنسجة ، وغالبًا ما يتم تصورها بواسطة الفحص المجهري الضوئي. يستخدم IHC على نطاق واسع في التشخيص السريري في علم الأمراض التشريحي مع ظهور طرق استرجاع المستضد مما يسمح بإجراء ذلك بشكل ملائم على أنسجة الفورمالين الثابتة المضمنة بالبارافين (FFPE) والطرق الآلية للمعالجة ذات الحجم الكبير مع إمكانية التكاثر. إلى جانب ذلك ، يتم استخدام IHC بشكل متكرر للمساعدة في تصنيف الأورام وتحديد موقع منشأ الورم النقيلي والكشف عن بؤر صغيرة من الخلايا السرطانية غير واضحة على الهيماتوكسيلين الروتيني وتلطيخ الإيوزين (H & ampE). علاوة على ذلك ، يتم استخدام المدينة العالمية للخدمات الإنسانية بشكل متزايد لتوفير المعلومات التنبؤية والإنذارية.

خطوات عامة

يمكن تلخيص خطوات مدينة IHC على النحو التالي: تثبيت الأنسجة ، التضمين والتقسيم ، استرجاع المستضد ، النفاذية ، الحجب ، حضانة الجسم المضاد والتكوين المناعي.

    تثبيت الأنسجة والتضمين والتقطيع

يعد تثبيت عينة الأنسجة أمرًا حيويًا للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا والأنسجة أثناء تجربة مدينة IHC وتخزينها. يمنع التحلل الذاتي والنخر للأنسجة المستأصلة ، ويحافظ على الأنتيجين ويعزز معامل الانكسار لمكونات الأنسجة. يتأثر المثبت المستخدم بالمستضد المستهدف بالإضافة إلى تقنية الكشف المطلوبة (الفلورسنت أو الكروموجينيك). ثم يتم دمج عينة الأنسجة إما في البارافين أو يتم تجميدها. التضمين مهم في الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة وإعطاء دعم الأنسجة أثناء التقسيم. قد لا تنجو بعض الحواتم من التثبيت القاسي أو التضمين. يتم تقطيع الأنسجة عادة إلى أقسام رفيعة أو قطع أصغر لتسهيل مزيد من الدراسة.

إرشادات لاختيار المثبت

  • الخلايا / المستحضرات الخلوية: 4٪ فورمالديهايد
  • أقسام الأنسجة: 10٪ فورمالين محايد (NBF)

يمكن أن تؤدي عملية تثبيت العينة إلى الارتباط المتبادل للبروتين ، والذي يخفي المستضدات ويمكن أن يقيد ارتباط المستضد بالأجسام المضادة. يمكّن استرجاع المستضد الجسم المضاد من الوصول إلى البروتين المستهدف داخل الأنسجة. يمكن استعادة الحواتم المقنعة باستخدام إما استرجاع المستضد الإنزيمي / المحلل للبروتين ، أو طرق استرجاع المستضد بفعل الحرارة. تعتمد تقنية استرجاع المستضد المثلى على المستضد والأنسجة وطريقة التثبيت و / أو الجسم المضاد الأولي. تتطلب بعض المستضدات مزيجًا من التسخين وهضم الإنزيم.

  • في الطريقة الأنزيمية ، يتم استخدام البروتياز مثل بروتيناز ك ، التربسين ، وبيبسين.
  • تستخدم الطريقة الناتجة عن الحرارة الحرارة ومجموعة مختارة من المخازن المؤقتة.
المخازن المؤقتة لاسترجاع المستضد بفعل الحرارة صياغة إنزيم لاسترجاع المستضد الإنزيمي
محلول السيترات درجة الحموضة 6.0 بيبسين
EDTA عازلة درجة الحموضة 8.0 بروتين ك
تريس عازلة pH 10.0 التربسين
Tris-EDTA عازلة درجة الحموضة 9.0

النفاذية مطلوبة عندما يحتاج الجسم المضاد إلى الوصول إلى داخل الخلايا من أجل اكتشاف المستضد المستهدف ، مثل البروتينات داخل الخلايا والحواتم السيتوبلازمية لبروتينات الغشاء. تستخدم المذيبات أو المنظفات عادةً في عملية النفاذية.

