معلومة

حقن مجهري العضويات المعوية

حقن مجهري العضويات المعوية



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أحاول حقن عضيات معوية دقيقة باستخدام محقن Eppendorf FemtoJet 4i وشعيرات Femtotip الشعرية ، وقد واجهت العديد من المشكلات. هذا إعداد جديد في مختبرنا ، وأنا أول من أحاول ذلك لذا أعتذر عن الأسئلة الأساسية.

عند محاولة ملء الشعيرات الدموية فيمتوتيب باستخدام إبرة أو لطخة غربية ، فإن السائل يتراجع ولا يملأ الشعيرات الدموية ، تاركًا فقاعة هواء كبيرة. هل هذه مشكلة شائعة مع الشعيرات الدموية فيمتوتيب؟ هل توجد طرق أخرى للتعبئة (لا تتطلب أداة تحميل دقيقة متخصصة)؟

عندما حاولت استخدام طرف حيث تركت السائل يسحب إلى الأسفل عن طريق الجاذبية ، واجهت مشاكل في التسرب من طرف القاع. فقط لأكون واضحًا تمامًا ، هل من الضروري ملء الحافة بالكامل بالسائل قبل الحقن (بدون فقاعات هواء)؟

أخيرًا ، سأكون ممتنًا لأي نصيحة بشأن ضغط الحقن والوقت المستخدم مع العضويات.

شكرا لك


لقد وجدت أن استخدام لوادر Femtotip يعطي كتلة مستمرة من السائل ، والتي يمكن بعد ذلك نقلها إلى نهاية الحافة عن طريق الحقن عدة مرات. من الجيد أن يكون هناك هواء فوق السائل عند الطرف.


نماذج معوية بشرية لدراسة التفاعلات بين الأمعاء والميكروبات

Instituto Mexicano del Seguro Social، Unidad de Investigación Médica en Medicina Reproductiva، Unidad Médica de Alta Especialidad en Ginecología y Obstetricia No. 4 'Dr. لويس كاستيلازو أيالا ، Av. Río Magdalena No. 289، Col. Tizapán San ngel، C.P. 01090 Ciudad de México، México

معهد باستور ، وحدة الدراسات البيولوجية ، 25 شارع دو دكتور رو ، 75015 باريس ، فرنسا

معهد باستور ، وحدة الدراسات البيولوجية ، 25 شارع دو دكتور رو ، 75015 باريس ، فرنسا

المركز الوطني للبحوث العلمية ، UMR3691 ، 25 شارع دو دكتور رو ، 75015 باريس ، فرنسا

Institut Pasteur، Unité d'Analyse d'Images Biologiques، 25 Rue du Dr Roux، 75015 Paris، France

المركز الوطني للبحوث العلمية ، ERL9195 ، 25 شارع دو دكتور رو ، 75015 باريس ، فرنسا

Instituto Mexicano del Seguro Social، Unidad de Investigación Médica en Medicina Reproductiva، Unidad Médica de Alta Especialidad en Ginecología y Obstetricia No. 4 'Dr. لويس كاستيلازو أيالا ، Av. Río Magdalena No. 289، Col. Tizapán San ngel، C.P. 01090 Ciudad de México، México

معهد باستور ، وحدة الدراسات البيولوجية ، 25 شارع دو دكتور رو ، 75015 باريس ، فرنسا

Institut Pasteur، Unité d'Analyse d'Images Biologiques، 25 Rue du Dr Roux، 75015 Paris، France

المركز الوطني للبحوث العلمية ، UMR3691 ، 25 شارع دو دكتور رو ، 75015 باريس ، فرنسا

معهد باستور ، وحدة الدراسات البيولوجية ، 25 شارع دو دكتور رو ، 75015 باريس ، فرنسا

المركز الوطني للبحوث العلمية ، ERL9195 ، 25 شارع دو دكتور رو ، 75015 باريس ، فرنسا


تسمية للثقافات المعوية ثلاثية الأبعاد

تم استخدام مصطلح "عضوي" لأول مرة في عام 1987 لوصف الثقافات المختبرية المشتقة من الورم الأرومي العصبي (46) والرئة (134). تم وصف الثقافات المعوية قصيرة المدى لأول مرة بواسطة Evans et al. (25) ، الذي عرّف العضوي المعوي بأنه هيكل من الخبايا والزغابات التي تنمو في المختبر. وصف ساتو وكليفرز الثقافات ثلاثية الأبعاد للخلايا الجذعية المعوية (ISCs) في عام 2009 بأنها "عضويات" واستمرت في الإشارة إلى الثقافات الظهارية البحتة على أنها عضويات (95 أ). في نفس العام ، أبلغ Ootani و Kuo عن ثقافات ثلاثية الأبعاد لشظايا الأمعاء ، والتي أشارا أيضًا إلى عضيات (65). في عام 2012 ، نشر اتحاد الخلايا الجذعية المعوية إرشادات التسميات للتمييز بين أنواع الثقافات المعوية (109). يقترح مؤلفو هذا العمل مصطلح "أورجانيويد" للثقافات التي تحتوي على أنواع متعددة من الخلايا ، بما في ذلك الظهارة واللحمة المتوسطة ، في حين يتم تصنيف ثقافات التجمعات الظهارية النقية على أنها "معوية" أو "كولونويد" ، إذا كانت مشتقة من الأمعاء الدقيقة أو القولون ، على التوالى. كما تم استخدام مصطلح "كروي" للدلالة على الثقافات ثلاثية الأبعاد الظهارية (76). في هذه المراجعة ، يُشار إلى جميع هياكل الأعضاء ثلاثية الأبعاد باسم "عضويات" ، ويتم تصنيفها حسب موقع الأنسجة ، والأنواع ، ونوع الأنسجة (على سبيل المثال ، "أورام القولون العضوي").


مقاربات لتعزيز النضج العضوي

تظهر العضيات نموًا مقيدًا في المختبر حيث يجب أن يعتمدوا على انتشار الأكسجين والمغذيات الخارجية للبقاء على قيد الحياة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من النماذج العضوية المشتقة من hPSC تشبه إلى حد بعيد الأنسجة غير الناضجة وتفشل في النضج بغض النظر عن المدة في الثقافة. ومع ذلك ، فقد أدى زرع أشباه عضويات في مواقع مختلفة في مضيفات الثدييات إلى نضوج عضوي وزيادة وظائف الأنسجة (الشكل 2). تم زرع الأعضاء العضوية على حد سواء تقويميًا (أي في نظير في الجسم الحي الموقع) وخارجيًا (أي في منطقة خارج الموطن الأصلي في الجسم الحي البيئة) وطريقتا الزرع متساهلة للنضج العضوي (Dye et al.، 2016 Finkbeiner et al.، 2015b Sugimoto et al.، 2018 Takebe et al.، 2013 van den Berg et al.، 2018). أثبتت هذه الدراسات أن نماذج أورجانويد قادرة على النضج عند تزويدها بإشارات إضافية من في الجسم الحي البيئة ، وبالتالي زيادة جاذبيتها لدراسة تكوين الأعضاء البشرية واستخدامها كنماذج ما قبل السريرية أو في الطب التجديدي. هنا ، نناقش طرق تحسين التعقيد العضوي والنضج من خلال الزرع في الجسم الحي.

زرع الأعضاء خارج الرحم وتجبير الأعضاء. تم زرع كل من hPSC والأنسجة الأولية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. تمثل الألوان أنواعًا مختلفة من العضيات ، الأولية و / أو المشتقة من hPSC ، التي تم زرعها في المواقع المحددة. زرع تقويم العظام يشير إلى زرع في نظير في الجسم الحي الموقع ، في حين يشير زرع خارج الرحم إلى الزرع في منطقة خارج الموطن الأصلي في الجسم الحي البيئة (أي تحت كبسولات الكلى ، داخل منصات الدهون).

زرع الأعضاء خارج الرحم والعضويات البشرية. تم زرع كل من hPSC والأنسجة الأولية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. تمثل الألوان أنواعًا مختلفة من العضيات ، الأولية و / أو المشتقة من hPSC ، التي تم زرعها في المواقع المحددة. زرع تقويم العظام يشير إلى زرع في نظير في الجسم الحي الموقع ، في حين يشير زرع خارج الرحم إلى الزرع في منطقة خارج الموطن الأصلي في الجسم الحي البيئة (أي تحت كبسولات الكلى ، داخل منصات الدهون).