إرشادات بشأن المذيبات والمنظفات

المذيبات الأسيتون سوف يتخلل تثبيت الأسيتون أيضًا
الميثانول يمكن استخدام تثبيت الميثانول للتنفيس ولكنه ليس فعالًا دائمًا
منظفات Triton X-100 أو NP-40 استخدم 0.1 إلى 0.2٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق فقط
توين 20 ، سابونين ، ديجيتونين وليوكوبرم استخدم 0.2 إلى 0.5٪ لمدة 10 إلى 30 دقيقة

غالبًا ما تحتوي المدينة العالمية للخدمات الإنسانية (IHC) على خطوة حظر واحدة أو أكثر لتقليل إشارة الخلفية والإيجابيات الكاذبة. تشمل هذه الخطوات: حجب البروتين ، وحجب البيوتين ، وحجب الإنزيم الداخلي.

يمنع الحجب بالمصل أو الكاشف المعوق للبروتين الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة بالأنسجة أو مستقبلات Fc. المصل هو عامل مانع شائع لأنه يحتوي على أجسام مضادة ترتبط بمواقع غير محددة. يوصى باستخدام مصل مطابق لأنواع الجسم المضاد الثانوي. يمكن أيضًا استخدام البروتينات مثل BSA أو الكازين لمنع ارتباط الجسم المضاد غير المحدد ، ومع هذه ليست هناك حاجة لمطابقة الكاشف مع أنواع الجسم المضاد الثانوي.

في حالة استخدام نظام الكشف المعتمد على البيوتين ، يوصى بحظر البيوتين الداخلي. يوجد البيوتين في العديد من الأنسجة ، وخاصة في الكلى والكبد والدماغ. يتم حظره عن طريق الحضانة المسبقة للنسيج باستخدام أفيدين ، يليه الحضانة بالبيوتين لمنع مواقع ارتباط البيوتين الإضافية على جزيء أفيدين.

عادةً ما تستخدم طرق الكشف الكروموجينيك إنزيمًا مرتبطًا بجسم مضاد ثانوي لتصور توطين الجسم المضاد. إذا كان الإنزيم موجودًا بشكل طبيعي في الأنسجة قيد الدراسة ، فيجب حظر نشاطه قبل خطوة الكشف. للتحقق من نشاط البيروكسيداز الداخلي ، يمكن تحضين الأنسجة باستخدام ركيزة DAB قبل حضانة الجسم المضاد الأولي. إذا تحولت الأنسجة إلى اللون البني ، يكون البيروكسيداز الداخلي موجودًا ويلزم اتخاذ خطوة منع. عادة ما تكون فترة الحضانة لمدة 10-15 دقيقة في 0.3 ٪ من بيروكسيد الهيدروجين بمثابة حظر كافٍ. يمكن اختبار الأنسجة من أجل الفوسفاتيز القلوي الداخلي (AP) عن طريق الحضانة باستخدام BCIP / NBT. إذا لوحظ لون أزرق ، فإن AP الذاتية موجودة ، والحظر ضروري. يستخدم Levamisole للحجب ويضاف مع الركيزة الكروموجينيك. يتم حظر AP المعوية بحمض ضعيف قبل إضافة الجسم المضاد الأساسي.

الاكتشاف المباشر مقابل غير المباشر في المدينة العالمية للخدمات الإنسانية

في طرق الكشف المباشر ، يتم اقتران الجسم المضاد الأولي مباشرةً بالعلامة. من أجل الاكتشاف غير المباشر ، يرتبط الجسم المضاد الأولي بجسم مضاد ثانوي مُسمى تم رفعه ضد الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأولي. قد تتضمن الطرق غير المباشرة أيضًا خطوات تضخيم لزيادة شدة الإشارة. غالبًا ما يتم تحديد اختيار الكشف المباشر أو غير المباشر من خلال مستوى التعبير لمستضد الهدف.