زرع الأعضاء خارج الرحم

قامت العديد من التجارب بزرع أشباه عضويات في الفئران التي تعاني من نقص المناعة من أجل النضج. عادة ، تم زرع الكائنات العضوية في مواقع ذات أوعية دموية عالية قابلة للتطعيم والنمو العضوي لمدة تصل إلى عدة أشهر ، دون إعاقة وظيفة عضو الفئران الضرورية. تشتمل هذه المواقع على وسادات دهنية من البربخ (Dye et al. ، 2016) وتحت كبسولات الكلى (Finkbeiner et al.، 2015a، b Múnera et al.، 2017 Trisno et al.، 2018 Tsai et al.، 2017 Watson et al.، 2014 وركمان وآخرون ، 2016). في الواقع ، يمكن زيادة تعقيد الثقافات المشتركة الموصوفة سابقًا عن طريق الزرع (Schlieve et al. ، 2017 Takebe et al. ، 2013 Workman et al. ، 2016).

HIOs هي مثال على نموذج عضوي الذي أظهر نضجًا كبيرًا بعد زرع كبسولة الكلى لعدة أسابيع (Finkbeiner et al.، 2015b Watson et al.، 2014). أظهر كل من الظهارة واللحمة المتوسطة من HIOs المزروعة (tHIOs) تنظيمًا محسنًا ، مع ظهور بنية زغبية منقوشة بشكل صحيح داخل الظهارة التي لم تكن ظاهرة قبل الزرع. علاوة على ذلك ، تم تنظيم الأكتين العضلي الأملس (SMA) - ومستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRA) - التي تعبر عن الأنساب الوسيطة بطريقة لا يمكن تمييزها عن الأمعاء البشرية الأصلية (Finkbeiner et al. ، 2015b). دعم الأوعية الدموية عن طريق الأوعية الدموية للفأر نموًا كبيرًا في HIOs المزروعة بحجم يصل إلى 100 ضعف (Watson et al. ، 2014). في الآونة الأخيرة ، تم زرع HIOs بنجاح في المساريق المعوية وأظهرت علامات نمو ونضج مماثلة لتلك المزروعة تحت كبسولة الكلى (Cortez et al. ، 2018 Finkbeiner et al. ، 2015a). وبالتالي فإن المساريق المعوية هي موقع زرع تكميلي قد يكون أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية للدراسات الانتقالية المستقبلية نظرًا لقربها من القناة الهضمية الأصلية.

عضويات الرئة المشتقة من hPSC (HLOs) هي أخرى في المختبر النموذج الذي أظهر تحسين بنية الأنسجة والنضج عند الزرع. ومن المثير للاهتمام ، على عكس العديد من النماذج العضوية الأخرى ، أن HLOs لم تنجو من عملية الزرع تحت كبسولة الكلى (Dye et al. ، 2016). بدلاً من ذلك ، تم استخدام سقالة متعددة المسام من عديد حمض الجليكوليد (PLG) ، والتي تُستخدم عادةً لزرع خلايا بيتا البنكرياس (Gably et al. ، 2011 Hlavaty et al. ، 2014) ، لدعم زرع HLO. كانت سقالة PLG بمثابة مكان مادي لدعم بقاء ونضج HLOs المزروعة ، والتي أظهرت تنظيمًا ظهاريًا محسنًا وتشكلًا وتمايزًا في مجرى الهواء القريب (أي القصبة الهوائية / القصبات الهوائية) التي تشبه إلى حد كبير الممرات الهوائية البشرية القريبة الناضجة من HLOs المزروعة في المختبر. هذه النتيجة تشير إلى أن في الجسم الحي الإشارات مطلوبة ، جنبًا إلى جنب مع السقالة ، لدعم نضج HLO. على الرغم من أن الأنساب السنخية كانت موجودة في في المختبر لم يتم دعم HLOs ، وأنواع الخلايا السنخية والهياكل في HLOs المزروعة (Dye et al. ، 2015 ، 2016). والجدير بالذكر أنه يجب زرع HLOs داخل وسادة الدهون البربخية ، لأن حجرة كبسولة الكلى لم تكن كبيرة بما يكفي لاستيعاب السقالة. على الرغم من الاختلاف في موقع الزرع ، على غرار العضيات المعوية ، فإن HLOs تم توسعتها على نطاق واسع بواسطة الأوعية المضيفة ونضجت المكونات الظهارية واللحمة المتوسطة بعد في الجسم الحي (Dye et al.، 2016 Finkbeiner et al.، 2015b Watson et al.، 2014). أظهرت هذه الدراسة متطلبات مكانة جسدية لدعم البقاء على قيد الحياة والتمايز ونضج HLOs المزروعة.

أظهرت هذه الدراسات أن الأوعية الدموية هي المفتاح لنمو الأنسجة العضوية المزروعة ونموها وبقائها على قيد الحياة ، ولكن قد تكون الأوعية الدموية بطيئة و / أو غير فعالة للأنظمة العضوية التي لا تمتلك الأوعية الدموية قبل الزرع. عضويات برعم الكبد مع خلايا بطانية موجودة مسبقًا (HUVECs) تطعيم وتثبت تدفق الدم في غضون أيام قليلة فقط (Takebe et al. ، 2013). بالإضافة إلى ذلك ، سمح الزرع في نافذة الجمجمة بالتصوير الحي للعضويات وأظهر أن HUVECs شكلت اتصالًا وعائيًا مستقرًا مع المضيف.

تشير البيانات إلى أن معظم النماذج العضوية لا تحتوي بطبيعتها على الأوعية الدموية ، ومع ذلك ، فإن الخلايا الوعائية الداخلية موجودة داخل عضويات الكلى المشتقة من hPSC. من المحتمل أن يكون هذا ناتجًا عن نهج التمايز الموجه ، الذي يدفع hPSCs إلى مصير متوسط ​​للأديم المتوسط ​​، مما يولد سلالات كلوية وكذلك خلايا بطانية (Freedman et al. ، 2015 Takasato et al. ، 2015 ، 2016). بعد الزرع تحت كبسولة الكلى ، أصبحت عضيات الكلى على نطاق واسع من قبل الخلايا البطانية المضيفة والعضوية التي استمرت لمدة أسبوعين على الأقل من الزرع (van den Berg et al. ، 2018). علاوة على ذلك ، فإن استخدام نافذة تصوير البطن يسمح بالتصوير الحي للعضويات طوال عملية الزرع. سمح تسريب ديكستران الفلوري في الدم بتصور تدفق الدم وساعد في إثبات أن الهياكل الكبيبية داخل عضيات الكلى ، والتي تعمل على تصفية البول من الدم ، أصبحت أوعية. أدى ذلك إلى تحسين النضج الكبيبي ، بما في ذلك ترسب الغشاء القاعدي الكبيبي وبطانة نفاذة داخل العضيات المزروعة.

زرع الأعضاء التناسلية

على الرغم من أن زرع الأعضاء خارج الرحم هو أداة قيمة للسماح بنضج العضويات ، إلا أن هناك اهتمامًا بزرع الأعضاء العضدية أو أنواع الخلايا المشتقة من العضويات لتعزيز فهمنا في الجسم الحي المنافذ في تنظيم النضج العضوي ، فضلا عن زيادة القدرة الترجمية للنماذج العضوية لعلاجات استبدال الأعضاء. تم استخدام نماذج الإصابات عبر أنظمة الأعضاء المختلفة لإنشاء منافذ تسمح بالتطعيم العضوي الأولي والمشتق من hPSC في المواقع ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في نماذج الفئران البالغة (Huch et al. ، 2015 Miller et al. ، 2018 Sampaziotis et al. ، 2017 سوجيموتو وآخرون ، 2018). على سبيل المثال ، نجحت الجهود الحديثة في زرع الأعضاء الأولية للقولون المشتق من الأنسجة البشرية في القولون الفأري بعد تعطيل الظهارة الذاتية (Sugimoto et al. ، 2018). هنا ، تم إثبات أن هناك حاجة إلى مساحة كبيرة من الإصابة لإنشاء مكانة كبيرة بما يكفي لتعزيز التطعيم واستمرار الأنسجة البشرية على مدى عدة أشهر. سمحت الإصابات الصغيرة أيضًا بالتطعيم ، ولكن في النهاية فقد الأنسجة البشرية المطعمة بمرور الوقت. كشف تتبع سلالة الخلايا الجذعية المعوية باستخدام جينوم LGR5-CreER الخاص بالخلايا الجذعية المعوية المصممة هندسيًا ومراسل النسب في عضويات القولون البشرية عن اختلافات مهمة خاصة بالأنواع في وقت ركوب الدراجات بين الفئران والخلايا الجذعية القولونية البشرية (Sugimoto et al. ، 2018 ). هذه النظرة الثاقبة في مكانة الخلايا الجذعية المعوية لم تكن ممكنة مع الزراعة خارج الرحم.

تم استخدام طرق مماثلة للإصابة-engraftment لإدخال عضويات سلف برعم الرئة البشرية المشتقة من hPSC إلى رئة فأر بالغ مصاب (Miller et al. ، 2018 Miller et al. ، 2019). يمكن أن تطغى أسلاف طرف برعم الرئة البشرية في القصبة الهوائية والمسالك الهوائية القريبة من رئة الفأر بعد إصابة القصبات الهوائية التي يسببها كيميائيًا. علاوة على ذلك ، أظهرت هذه الخلايا إمكانية تمايز متعدد السلالات في العديد من الأنماط الظاهرية للنسب القريبة بما في ذلك الخلايا المنتجة للمخاط والخلايا الهدبية وخلايا الغدد الصماء العصبية بعد 6 أسابيع بعد الإصابة. والجدير بالذكر أن هؤلاء الأسلاف أظهروا في المختبر قدرات التمايز السنخي ، ولكن لم يتم ملاحظة مثل هذه السلالات ، على الأرجح لأن الخلايا لم تنخرط في المناطق السنخية حيث لم يكن هناك إصابة في نموذج الإصابة هذا. هذه النتيجة تسلط الضوء على أهمية في الجسم الحي المكروية في التمايز بين السلف العضوي الوسيط (Miller et al. ، 2018). أخيرًا ، كانت العضيات الأولية المشتقة من الأنسجة خارج الكبد والمزروعة على السقالات قادرة على الانغماس في ظهارة المرارة والقنوات الصفراوية الشائعة لإنقاذ نماذج الفئران وظيفيًا من إصابة القناة الصفراوية خارج الكبد (Sampaziotis et al. ، 2017).

تم أيضًا زرع عضيات دماغية بشرية مشتقة من hPSC بنجاح في مخ فئران بالغة مع تطعيم عضوي قوي ومعدلات بقاء المضيف ، على الرغم من غزو الإجراء (منصور وآخرون ، 2018). بالمقارنة مع العمر المتطابق في المختبر- عضويات دماغية نامية ، عضويات دماغية مزروعة تحتوي على نسبة أعلى من مصائر الخلايا العصبية الناضجة التي تضمنت الخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن ، مقارنة بالسلائف العصبية غير الناضجة نسبيًا التي لوحظت في المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، تبين أن إسقاطات المحاور العصبية تغزو مناطق مختلفة من الدماغ المضيف ، واقترح تحليل العلامات أن هذه المحاور المشتقة من العضويات البشرية كانت تشكل روابط متشابكة مع الخلايا العصبية الفأرية. أظهرت الدراسات الأولية أن العضيات الدماغية المزروعة استجابت لتحفيز الكالسيوم الخارجي بنمط متزامن يشبه إلى حد كبير الدماغ النامي وليس الناضج. لذلك ، على الرغم من أن هذا كان تقدمًا مثيرًا للإعجاب في العضيات الدماغية ، إلا أن أساليب الزرع الحالية تؤدي إلى نضج جزئي فقط (منصور وآخرون ، 2018). وقد استخلصت الجهود أيضًا عضيات دماغية مع خلايا بطانية من hPSCs التي يمكن زراعتها بشكل مشترك في المختبر لمدة تصل إلى 5 أسابيع وزرعها في مضيف الفئران لمدة أسبوعين على الأقل ، مما يدل على إثبات المبدأ لتوليد الأوعية الدموية البشرية في عضيات الدماغ المزروعة (Pham et al. ، 2018).

بشكل جماعي ، يتيح إنشاء نهج زرع العظام دراسة النضج العضوي داخل البيئة الدقيقة للأنسجة الأصلية ، وفي نفس الوقت يقرب الباحثين خطوة نحو التطبيقات متعدية لتقنيات العضويات. في كل من النهج خارج الرحم والمريض ، كان من الصعب تحديد العوامل الدقيقة في في الجسم الحي البيئة المضيفة المسؤولة عن النضج العضوي. للمضي قدمًا ، سيكون من المهم البدء في معالجة هذه المشكلات في الجسم الحي التفاعلات من أجل تطبيق مبادئ النضج لتكوين أشباه عضويات ناضجة في الطبق. للإجابة على هذه الأسئلة ، يمكن للتجارب المستقبلية أن تولد عضيات من مكتبة CRISPR بالضربة القاضية أو تفحص مكتبة جزيئات صغيرة لتقييم عوامل النضج بشكل مستقل.

نهج الزرع الهندسي لزيادة النضج العضوي

تعد العضيات المعوية مصدرًا واعدًا لاستبدال الأنسجة لحالات مثل متلازمة الأمعاء القصيرة ، ولكن التنفيذ السريري سيتطلب زيادات في الحجم والنضج لإنتاج أنسجة معوية وظيفية. استخدمت إحدى الطرق لمعالجة هذه المشكلة منظمات HIO التي تم زرعها على سقالات لإنتاج الأمعاء الدقيقة المهندسة بالأنسجة (TESI) (Finkbeiner et al.، 2015a). تم بذر HIOs على المصفوفات المعوية من الخنازير اللاخلوية وكذلك السقالات الاصطناعية التي تشتمل على حمض اللاكتيك متعدد الجليكوليك / بولي L (PGA / PLLA). باستخدام هذا النهج ، نجحت HIOs في إعادة زرع المصفوفات اللاخلوية في المختبر لكنها لم تستمر أو تحتفظ بالهوية المعوية عند زرعها في فئران منقوصة المناعة. يمكن أن يكون الأداء الضعيف للمصفوفات اللاخلوية ناتجًا عن إزالة الإشارات الإرشادية أثناء إزالة الخلايا أو انسداد تسلل الأوعية الدموية إلى HIOs بواسطة المصفوفة. ومع ذلك ، ازدهرت HIOs التي تم زرعها على المصفوفات التركيبية في الجسم الحي وأظهرت نضجًا ظهاريًا ، مما أدى إلى ظهور أنسجة تشبه الأمعاء البالغة. هذه السقالات الأنبوبية الشكل هي نهج واعد لبذر العديد من HIOs وتوليد أنسجة معوية أطول وأكثر نضجًا في المختبر. على الرغم من أن TESI الموصوف هنا يفتقر إلى أنواع الخلايا المعوية الرئيسية مثل الجهاز العصبي المعوي ، يمكن التغلب على هذا كما هو موضح أعلاه (Schlieve et al. ، 2017 Workman et al. ، 2016).

نهج أحدث لتوليد أنسجة معوية قابلة للتطوير وناضج من HIOs دمجت سلالة ميكانيكية باستخدام إطالة الينابيع (Poling et al. ، 2018). لقد ثبت أن الإجهاد الميكانيكي يلعب دورًا في نمو الأمعاء (Kurpios et al. ، 2008 Savin et al. ، 2011 Shyer et al. ، 2015 ، 2013) ، وقد تم تصميم أجهزة الإطالة التي تعتمد على الزنبرك أو التمدد كطرق علاجية متلازمة الأمعاء القصيرة (Demehri et al.، 2015، 2014 Ralls et al.، 2012 Rouch et al.، 2016 Stark et al.، 2012 Sueyoshi et al.، 2013). في هذا النهج ، تم زرع HIOs في الفئران منقوصة المناعة لمدة 10 أسابيع. بعد هذا الوقت ، تم إدخال نوابض نيتينول مضغوطة جراحيًا في HIOs المزروعة لمدة 14 يومًا إضافية. أظهرت HIOs المزروعة التي خضعت للإجهاد زيادة في طول الأمعاء وزغابات أكبر وأعمق خبايا وبدا أنها أكثر نضجًا بناءً على التوقيعات الجينية العالمية ، مقارنةً بـ HIOs المزروعة بدون نوابض. تسلط هذه الدراسات الضوء على مناهج الهندسة الحيوية لتعزيز التطبيقات السريرية لـ HIOs وإظهار أهمية كل من الإشارات البيولوجية والميكانيكية في تعزيز النضج العضوي.