الشكل 1 مقارنة بين طرق الكشف المباشرة وغير المباشرة. (بوتشوالو ، 2010)

  • أسرع بشكل عام ، نظرًا لوجود عدد أقل من الخطوات.
  • فرصة أقل للإشارة غير المحددة.
  • غالبًا ما يعطي إشارة أقوى لأن العديد من الأجسام المضادة الثانوية ترتبط بكل جسم مضاد أولي.
  • من السهل تغيير نوع التسمية أو طرق الكشف لتجربة جديدة عن طريق تبديل المرتبات الثانوية.
  • يوفر وقت وضع العلامات والنفقات ، خاصةً عندما يتم تصنيع جميع الأجسام المضادة الأولية من نفس النوع.
  • يوفر الوصول إلى نطاق أوسع من الملصقات.
  • قد يؤثر اقتران الملصق بالجسم المضاد الأولي على قدرة الجسم المضاد على الارتباط بالبروتين المستهدف.
  • يضيف تصنيف كل جسم مضاد أولي الوقت والتكلفة.
  • يمكن أن تنشأ إشارة غير محددة أكثر من ارتباط الجسم المضاد الثانوي ببروتينات أخرى على البقعة.
  • تضيف خطوات الحضانة والغسيل الإضافية وقتًا للتجربة.

الكشف عن الكروموجينيك مقابل الكشف عن الفلورسنت في المدينة العالمية للخدمات الإنسانية

  • تعدد أسهل: ألوان أكثر وأطياف انبعاث أضيق من الصبغات الصبغية.
  • أفضل توطين الهدف: تسمح الأصباغ الفلورية بتحديد منفصل للأهداف المحلية.
  • النطاق الديناميكي العالي: من الأسهل تصور الأهداف النادرة والعالية الوفيرة على نفس الشريحة.
  • خطوات أقل: لا توجد خطوة لإضافة الركيزة.
  • حساسية أقل: يمكن تضخيم الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم عبر الكشف غير المباشر لزيادة الحساسية.
  • عرضة للتبييض الضوئي: قد يؤدي التعرض للضوء إلى تقليل إشارة الفلورسنت بمرور الوقت.
  • حساسية أكبر: تضخيم الإشارة عبر يزيد الكشف اللوني غير المباشر من قوة الإشارة.
  • إشارة تدوم طويلاً: البقع الكروموجينية أكثر مقاومة للتبييض الضوئي من الفلوروكرومات.
  • صعوبة تحديد الهدف المشترك: من الصعب التمييز بين اللون المختلط واللون الفردي عند مشاركة الأهداف في الترجمة.
  • النطاق الديناميكي الضيق: من الصعب تصور الأهداف النادرة والعالية الوفيرة على نفس الشريحة.
  • مضاعفة صعبة: ألوان أقل وأطياف انبعاث أوسع من الأصباغ الفلورية.

ملخص طرق تضخيم الإشارة

  • حساسية أكبر من الكشف غير المباشر التقليدي.
  • حجم معقد أصغر مقارنة بـ ABC يسهل اختراق الأنسجة بشكل أكبر.
  • حساسية أكبر من ABC و LSAB.
  • خطوات أقل من ABC و LSAB.

IHC هي تجربة معقدة مع العديد من المعلمات التي يجب أخذها في الاعتبار وتحسينها. يوضح استكشاف الأخطاء وإصلاحها للكيمياء المناعية (IHC) المصادر المحتملة للمشكلات الشائعة وكيفية مكافحتها. يرجى الرجوع إلى القسم المقابل التالي للحصول على التفاصيل.


الفلوروفورز لقياس التدفق الخلوي

ليست كل مركبات الفلور مناسبة لكل تطبيق يعتمد على الأجسام المضادة. على سبيل المثال ، على الرغم من أن البولي إيثيلين ساطع ، إلا أنه من السهل تبييضه وبالتالي فهو غير مناسب للتصوير الفلوري.

نظرًا للزيادة في حجم ألواح قياس التدفق الخلوي ، يتطلب قياس التدفق الخلوي التقليدي وجود فلوروفور ساطع يحتوي على إثارة محددة وطول موجي انبعاث من ليزر واحد. ومع ذلك ، يتطلب قياس التدفق الخلوي الطيفي ملفات تعريف طيفية فريدة للسماح بفك الخلط في الألواح. يجب أن تكون هذه الفلوروفورات متوافقة مع بعضها البعض في اللوحة ويجب أن تكون مثالياً للضوء ولا تظهر أي فقد في التألق عند التثبيت.

قم بزيارة صفحة Flow Cytometry Fluorophores الخاصة بنا للحصول على معلومات أكثر تفصيلاً عن الفلور المتوافق مع قياس التدفق الخلوي ، بما في ذلك أصباغ StarBright الجديدة الخاصة بنا.