حقن مجهري العضويات المعوية - علم الأحياء

يرتبط هذا الرمز بورقة من Hill et al. ، "يحفز الاستعمار البكتيري استجابة فسيولوجية معقدة في ظهارة الأمعاء البشرية غير الناضجة". eLife ، 2017. http://dx.doi.org/10.7554/eLife.29132

القياس في الوقت الحقيقي لنفاذية الحاجز الظهاري في العضيات المعوية البشرية

هيل 1 # ، شا هوانغ 1 ، يو-هواي تساي 1 ، جايسون آر سبنس 1 ، 2 ، فينسينت بي يونغ 1 ، 3 ، 4 ،

1 قسم الطب الباطني ، قسم أمراض الجهاز الهضمي ، جامعة ميشيغان ، آن أربور MI 48109 2 قسم الخلية وبيولوجيا النمو ، جامعة ميشيغان ، آن أربور ، MI 48109 3 قسم الطب الباطني ، قسم الأمراض المعدية ، جامعة ميشيغان ، آن Arbor MI 48109 4 قسم الأحياء الدقيقة والمناعة ، جامعة ميشيغان ، آن أربور MI 48109

# مؤلف المراسلات: David R. Hill ([email protected])

يصف هذا البروتوكول قياس نفاذية الحاجز الظهاري في الوقت الحقيقي بعد العلاج الدوائي في العضيات المعوية البشرية باستخدام الفحص المجهري الفلوريسنت والفحص المجهري للخلية الحية

أدى التقدم في الزراعة ثلاثية الأبعاد للأنسجة المعوية التي تم الحصول عليها من خلال الخزعة أو الناتجة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات عن طريق التمايز الموجه إلى تطورات معقدة في المختبر نماذج من الغشاء المخاطي المعوي. سوف تتطلب الاستفادة من هذه الأنظمة النموذجية الناشئة تكييف الأدوات والتقنيات المطورة لأنظمة الاستزراع ثنائي الأبعاد والحيوانات. هنا ، نصف تقنية لقياس نفاذية الحاجز الظهاري في العضيات المعوية البشرية في الوقت الحقيقي. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحقن المجهري للديكستران المسمى الفلورسنت والتصوير على مجهر مقلوب مزود بمرشحات epifluorescent. يسهل القياس في الوقت الحقيقي لنفاذية الحاجز في العضيات المعوية توليد بيانات زمنية عالية الدقة في الأنسجة الظهارية المعوية البشرية ، على الرغم من أنه يمكن أيضًا تطبيق هذه التقنية على مناهج التصوير ذات النقاط الزمنية الثابتة. هذا البروتوكول قابل للتكيف بسهولة لقياس نفاذية الحاجز الظهاري بعد التعرض لعوامل phamacologic أو المنتجات البكتيرية أو السموم أو الكائنات الحية الدقيقة. مع تعديلات طفيفة ، يمكن أن يعمل هذا البروتوكول أيضًا كأساس عام للحقن المجهري للعضويات المعوية وقد يختار المستخدمون استكمال هذا البروتوكول بتطبيقات إضافية أو بديلة بعد الحقن المجهري.

أ عضويات معوية بشرية مشتقة من الخلايا الجذعية (HIO) محقونة بدقة 2 مجم / مل FITC-dextran (4 كيلو دالتون) مصورة لمدة 20 ساعة. تم حقن HIOs أيضًا مع PBS (التحكم) أو المطثية العسيرة توكسين TcdA (12.8 نانوغرام / ميكرولتر) أو تعامل مع 2 مم EGTA تضاف إلى وسائط الثقافة الخارجية. 4X التكبير. ب قطعة من متوسط ​​شدة FITC الطبيعية بمرور الوقت في HIOs تعامل مع PBS (تحكم) ، TcdA ، أو EGTA. تمثل أشرطة الخطأ S.E.M و N = 4-6 HIOs لكل مجموعة.

هذا البروتوكول موجود على GitHub لسبب ما. ندعوك لطرح الأسئلة وتقديم الاقتراحات والتفاعل مع العلم المقدم هنا. استخدم ميزة "المشكلات" في GitHub لنشر الأسئلة والتعليقات التي تريد إتاحتها للمناقشة العامة. اتصل بالمؤلفين إذا كنت ترغب في إضافتك كمساهم في هذا المستودع. إرسال طلب سحب. أو افترق هذا المستودع وقم بإجراء التغييرات الخاصة بك

نشك في أن غالبية المستخدمين سيرغبون ببساطة في تنزيل نسخة PDF من المخطوطة. أذهب خلفها!

إذا كنت مهتمًا بفهم الأعمال الداخلية للكود لإجراء التحليل وإنشاء الورقة (هل سمعت عن هذا الشيء المسمى "البحث القابل للتكرار"؟) ، فقد ترغب في محاولة استنساخ هذا المستودع على جهاز الكمبيوتر الخاص بك وتجميع الورقة .

لتجميع الورقة من المصدر ، ستحتاج إلى الأدوات التالية:

ثم انتقل إلى النسخة المحلية الخاصة بك من هذا المستودع واكتب ما يلي في موجه الأوامر:

Hill، D.R، Huang، S.، Tsai، Y.H، Spence، J.R، Young، V.B. J. فيس. إكسب. () ، e56960 ، دوى: 10.3791 / 56960 (2017).


فحص العضيات المعوية: قراءة بسيطة للبيولوجيا المعقدة

التهاب الغشاء المخاطي في الفم والأمعاء من الآثار الجانبية المنهكة للعلاج الإشعاعي. نموذج الفأر لالتهاب الغشاء المخاطي الناجم عن الإشعاع يؤدي إلى فقدان الوزن وتلف الأنسجة ، مما يعكس المرض البشري لأنه يستجيب لعامل نمو الخلايا الكيراتينية (KGF) ، وهو العلاج القياسي للرعاية. سمحت العضويات المعوية المستزرعة بتطوير اختبار يراقب تأثير علاجات الظهارة المعوية للضرر الناجم عن الإشعاع. هذا الفحص في المختبر يشبه نموذج الفأر مثل KGF و spondin-1 الخاص بلوحة السقف (RSPO1) المحسّن لاستعادة تشفير أورجانيويد بعد الإشعاع. فحص المركبات التي تم تحديدها زادت من بقاء العضيات بعد الإشعاع. أظهر اختبار هذه المركبات أن العضيات غيرت استجاباتها بمرور الوقت. تم إجراء تحليل غير متحيز للنسخة على ثقافات أورجانية مجفرة في نقاط زمنية مختلفة في الثقافة للتحقيق في هذا السلوك التكيفي. تم العثور على عدد من الجينات والمسارات يمكن تعديلها بمرور الوقت ، مما يوفر الأساس المنطقي للحساسية المتغيرة للمزارع العضوية. يصف هذا التقرير اختبارًا في المختبر يعكس جوانب المرض الذي يصيب الإنسان. تم استخدام الاختبار لتحديد المركبات النشطة بيولوجيًا ، والتي كانت بمثابة تحقيقات لاستجواب بيولوجيا الكائنات العضوية المشفرة عبر الثقافة المطولة. قد تقدم المسارات التي تتغير بمرور الوقت أهدافًا محتملة لعلاج التهاب الغشاء المخاطي.

الكلمات الدالة: KGF RSPO التهاب الغشاء المخاطي الأولي ثلاثي الأبعاد مزارع الخلايا العضيات المعوية الصغيرة.


التقييس لا يزال التحدي الرئيسي ل في المختبر نماذج الالتهاب

كما هو موضح ، ظهرت تطورات هائلة في مجال الخلايا الجذعية والعضوية وإمكانياتها في البحث متعدية ، وحتى الرعاية الصحية ، ومع ذلك ، فإن القيود الحالية على العضيات تظل تحذيرًا مهمًا (الشكل 2 ب).

يتمثل أحد القيود العامة لاشتقاق العضويات في التباين الكبير في الأنماط الظاهرية التي يمكن أن تنتجها. تعتمد أنظمة زراعة الخلايا العضوية والخلايا الجذعية ونتائجها الجزيئية بشكل حاسم على جودة وخصائص الأنسجة المأخوذة. الاختلافات في مرحلة ما قبل المعالجة تتداخل بشكل كبير مع التوقيعات المناعية لهذه العينات. علاوة على ذلك ، من المرجح أن تتعرض الأنسجة الملتهبة لموت الخلايا ، وقد يكون لها احتياجات غذائية وزراعية مختلفة ، وبالتالي فإن معدل استرداد العضيات الحيوية من الأنسجة الملتهبة أقل بشكل ملحوظ (60). في حين التهابات التوقيعات خارج الجسم الحي تشبه بهم في الجسم الحي المنشأ (9) ، وخاصة الأمراض المعقدة مثل عيبد تتميز بتنوع النكهات الالتهابية. علاوة على ذلك ، تعكس الخزعات بيولوجيا المنطقة المأخوذة ، وبالتالي يجب حصاد الخلايا الجذعية / العضيات من مناطق مختلفة. عند استخدام iPSCs ، توجد اختلافات في العضيات اعتمادًا على الخلفية الجينية للفرد وبروتوكول الثقافة المستخدم في المختبر. تم إنشاء خطوط متساوية الجين عبر يمكن لأساليب تحرير الجينات أن تحد من هذا التباين فيما يتعلق بالاختلافات الجينية.