منصة تطوير الأجسام المضادة IVD

تقدم Creative Biolabs خدمة مخصصة كاملة للأجسام المضادة تغطي كل خطوة من خطوات التطور أحادي النسيلة ومتعدد النسيلة. نحن ننتج ونتحقق من صحة الأجسام المضادة ضد عدد من بروتينات العلامات الحيوية. تشمل مجالات البحث السرطان والاستماتة والبيولوجيا العصبية والمناعة وأمراض القلب والأوعية الدموية والأمراض المعدية. نحن نقدم خدمات تطوير الأجسام المضادة المخصصة بما في ذلك:

  • تصميم وتوليف واقتران الببتيدات المناسبة لتوليد الأجسام المضادة مع التقارب والخصوصية المتوقعة.
  • يمكن تكوين الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في فأر أو جرذ أو هامستر أو أنواع أخرى لتلبية متطلبات مضيفنا الخاصة.
  • تسمح خدمات الأجسام المضادة متعددة النسيلة بإنتاج أجسام مضادة من مجموعة واسعة من الأنواع المضيفة.
  • مطابقة أزواج الأجسام المضادة mAb-mAb و mAb-pAb و pAb-pAb لمقايسة ELISA.
  • تتوفر تقنيات عرض الورم الهجين والعاثية لتطوير الأجسام المضادة المخصصة.
  • الأجسام المضادة المؤتلفة ذات الطول الكامل (تبديل الأنواع والنمط المتماثل) والطول الجزئي (scFv ، Fab ، F (ab)2، BSAb).
  • استنساخ المنطقة المتغيرة للجسم المضاد وتسلسلها ، وإضفاء الطابع البشري على الجسم المضاد ، وتحسين الجسم المضاد.
  • خدمة تنقية كاملة للببتيد والأجسام المضادة باستخدام كل من منهجية التقارب التقليدية والمخصصة.

العلماء في Creative Biolabs خبراء في اقتران الأجسام المضادة / البروتين. سواء كنت تبحث عن اتحاد مختلف للأجسام المضادة الخاصة بنا أو تحتاج إلى اقتران مخصص للأجسام المضادة الخاصة بك ، يمكننا تقديم خدمة اقتران الأجسام المضادة المخصصة عالية الجودة وبأسعار معقولة مع أوقات تحول سريعة لا تقبل المنافسة. تشمل ميزات خدمات اقتران الأجسام المضادة / البروتين / الببتيد لدينا ما يلي:

  • اقتران مخصص من الببتيد أو الجسم المضاد أو البروتينات الأخرى للهابات ، والناقلات ، والملصقات ، والإنزيمات المستجيبة.
  • مجموعة واسعة من الاتحادات والتسميات مثل اتحادات البروتين والبروتين ، وتقارن الجسيمات ، والبيوتين ، والكرومات الفلورية ، والملصقات الخاصة.
  • ويشمل تصنيف المنتج النهائي وتنقيته وتوصيفه.
  • نصائح شاملة حول إمكانيات وضع العلامات وتصميم التفاعل.

بصفتنا مطورين رائدين للمقايسات المناعية عالية الجودة ، Biolabs الإبداعية لديه سنوات من الخبرة في استخدام الأجسام المضادة لتطوير المقايسات ومجموعات التشخيص المناعي. يمكننا إنتاج فحوصات تشخيصية في ELISA ، التدفق الجانبي ، حبة اللاتكس ، لطخة غربية ، كيمياء مناعية ، وتنسيقات قياس التدفق الخلوي. من خلال الخبرة المشتركة في كيمياء البروتين وعلم المناعة والبيولوجيا الجزيئية ، يمكن لفريقنا العلمي مساعدتك في كل خطوة من خطوات عملية التطوير ، من التصميم إلى التحقق من الصحة.

يمكن تقسيم سير العمل النموذجي لتطوير المقايسة المناعية IVD في Creative Biolabs إلى ثلاث مراحل: نطاق المشروع ، وتطوير الفحص ، والإنتاج وتصنيع أمبير.

ميزات خدمات تطوير الأجسام المضادة IVD

  • الجودة مدعومة بفرق فنية ودعم عملاء من ذوي الخبرة ، بالإضافة إلى أحدث المرافق.
  • متخصص في تطوير الأجسام المضادة والتحاليل المخبرية (IVD) مع استكمال العديد من المشاريع المتعلقة بالتحليل المخبري (IVD).
  • وقت سريع وأسعار تنافسية.
  • تقديم فحوصات مخصصة بسرعة وبصورة اقتصادية لأي مؤشرات حيوية وتقديم منتجات IVD جديدة إلى السوق.

لمزيد من المعلومات حول أي من هذه الخدمات ، لا تتردد في الاتصال بنا.


    في أي نوع تم تطوير الجسم المضاد الأساسي؟
    يتم توجيه الأجسام المضادة الثانوية ضد أنواع الجسم المضاد الأولي. لذلك ، سوف تحتاج إلى جسم مضاد ثانوي نشأ في نوع مختلف عن الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي. على سبيل المثال ، إذا تم رفع الجسم المضاد الأساسي في فأر ، فستحتاج إلى جسم مضاد ثانوي مضاد للفأر يتم تربيته في الماعز والأرانب وما إلى ذلك.

ما هي فئة (isotype) و / أو فئة فرعية من الجسم المضاد الأساسي؟
هذا السؤال مهم بشكل أساسي عند العمل مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. ومع ذلك ، فإن الأجسام المضادة متعددة النسيلة هي عادةً الجلوبيولينات المناعية من فئة IgG. لهذا السبب ، ستكون الأجسام المضادة الثانوية بشكل أساسي عبارة عن جسم مضاد لـ IgG.

يتم تطوير الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بشكل شائع في الفئران وأحيانًا في الجرذان أو الهامستر أو الأرانب. على سبيل المثال ، إذا كان الجسم المضاد الأساسي أحادي النسيلة هو الفئران IgM ، فقد يرغب المرء في الحصول على جسم مضاد ثانوي يتفاعل مع الفئران IgM (مضاد IgM للفأر).

إذا كان النوع الأساسي أحادي النسيلة هو أحد الفئات الفرعية IgG للماوس ، فيجب أن يرتبط به أي جسم مضاد ثانوي IgG مضاد للفأر تقريبًا. إذا كانت الفئة الفرعية من الجسم المضاد الأساسي غير معروفة ، فيمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر IgG F (ab) نظرًا لأنها تتعرف على معظم الفئات الفرعية للجلوبيولين المناعي للفأر.

هناك العديد من الفئات والفئات الفرعية من IgG (ق) الإنسان والفأر. قد يكون من الصعب اختيار الثانوية. ومع ذلك ، فإن أحد العوامل المشتركة بين هذه (IgG) هي السلاسل الخفيفة (كابا ولامدا). بعبارة أخرى ، تحتوي IgG و IgM و IgA و IgD و IgE إما على سلاسل ضوء كابا أو لامدا. السلسلة الثقيلة ، مع ذلك ، خاصة بفئة معينة.

ملخص لفئات الغلوبولين المناعي والفئات الفرعية:
فئات الغلوبولين المناعي: IgG ، IgM ، IgA ، IgE ، IgD
الفئات الفرعية للجلوبيولين المناعي البشري: IgG1 و IgG2 و IgG3 و IgG4 و IgA1 و IgA2
الفئات الفرعية للجلوبيولين المناعي للماوس: IgG1 ، IgG2a ، IgG2b ، IgG3
سلاسل الضوء: كابا ، لامدا
سلاسل ثقيلة: IgG (جاما) ، IgM (مو) ، IgA (ألفا) ، IgD (دلتا) ، IgE (إبسيلون)

معلومات إضافية عن تفاعلات الجسم المضاد:
متعدد التكافؤ: التفاعل مع جميع الفئات
مكافحة Fc وسلسلة محددة ثقيلة: تتفاعل مع السلاسل الثقيلة فقط لذلك فهي خاصة بفئة معينة.
مضاد فاب وجزيء كامل محدد: التفاعل مع السلاسل الثقيلة والخفيفة. بسبب تفاعل السلسلة الخفيفة ، يمكنهم التفاعل مع جميع الفئات.
سلسلة خفيفة (كابا ، لامدا) محددة: تفاعل مع جميع الفئات ، لأن جميع الفئات تستخدم نفس سلاسل كابا أو لامدا الخفيفة.