نظرًا لأن العضيات من iPSCs تتشكل من خلال تمايز مجموعة متجانسة ، يجب إنشاء أنواع الخلايا الخاصة بالأنسجة وبيئتها المكروية حديثًا. هذا يتحدى استخدام iPSCs وعلى الرغم من أوجه التشابه الكبيرة في التركيب والوظيفة بين الأنسجة العضدية والأنسجة البالغة ، غالبًا ما تحتفظ العضويات بخصائص غير ناضجة ، مما يجعلها أكثر تشابهًا مع أنسجة الجنين. في مثال على العضوي المعوي المشتق من iPSC ، يمكن حل هذا القيد إما عن طريق الاستزراع المشترك مع الخلايا التائية التي توفر مكانًا أكثر واقعية للنمو (61) ، وهندسة سقالات ثلاثية الأبعاد أكثر تطوراً لتحسين بنية العضويات وبالتالي زيادة التشابه مع النسيج الأصلي في الجسم الحي (62 ، 63) ، أو في الجسم الحي الزرع ، الذي أدى إلى ظهور ظهارة معوية ناضجة مع محاريب خلايا جذعية معوية محفوظة ، وهندسة خفية / زغبية ولحمة متوسطة بشرية مغلفة ، وكلاهما مدعوم بنمو الأوعية الدموية للفأر (64). بصرف النظر عن الخصائص غير الناضجة ، غالبًا ما تُظهر العضيات عمرًا محدودًا بمجرد الوصول إلى حجم معين. بسبب نقص الانتشار ، لا يتم تزويد الخلايا بالعناصر الغذائية الكافية لدعم التطور المستمر. يمكن أن يؤدي استخدام المفاعلات الحيوية إلى تحسين إمداد المغذيات. من الناحية المثالية ، يتم تصميم العضيات نحو تحفيز نمو البطانة مما يؤدي إلى تكوين الأوعية الدموية كما هو موضح مؤخرًا (41). تتمثل الإستراتيجية الأخرى في دمج الخلايا البطانية ، أو أسلافها ، أثناء تطور العضويات ، وتضمين طرق الطباعة الحيوية لتصميم سقالات ثلاثية الأبعاد للخلايا البطانية (65 ، 66). ومع ذلك ، فإن نسيج المادة الأصلي للعضويات المشتقة من iPSC عادة ما يكون غير ملتهب ، على سبيل المثال الخلايا الليفية الجلدية ، وقد تمت إعادة برمجتها واستنباتها لعدة أسابيع إلى شهور في غياب بيئة التهابية. لدراسة الالتهاب المعقد متعدد العوامل ، فإن الأنظمة المشتقة من iPSC ليست الخيار الأول من حيث النموذج. بالعكس ، قد تكون العضيات المشتقة من iPSC أدوات ممتازة لدراسة الاضطرابات الالتهابية التي تحركها العوامل الوراثية بشكل أساسي ، مثل عيبد أحادي المنشأ.

التحدي المهم الآخر هو حجم الجهد والوقت والنفقات التي يتم إنفاقها على الثقافات العضوية. في حين أن البروتوكولات البسيطة إلى حد ما متاحة للثقافات العضوية التقليدية بتكاليف يمكن إدارتها ، فإن بروتوكولات التمايز تشمل إما عوامل باهظة الثمن أو وسائط استزراع أو تتطلب وسائط مكيفة ، والتي يجب إنتاجها بواسطة خطوط الخلايا المغذية. غالبًا ما تشتمل أنظمة الزراعة المشتركة على نماذج ثنائية الأبعاد ، والتي تتطلب جهودًا ووقتًا أكبر في الزراعة. إضافة إلى هذا التحدي ، غالبًا ما يتطلب توليد iPSC وتمايزها إلى أنسجة معينة عدة أسابيع من جهد الزراعة المكثف ، مما يزيد من مخاطر الأحداث الضائرة ، على سبيل المثال تلوث أو تمايز غير مرغوب فيه.

لمكافحة القضايا المذكورة أعلاه ، قد يكون التعاون الوثيق بين البحث الأكاديمي والشركاء الصناعيين ذوي التقنية العالية استراتيجية واعدة للتغلب على تحديات البنية التحتية. في حين أن الأوساط الأكاديمية يمكن أن تقدم أفكارًا مشتقة من المشكلات ورؤية مدفوعة بالفرضية لنماذج مرض جديدة ، يمكن للصناعة توفير التكنولوجيا والقدرات اللازمة للإنتاج على نطاق واسع والتوحيد القياسي. يعد إنشاء هذه البنى التحتية التعاونية أمرًا ضروريًا ويمكن أن يعزز التقدم المستقبلي لتكنولوجيا الخلايا الجذعية.


العضيات المعوية لنمذجة نمو الأمعاء والمرض

أصبحت أمراض الجهاز الهضمي منتشرة بشكل متزايد في البلدان المتقدمة. أعطت الخلايا والنماذج الحيوانية الخالدة نظرة ثاقبة مهمة ولكنها محدودة حول الآليات التي تبدأ وتنشر هذه الأمراض. هناك حاجة ماسة إلى نماذج خاصة بالإنسان لتطور الأمعاء ومرضها يمكنها أن تلخص بنية ووظيفة القناة الهضمية في المختبر. لقد أتاح التقدم في الخلايا الجذعية متعددة القدرات وتقنيات زراعة الأنسجة الأولية إمكانية زراعة الخلايا الظهارية المعوية في ثلاثة أبعاد يتم تجميعها ذاتيًا لتشكيل "عضويات معوية". تسمح هذه العضيات بنماذج جديدة خاصة بالبشر يمكن استخدامها لاكتساب نظرة ثاقبة لأمراض الجهاز الهضمي وربما تقديم علاجات جديدة لمعالجتها. هنا نستعرض الحالي في المختبر نماذج للتطور والأمراض المعوية ، مع الأخذ في الاعتبار أين يمكن إجراء التحسينات والتطبيقات المستقبلية المحتملة في مجالات النمذجة التنموية واختبار العقاقير / السمية والاستخدامات العلاجية.

هذه المقالة جزء من موضوع موضوع "الأنسجة البشرية المصممة: القدوم إلى مختبر قريب منك".

1. هيكل ووظيفة الأمعاء

الأمعاء هي عضو حيوي مشتق من الأديم الباطن ويمكن تقسيمها إلى الأمعاء الدقيقة والغليظة [1]. Collectively, the small and large intestines perform the vital function of digestion, nutrient absorption and waste elimination [2]. The small intestine contains several functionally distinct areas including the duodenum, jejunum and ilium, and its surface comprises a highly folded epithelium of villi, microvilli and intestinal crypts [3]. This intricate folding of villi and microvilli serves to dramatically increase the total surface area of the small intestine, thereby facilitating greater nutrient absorption. The intestinal crypt functions as the niche in which the LGR5 + stem cells reside [4]. LGR5 + cells are relatively slow cycling cells and give rise to a highly proliferative and multipotent progenitor population known as the transit-amplifying (TA) cells, which differentiate as they migrate from the crypt towards the villi. By the time TA cells have moved out of the crypt, they are fully differentiated into one of the many cell types required for normal functionality of the epithelium [5].

The large intestine comprises four main regions: the ascending, transverse, descending and sigmoid colon [6]. While most digestion occurs in the small intestine, the large intestine functions to absorb water and ions, in addition to vitamins and short chain fatty acids (SCFA) synthesized by commensal bacteria. Production of SCFA by commensal bacteria in the large intestine is recognized as an important feature of maintaining normal gut health and has been shown to have several protective effects including creating an environment hostile to pathogenic microbes, providing an energy source for intestinal epithelial cells and enhancing mucus production [7].

2. Cells of the small and large intestine

The intestinal epithelium comprises several different cell types including enterocytes, goblet cells, Paneth cells and enteroendocrine cells, all of which are derived from the resident LGR5 + stem cells found at the base of intestinal crypts [8] (figure 1). Epithelial cells are critical in maintaining immune homeostasis within intestinal tissue, closely regulating the interplay between the intestinal mesenchyme, and commensal and pathogenic bacteria. They maintain a barrier formed with tight junctions, essential to the control of macromolecular transport and immune homeostasis. Enterocytes are the most common cell type found in the epithelium, and they mainly function in nutrient absorption. Secretory epithelial cells consist of Paneth and goblet cells and multiple enteroendocrine cell types, with functions ranging from cytokine to hormone production [9].

Figure 1. Anatomy of the small and large intestine. The small intestine is composed of repetitive villus and crypt structures. LGR5 + stem cells and Paneth cells are located at the base of the crypts, followed by the TA cells, and then mature epithelium composed of goblet cells, enteroendocrine cells and enterocytes (أ). The large intestine lacks the villi structures of the small intestine and instead is composed of colonic crypts. At the base of colonic crypts are LGR5 + stem cells and Reg4 + cells, followed by TA cells and mature epithelium that contains a high proportion of goblet cells (ب).