هل أستخدم جسم مضاد منقى تقارب أو جزء IgG؟
يفضل معظم الناس الأجسام المضادة الثانوية المعزولة عن الألفة لأنها توفر أقل كمية من الارتباط غير المحدد. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، يمكن اعتبار كسور IgG ، أي عندما يكون مولد الضد المعني نادرًا أو موجودًا بكثرة منخفضة. في هذه الحالات ، تكون الأجسام المضادة عالية التقارب مطلوبة. على سبيل المثال ، أثناء عزل التقارب ، يمكن إزالة بعض الأجسام المضادة عالية التقارب لأنها ترتبط بشدة بمصفوفة التقارب بحيث لا يمكن التخلص منها.

ما نوع الملصق الذي أختاره؟
التسمية تعتمد بشكل كبير على التطبيق. For immunoblotting and ELISA, enzyme-labeled secondary antibodies are the most popular. Peroxidase is economical and a more stable enzyme, in general, than alkaline phosphatase. It has also become very popular for use in chemiluminescent detection systems. Alkaline phosphatase, on the other hand, is considered more sensitive than peroxidase particularly when colorimetric detection is used.

For cell or tissue staining, alkaline phosphatase, peroxidase, or secondary antibodies conjugated to a fluorochrome may be used. Common fluorochromes are FITC, phycoerythrin, CF™ Dyes, Atto Dyes, and Quantum Red. Associated applications are immunocytochemistry/immunofluorescence, flow cytometry, or immunohistochemistry.

To generate increased amplification, a two-step biotin/avidin system may be used. Biotin binds with very high affinity to avidin, resulting in an essentially irreversible interaction. A biotinylated secondary antibody is applied first, then avidin, ExtrAvidin, or streptavidin conjugated to an enzyme or fluorochrome binds to multiple sites on the biotinylated secondary antibody, thus amplifying the signal and resulting in greater sensitivity than that achieved with an antibody-enzyme or antibody-fluorochrome conjugate alone.

When should I use a pre-adsorbed secondary antibody?
Using pre-adsorbed antibodies will reduce non-specific background when working with tissues and cells. The process involves passing the secondary antibody over immobilized serum proteins from potentially cross reactive species. Therefore, if you are working with human tissues, choose a secondary antibody that has been adsorbed with human serum or human IgG.

When is a F(ab) or F(ab')2 fragment antibody necessary?
If working with tissues or cells that have Fc receptors, choose a F(ab) or F(ab')2 fragment when possible to eliminate non-specific binding. In more detail, F(ab')2 antibody fragments are used in assay systems where the presence of the Fc region may cause problems. Samples such as lymph nodes, spleen, and peripheral blood preparations contain cells with Fc receptors (macrophages, B lymphocytes, and natural killer cells), which could bind the Fc region of intact antibodies, causing high background staining. Use of F(ab')2 fragments ensures that any antibody binding observed is not due to Fc receptors.


Be prepared to validate on your own

Even the best characterized antibody that is beloved by the scientific literature and has enriched many a publication isn’t guaranteed to perform in your settings and your hands flawlessly. And you would limit your resources severely if you only consider antibodies validated exactly for your needs. You should always plan to validate an antibody on your own to some extent. Include the appropriate controls in your experiment to analyze the specificity of an antibody in your precise circumstances. A useful guide for very thorough antibody validation has been compiled by Bordeaux and colleagues. An increasing number of journals not only requires detailed information on the antibodies used in a study (such as name, clone, supplier, catalogue and even lot number), but is also encouraging proof of validation. It is in the interest of us all that scientific data generated with the help of antibodies is reliable and reproducible, but ultimately it is the researcher’s responsibility to use proven experimental tools.


شاهد الفيديو: - التخلص من الماء الزائد بالجسم في يومين بدون ادويةاسبابه وعلاجه الفعال والسريع (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Ghislain

    هذا !!

  2. Tohn

    أحب هذا

  3. Kegar

    في هذا الشيء. قبل أن أفكر في خلاف ذلك ، أشكرك كثيرًا على مساعدتك في هذا السؤال.

  4. Kazigrel

    الوحدة هي معيار الحقيقة. S. فيفيكاناندا

  5. O'brian

    انت مخطئ. أنا متأكد. اكتب لي في رئيس الوزراء ، تحدث.

  6. Derian

    السؤال الترفيهي

  7. Daigor

    وماذا هنا سخيف؟

  8. Manfred

    لديك ما تختاره



اكتب رسالة