Goblet cells play a critical role in the functioning and protection of the intestinal tract. There are nearly twice as many goblet cells in the colon as in the small intestine, which is in proportion to the increase in bacteria [10]. Goblet cells function by producing glycoproteins known as mucins, which are vital constituents of the mucus that lines the epithelium. This mucosal layer acts as the first line of defence, preventing the bacteria present in the gut from being in direct contact with the intestinal epithelium [11]. Mucus production is increased in response to inflammatory cytokines including interferon-γ and interleukins-9, -10 and -13 [12]. The glycoproteins that comprise this mucus are toxic to many strains of bacteria. Additionally, this layer acts as a matrix to which defensins and antibodies adhere that target specific pathogenic bacteria adhere. When mucus production is hindered, this can cause commensal bacteria in the gut microbiota to penetrate the epithelial barrier, triggering an immune response [13]. Goblet cells also produce other constituents of the mucus layer, including trefoil factors that stabilize the mucus layer by forming cross-links between different components of the mucus [14]. This cross-linking creates a unique property in that the innermost layer is thicker and more viscous while the outer layer is more aqueous, allowing commensal bacteria to reside there.

The small and large intestine is a high turnover organ, with complete epithelial renewal approximately every 7 days. This process is driven by LGR5 + intestinal stem cells (figure 1أ,ب). The pioneering work of Hans Clevers demonstrated that LGR5 + stem cells reside at the base of the intestinal crypts that form the intestinal stem-cell niche [8,15]. LGR5 + cells are crucial for the continual renewal of the intestinal epithelium and undergo asymmetric division approximately every 24 h, giving rise to a daughter stem cell and a TA cell. These rapidly proliferating TA cells begin in the TA zone and migrate up the intestinal crypt, while dividing four to five times along the way, before terminally differentiating into any of the intestinal cell types [16]. Once differentiated, these cells continue to migrate upwards towards the top of the crypts and have a lifespan of approximately 7 days. Once these cells have reached the top of the villi, they typically undergo anoikis and are shed into the intestinal lumen.

Paneth are also generated from the asymmetrical division of the LGR5 + stem cell [16]. However, instead of migrating upwards, Paneth cells migrate downwards into the base of the crypt. Paneth cells are a longer-lived cell type, surviving for approximately 30 days at the base of intestinal crypts where they play an integral role in producing and maintaining the stem-cell niche [17,18]. In addition to maintaining the niche, Paneth cells secrete a substantial amount of antimicrobrial peptides such as defensins that help regulate intestinal microbiota and protect against invading pathogens.

Paneth cells are absent in the majority of colonic crypts. However, secretory cells expressing typical Paneth cell markers, including CD24 are present. Reg4 has been found to be a reliable marker of these cells, residing adjacent to LGR5 + stem cells in all colonic crypts [19]. These cells have been shown to secrete epidermal growth factor (EGF) and the Notch ligands DII1 and DII4, while LGR5 + stem cells were found to express the corresponding receptors [19]. These secretory Reg4 + cells were found to more closely resemble Paneth cells, rather than goblet cells found in either the small or large intestine. Reg4 + cells are integral to controlling stem-cell positioning in the crypt and for maintaining stemness of LGR5 + colonic stem cells. These cells have many distinct similarities with Paneth cells of the small intestine, with the exception that Reg4 + cells do not produce Wnt ligands, while colonic LGR5 + stem cells do express Wnt receptors [19]. Therefore, mesenchymal tissue surrounding the colonic crypts, known to produce Wnt ligands, may provide the necessary Wnt required for stem-cell maintenance in the intestinal crypt في الجسم الحي [20].

3. Cell signalling in the intestinal epithelium

Self-renewal and differentiation of LGR5 + stem cells are achieved via tight regulation of several signalling pathways within the intestinal crypts. Wnt signalling is considered the central signalling pathway maintaining LGR5 + stem-cell proliferation, controlling cell positioning within the crypt and activating terminal differentiation of Paneth cells. Dysregulation of this pathway has been shown to be important in the development of some colon cancers [21].

Higher concentrations of Wnt3a and EGF are present at the base of the crypts and are required for stem-cell maintenance and proliferation, respectively [22] (figure 2أ). A concentration gradient of Wnt3a is established in the intestinal crypt, with highest levels found in the base of the crypt that then decrease towards the top of the crypt [23]. This concentration gradient along with a decrease in Notch signalling and increased BMP signalling at the top of the crypts facilitates the initial differentiation of the LGR5 + stem cells along with the proliferation and terminal differentiation of the TA cells [24]. Paneth cells are integral in producing the crypt environment via secretion of several factors, including Wnt3a, EGF, transforming growth factor α (TGFα) and the Notch ligand D114 [18].

Figure 2. Regulation of stemness in the intestinal stem-cell niche. During normal maintenance of the stem-cell niche several signalling gradients are established that either promote stemness (Wnt) or differentiation (BMP) (أ). Multiple signal pathway agonists and antagonists are active in the intestinal crypts that are also used during في المختبر culture to simulate the crypt niche environment (ب).

4. Intestinal organoids

The identification of LGR5 + stem cells and the characterization of the intestinal stem-cell niche has led to the development of three-dimensional (3D) organoid cultures and the ability to amplify intestinal epithelium في المختبر. These primary tissue cultures can be maintained long term without any substantial changes to genetic integrity or tissue physiology.

Organoids are now becoming an increasingly popular option for exploring an array of diseases currently lacking suitable treatments. Multiple organoid culture platforms have now been described including liver and pancreatic organoids [25–28], kidney organoids [29], central nervous system organoids [30] and intestinal organoids [31–33]. An organoid is often defined as ‘an في المختبر 3D cellular cluster derived exclusively from primary tissue, ESCs or IPSCs, capable of self-renewal and self-organization, and exhibiting similar organ functionality as the tissue of origin' [34]. Indeed, intestinal organoids are clusters of cells that self-organize in 3D structures that recapitulate major features of their native tissue. Intestinal organoids have been derived from both human stem cells and direct biopsy of adult intestinal tissue. In each case, the resulting intestinal organoids share many features, including a highly folded epithelium structure consisting of crypts and villi similar to native intestinal epithelium. Once embedded in Matrigel™, they self-assemble so that the luminal surface of epithelium is directed towards the centre of the organoid and the basolateral side is in contact with the Matrigel™ and surrounding medium. Analysis of the different cell types present within intestinal organoids has shown that all cell types usually found في الجسم الحي are present, and are therefore useful for studying the complexities of interplay between cell types during homeostasis and disease states.

Intestinal organoids have been shown to exhibit the same functions as those that occur في الجسم الحي, including mucus production, and absorptive and secretory functions [24]. Intestinal organoids mimic في الجسم الحي epithelial regenerative capacity, with apoptotic cells being continually released into the lumen of the organoid as new cells are differentiated from the LGR5 + cells within the crypts to replenish the epithelium.

5. Isolation and culture of intestinal organoids

There are two approaches to creating intestinal organoids: either through isolation of intestinal crypts from patient donors or via في المختبر differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hIPSCs). Both methods result in organoids comprising all intestinal epithelial cell types found في الجسم الحي, in similar proportions and arrangements.

Culture conditions for both primary tissue and stem-cell-derived organoids are essentially the same, requiring a basal media comprising Advanced DMEM/F12, supplemented with N2 and B27, nicotinamide and ن-acetylcysteine. To the basal medium additional growth factors are added to support the growth of the organoids including EGF, Noggin and gastrin, which are essential for regulation of gut mucosal growth and proliferation of intestinal epithelial cells. The presence of Wnt3a is crucial to regulate self-renewal, proliferation and differentiation, as expression of LGR5 in stem cells found in intestinal crypts is dependent upon the canonical Wnt signalling pathway, regulated by R-Spondin-1 and BMP4 inhibition by Noggin [35,36] (figure 2ب).

Intestinal crypts can be isolated from intestinal biopsies during endoscopy or surgical resection [18,37] (figure 3). Crypts are manually dissected from the epithelium and embedded into a Matrigel™ containing Wnt, R-Spondin, EGF and Noggin. Once Matrigel™ has solidified and encapsulated the isolated crypts, the Matrigel™ is overlaid with tissue culture medium containing all additives and growth factors. Over the course of 7–10 days intestinal crypts elongate and expand to form the first organoid structures, which can then be manually dissociated and expanded. In addition to LGR5 + stem cells, mature enteroids and colonoids comprised enterocytes, enteroendocrine cells, goblets cells and Paneth cells.

Figure 3. Schematic of human intestinal organoid creation. Intestinal organoids can be generated directly from intestinal biopsy or tissue from surgical resection. Isolated crypts can be placed directly into 3D Matrigel™ cultures along with Wnt, Noggin, EGF and R-Spondin to establish stable cell lines. An alternative approach to generating patient-specific intestinal organoids requires a skin biopsy, isolation and amplification of skin fibroblasts. Skin fibroblasts can then be reprogrammed to hIPSCs using the Yamanaka factors and differentiated into endoermal cells and finally, intestinal epithelium before long-term culture in 3D Matrigel™ conditions.

Using a stem-cell-based approach, hESCs or hIPSCs can be differentiated following normal developmental stages to generate intestinal epithelium (figure 3). This includes differentiation of cells via the major developmental milestones of definitive endoderm, hindgut endoderm and intestinal progenitor cell stages. Once differentiated into sufficiently committed intestinal progenitor cells, they can be transitioned from what is normally a two-dimensional (2D) differentiation platform into the 3D organoid platform, where cells then spontaneously rearrange themselves into intestinal organoids.

6. Functional analysis of organoids

A variety of assays have been used to assess functionality of intestinal organoids. A primary function of enterocytes is transport of water and electrolytes across the intestinal barrier. في المختبر, organoids have been shown to maintain this function via derivation of organoids lacking the apical transporters SGLT-1 or PEPT1. These organoids were shown to have inhibited d -glucose, d -fructose and peptide transport across the epithelial membrane, validating their potential use as a model of nutrient and drug transport mechanisms [38].

Permeability of the intestinal epithelium is an important factor in both health and disease, affecting the diffusion of small molecules across the intestinal barrier and preventing bacterial translocation via the bloodstream. Recently, it has been demonstrated that intestinal organoids can be used to model epithelial permeability and changes can be recorded in real time [39]. تلة وآخرون. [39] demonstrated this technique by injecting fluorescently labelled dextran into the lumen of organoids while automated microscopy was used to capture, in real time, live cells and quantify breaks in the luminal surface. Using this technique, alterations to intestinal permeability can be studied under chronic inflammatory conditions and during bacterial invasions.

Forskolin-induced organoid swelling assay has also been used to demonstrate functionality of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ion channel. Organoids with a functional CFTR swell in response to forskolin treatment, while any changes to the function of CFTR due to inhibition or genetic mutation can be detected due to lack of swelling [40]. This assay has the potential to be adapted to a drug-screening platform for cystic fibrosis (CF).

7. Applications of organoid technology

Owing to its differing physiology and distinct functions, the gastrointestinal tract is affected by an array of disorders. The intestinal epithelium is continuously exposed to antigens from commensal bacteria and consumed food, hence it has an extensive immune system, inclusive of adjacent lymphoid tissue, heavily populated with lymphocytes. The mucosa is the main site at which the immunological functions take place however, loss of this carefully maintained immune homeostasis can cause chronic inflammation and multiple disorders. Intestinal organoids have now become increasingly popular as a platform to model many intestinal diseases caused by chronic inflammation or physical injury.

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic, progressive and relapsing disease affecting the entire gastrointestinal tract. It is a result of dysregulated innate and adaptive immune responses against antigens present in the gastrointestinal tract. IBD is categorized into two main subtypes: ulcerative colitis (UC), which is restricted to the colon, and Crohn's disease (CD), which can affect any area of the digestive tract [41]. During active IBD, the small and large intestine can become highly inflamed, leading to destruction of the epithelium and deterioration in digestive capacity. Intestinal organoids derived from IBD patients present an opportunity to understand how innate immunity is regulated in IBD patients and to identify novel therapeutics to reduce the severity of the disease.

Short bowel syndrome (SBS) develops often due to partial resection of large intestine as a result of IBD, colorectal cancer (CRC) or ischaemic disease, or can be present at birth. Owing to a significantly reduced surface area of the intestinal epithelium, malabsorption and malnutrition are major issues. Congenital SBS has a genetic basis linked with the CLMP gene. Patient-derived small intestinal organoids offer a chance to study the genetic susceptibility in greater detail, including the molecular mechanisms involved in impaired intestinal elongation during development that are currently not well understood [42]. Furthermore, the combination of intestinal organoids with tissue-engineering techniques for the lengthening of the small intestine, offer a potential method for the restoration of normal functioning of the bowel irrespective of the cause of SBS.

Coeliac disease is an example of an autoimmune disease mainly affecting the small intestine upon consumption of gluten. The resulting inflammation causes malabsorption, leading to a range of other successive symptoms. Without exclusion of all gluten products from the diet, prolonged inflammation can lead to osteoporosis and cancer. Organoids cultured from patients suffering from coeliac disease can offer insight into genetic predispositions and mechanisms driving the disease forward. Alterations to intestinal barrier integrity, which are known to occur in coeliac patients, can be explored using organoids [43]. Similarly, patient-derived organoids could be used as a drug-screening platform for the identification of novel therapies.

Diverticular disease occurs typically in the sigmoid colon and is the result of physical damage to the intestines leading to loss of function. Diverticula are sacs that form from the herniation of the intestinal epithelium, erupting through the surrounding muscular layer. They are suspected to form due to excessive pressure throughout the large intestine, due, in part, to a low-fibre diet, however, aetiology remains largely unknown. These diverticula can become infected and inflamed, leading to the patient developing fever, pain, nausea and diarrhoea. A genetic element is suspected that predisposes individuals to developing diverticulitis. Therefore, genetic factors involved in the pathogenesis of diverticulitis can be studied using patient tissue-derived organoids from a relatively non-invasive intestinal biopsy. These can then be compared to healthy intestinal tissue to determine genetic and functional differences. Owing to the mechanical nature of the development of diverticular disease, mechanical stress could be applied to the individual organoids to examine the response of the intestinal epithelium under differing levels of stretch stress. However, a tissue-engineering approach is required in combination with organoid technology to model the development of diverticula. Intestinal organoids alone would not be suitable to model diverticula development due to the involvement of the mesenchyme and muscular layer surrounding the intestinal epithelium in vivo.

Cystic fibrosis is perhaps best known for its effect in the lung but also causes complications in other organs, including the pancreas and intestines. The most serious acute complication of the intestine in CF is obstruction of the terminal ileum or proximal large intestine, which if untreated can result in rupture and sepsis. Intestinal organoids are a suitable model of CF due to their expression of CFTR and by using a combination of forskolin-induced swelling and voltage-gate measurements, fluid and ion transport can be accurately measured. This assay has been performed on human intestinal organoids, demonstrating physiologically accurate CFTR function [44]. Drug responsiveness can, therefore, be measured using the current organoid model to identify the most effective treatment for CF or as a diagnostic tool [45].

CRCs are among the most commonly diagnosed cancers in the developed world. There are many contributing factors to development of CRC, but importantly long-term CD or UC significantly increases lifetime risk. Organoids are increasingly being used as models of CRC. Current models of CRC are unable to reproduce the progression of the disease at the early stages and are not representative of the heterogeneous nature of tumours. Genome-editing techniques, such as CRISPR/Cas9, however, can be used as a means to introduce genetic mutations into genes of interest. Following genetic manipulation organoids can then be transplanted into mice, in which the في الجسم الحي mechanisms of tumour progression and invasion can be measured [46].

8. Host–pathogen interactions

Different methods are employed to expose intestinal organoids to bacteria. Microinjection of live bacteria or bacterial proteins is a common approach to study intestinal infections, including السالمونيلا و المطثية العسيرة الالتهابات. For example, Forbester وآخرون. [31] used hIPSCs to generate intestinal organoids that were then microinjected with Salmonella. mRNA sequencing was used to create a global profile of changes in gene expression in response to السالمونيلا infection [31]. Similarly, Leslie وآخرون. [35] used a microinjection methodology to deliver C. صعب into the lumen of hIPSC-derived intestinal organoids. They then observed that C. صعب remained in the lumen for a prolonged duration, suggesting that organoids possess suitable conditions for the survival of C. صعب and hence other obligate anaerobes. Microinjection of C. صعب toxins has also been shown to exhibit expected effects on epithelial integrity and changes to the expression of certain tight junctions [35].

9. Limitations of organoids

Despite increasing interest in organoid platforms to model intestinal development and disease, organoids used in today's research lack certain elements of the complete organ found في الجسم الحي (الجدول 1). This includes a lack of mesenchymal tissue, immune and neural cells that في الجسم الحي contribute to the overall structure and functioning of the intestines. Organoids currently used in research are comprised mainly of epithelium, including the niche that enables self-renewal of intestinal stem cells.

Table 1. Advantages and disadvantages for the use of intestinal organoids in the study of disease.

Organoids differentiated from induced pluripotent stem cells (IPSCs) into intestinal epithelial structures are known as induced intestinal organoids [47]. The differentiation protocols promoting the generation of such organoids also generates mesenchyme that, when transplanted under the renal capsule of mice, differentiate into smooth muscle and myofibroblasts [24]. These, therefore, are more representative of the intestines في الجسم الحي. However, they require a longer period of time to generate and are still devoid of immune cells which are necessary to address the most common intestinal disease IBD.

Other limitations of intestinal organoid include practical limitations due to the fact that cells must be embedded in Matrigel™ and grown in 3D. This creates additional complications when manipulating cells for simple procedures such as isolating mRNA, DNA and performing immuncytochemistry because organoids will require removal from Matrigel™ prior to processing. 3D culture also creates problems when attempting genetic manipulation via transfection and CRISPR/Cas9 gene editing approaches. Again, cells require removal of Matrigel™ prior to manipulation, which can create suboptimal conditions for organoid maintenance and growth.

It is clear that intestinal organoids can be used as an effective model of host–pathogen interactions that occur within the intestinal tract. However, further study is required to incorporate additional immune elements into the model to give a more complete illustration of inflammatory response. Thus far, microinjection has been used effectively to deliver the bacteria into the lumen of the organoid. However, this is a time-consuming technique. Therefore, other techniques have been trialled as more efficient alternatives. Treating a monolayer, for example, is much quicker to execute, however, this method is less indicative of how the 3D في الجسم الحي intestine would respond due to the lack of 3D architecture and the stem-cell niche. Without this native architecture it cannot be determined how intestinal stem cells would respond to such an infection.

10. Future challenges

Intestinal organoids remain a promising, tunable model for developmental and disease modelling, drug and toxicity testing, and host–pathogen interaction studies. In the future, in conjunction with CRISPR/Cas9 technology intestinal organoids hold great potential for gene therapy and transplantation applications in humans to treat chronic inflammatory disorders, such as CD, UC and CRCs. However, there are many aspects of this technology that still require significant investment to create a model that is more representative of في الجسم الحي tissue and their translational use in humans to become a reality.

Culturing intestinal organoids in 3D creates additional layers of complexity when attempting manipulations involving gene editing, transfection or when studies require access to the apical surface of intestinal epithelium. Previously, processing organoids has required specialized and time-consuming procedures such as the use of micromanipulator and microinjection platforms. More recently, several studies have addressed this problem and have begun developing methodologies to use 2D culture of dissociated intestinal organoids as a platform for high-throughput drug testing, migration assays and host–pathogen interaction studies. By using transwells with permeable membranes, experimentation can be performed with ease of access to both the apical and basolateral sides of the newly formed epithelial membrane [24]. However, this approach also disrupts the stem-cell compartment, meaning that using current culture conditions cells cannot be propagated long term using this 2D culture approach. It is feasible, however, to maintain organoids in 3D while performing manipulations in transient 2D cultures.

Current organoid platforms require the spontaneous self-assembly of epithelial tissue following dissociation and then embedding in Matrigel™. This approach creates organoids of differing shapes and sizes that lack the gross anatomical features of the intestine. Accuracy in developmental and disease modelling will be dramatically enhanced by the use of 3D scaffolds constructed from either decellularization and then recellularization of an خارج الجسم الحي extracellular matrix or a cellularized synthetic scaffold. This approach offers a base on which to culture the cells into the tubular structure with more precise patterning of epithelium and consistent numbers of cells. This technique is potentially tunable, enabling the cell composition to be altered depending on the region of intestinal tract being studied or disease process being modelled. This model, as well as being a closer approximation of the intestine, is likely to be easier to manipulate by providing easier access to apical and basolateral sides of cells. Studies carried out into the development of this model have shown that it can accumulate a mucus layer on the luminal surface, as with organoids, with a thickness of 20 µm [48]. This can, therefore, recapitulate the host–pathogen interactions, occurring في الجسم الحي, that require an intact mucosal layer. So far, these models lack neural and immune cells to form a complete organ and require many months of set-up until the platform is suitable for experimental use. A notable disadvantage to this system is the deterioration in the model after only a few weeks following the seeding of cells to the 3D scaffold, which could be due to nutrient and oxygen starvation of cells, further reinforcing the need for models that recapitulate the complete organ including vascularization. This, therefore, must be overcome before it can be used for longer-term studies, including that of chronic inflammation.

Several studies have demonstrated the potential for direct transplantation of intestinal organoids into mice and rodents [32,49]. Fordham وآخرون. successfully transplanted fetal intestinal progenitors, which had not yet been differentiated into intestinal organoids, into a colonic injury mouse model [32]. They found that immature enterospheres have regenerative capacity when transplanted into adult damaged colonic epithelium. Additionally, they demonstrated the ability of these immature cells to mature في الجسم الحي, appropriate for the region of engraftment, expressing Mucin-2-positive goblet cells and lacking markers of small intestine. Whether the same approach could be used to treat human intestinal injury from both acute and chronic IBD is yet to be determined. When combined with decellularization/recellularization techniques, 3D printing and development of synthetic and biodegradable scaffold technologies, stem-cell-derived intestinal tissue or patient-derived intestinal tissue could be used to replace large segments of the small and large intestine.

One of the more significant drawbacks to modelling disease using intestinal organoids is the absence of an immune element that can be used to understand mechanisms driving the autoimmune destruction of the intestinal mucosa that occurs during CD and UC في الجسم الحي. Thus far, intestinal organoids have been able to model the immune response at an innate level, determining the effects of gene expression and cytokine signalling in the development of CD and in host–pathogen interaction studies. CD is known to be triggered by a combination of genetic susceptibility and environmental factors, resulting in dysregulation of immune homeostasis. Studies have shown that human intestinal organoids generated from hIPSCs are a suitable model for studying the interactions between intestinal epithelium and the enteric pathogen السالمونيلا تيفيموريوم to dissect elements of the innate immune response [31]. The model, however, needs to be further developed to include elements of systemic immune regulation including cells such as macrophages, neutrophils, T cells, B lymphocytes, NK cells and dendritic cells. Addition of these cell types will create a more complete model but will be a significant challenge requiring all cell types to be from the same donor.

Intestinal organoids, whether derived from primary tissue biopsy or stem-cell differentiation techniques, have great potential in the future of disease modelling, drug discovery and personalized medicine. They have been shown to have stable phenotype, are relatively simple to create and manipulate while at the same time able to be maintained in long-term culture. However, current organoid derivation and culture techniques do not allow for the assembly of complex multi-cell-type organoids that can model the complete complexity of a multifactoral disease such as IBD. Furthermore, as our need to modify and manipulate organoids and organoid culture conditions advances, the practice of culturing intestinal organoids may pose technical limitations on what is achievable. Developing our understanding of the initiation and development of complex intestinal disease, such as IBD and CRC, will require continued investment and research into the development of more complex intestinal organoid platforms.


الملخص

Oral and intestinal mucositis is a debilitating, often dose limiting side effect of radiation treatment. A mouse model of mucositis, induced by gamma irradiation, leads to weight loss and tissue damage, similar to that observed in patients. This model reflects the human ailment as it responds to keratinocyte growth factor (KGF), the standard of care treatment.
Culturing of intestinal crypt organoids derived from primary cells allowed the development of a 3D assay to monitor the effect of treatments of intestinal epithelium to radiation-induced damage. This in vitro assay closely resembles the mouse model as KGF and Roof Plate-Specific Spondin-1 (RSPO1) enhanced the recovery of crypt organoids following radiation. Screening identified tool compounds that increased the survival of organoids post radiation. Repeated testing of these compounds revealed that the organoids changed their response over time. To investigate this adaptive behavior, intestinal organoid cultures were studied over time. Samples of organoids at various time points were used to prepare mRNA for unbiased transcriptome analyses. This expression profiling revealed a number of genes and pathways that were modulated over time, providing a rationale for the altered sensitivity of the intestinal crypt organoid cultures.
This report describes the development of an in vitro assay that reflects the response of disease to therapeutic treatment. The assay was miniaturized and used to identify bioactive tool compounds, which served as probes to interrogate the patho-physiology of organoids over prolonged culture conditions. In vitro disease models based on primary 3D cell cultures represent valuable tools to identify potential drug targets and bioactive hits.


الانتماءات

Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard University, Cambridge, MA, USA

Benjamin E. Mead & Jeffrey M. Karp

Institute for Medical Engineering and Science (IMES), Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Department of Chemistry, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Ragon Institute of Massachusetts General Hospital, Massachusetts Institute of Technology and Harvard University, Cambridge, MA, USA

Engineering in Medicine, Department of Medicine, Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Harvard−Massachusetts Institute of Technology Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA


شاهد الفيديو: شاهد. عملية حقن الحيوان المنوي داخل البويضة وماهى هى علامات نحاج عملية الحقن المجهري (أغسطس 2022).