معلومة

7.19D: تنظيم نشاط عامل سيجما - علم الأحياء

7.19D: تنظيم نشاط عامل سيجما - علم الأحياء



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أهداف التعلم

  • تحليل تنظيم تنشيط عامل سيجما

عوامل سيجما هي بروتينات تعمل في بدء النسخ. على وجه التحديد ، في البكتيريا ، تكون عوامل سيجما ضرورية للتعرف على بوليميراز الحمض النووي الريبي في موقع المروج الجيني. يسمح عامل سيجما لبوليميراز الحمض النووي الريبي بالارتباط بشكل صحيح بموقع المروج وبدء النسخ الذي سينتج عنه إنتاج جزيء مرنا. يختلف نوع عامل سيجما المستخدم في هذه العملية ويعتمد على الجين والبيئة الخلوية. تتميز عوامل سيجما التي تم تحديدها حتى الآن بناءً على الوزن الجزيئي وأظهرت تنوعًا بين الأنواع البكتيرية أيضًا. بمجرد اكتمال دور عامل سيجما ، يترك البروتين المركب وسيستمر بوليميريز الحمض النووي الريبي في النسخ.

يعد تنظيم نشاط عامل سيجما أمرًا بالغ الأهمية وضروريًا لضمان البدء السليم في النسخ. يتم التحكم في نشاط عوامل سيجما داخل الخلية بعدة طرق. يتم التحكم في توليف عامل سيجما على مستوى كل من النسخ والترجمة. في كثير من الأحيان ، يعتمد تعبير أو نشاط عامل سيجما على تحولات طور نمو معينة للكائن الحي. إذا كان نسخ الجينات المشاركة في النمو ضروريًا ، فسيتم ترجمة عوامل سيجما للسماح ببدء النسخ. ومع ذلك ، إذا لم يكن نسخ الجينات مطلوبًا ، فلن تكون عوامل سيجما نشطة.

في حالات محددة عندما يحتاج نشاط النسخ إلى منعه ، هناك عوامل مضادة للسيجما تؤدي هذه الوظيفة. سوف ترتبط العوامل المضادة لـ سيجما ببوليميراز الحمض النووي الريبي وتمنع ارتباطها بعوامل سيجما الموجودة في موقع المروج. عوامل مكافحة سيجما هي المسؤولة عن تنظيم تثبيط نشاط النسخ في الكائنات الحية التي تتطلب عامل سيجما لبدء النسخ السليم.

النقاط الرئيسية

  • تعمل بروتينات عامل سيجما على تعزيز ارتباط بوليميريز الحمض النووي الريبي بمواقع المحفز داخل تسلسل الحمض النووي للسماح ببدء النسخ.
  • عوامل سيجما خاصة بالجين وتتأثر بالبيئة الخلوية.
  • يمكن لعوامل سيجما أن تنظم على مستوى النسخ والترجمة.
  • العوامل المضادة للسيغما هي المسؤولة عن تثبيط وظيفة عامل سيجما وبالتالي تثبيط النسخ.

الشروط الاساسية

  • تحولات مرحلة النمو: المراحل المختلفة المطلوبة لنمو البكتيريا تشمل: مراحل التأخر ، والمراحل الأسية ، والمراحل الثابتة.

SIG1 ، عامل سيجما لبوليميراز الحمض النووي الريبي الكلوروبلاست ، يرتبط بشكل مختلف بمناطق الحمض النووي المتعددة في كروموسومات البلاستيدات الخضراء في الجسم الحي

500-600 نقطة أساس في المتوسط). بعد ذلك ، يتم إجراء الترسيب المناعي بجسم مضاد معين لتنقية البروتين المعني ، جنبًا إلى جنب مع الحمض النووي المستهدف المتقاطع. أخيرًا ، تتم إزالة الروابط المتقاطعة بالمعالجة الحرارية ، ويتم تنقية الحمض النووي. وبالتالي ، يمكن إثراء المناطق الجينومية المرتبطة بالبروتين محل الاهتمام في لحظة الارتباط المتبادل للفورمالديهايد على وجه التحديد. أخيرًا ، يمكن قياس مستويات المناطق الجينومية المنقاة بواسطة PCR الكمي (qPCR) وتحليل إشاراتها كنسبة مئوية من الانتعاش مقابل كمية إدخال الحمض النووي.


مسارات متعددة لتنظيم استقرار sigmaS (RpoS) في الإشريكية القولونية من خلال عمل عدة محولات مضادة

يتم تنظيم SigmaS ، عامل سيجما المرحلة الثابتة للإشريكية القولونية والسالمونيلا ، على مستويات متعددة. بروتين سيغماس غير مستقر أثناء النمو الأسي ويستقر خلال المرحلة الثابتة وبعد علاجات الإجهاد المختلفة. يتطلب التدهور كلاً من البروتياز ClpXP والمحول RssB. يتم تصنيع بروتين IraP الصغير المضاد للكابت استجابة لتجويع الفوسفات ويتفاعل مع RssB ، مما يتسبب في استقرار sigmaS في ظل حالة الإجهاد هذه. يعتبر IraP ضروريًا لتحقيق استقرار sigmaS في بعض وليس كل حالات الجوع ، مما يشير إلى وجود بروتينات أخرى مضادة للمحول. نُبلغ هنا عن تحديد المنظمين الجدد لاستقرار سيجماز ، المهم في ظل ظروف الإجهاد الأخرى. IraM (مثبط نشاط RssB أثناء تجويع المغنيسيوم) و IraD (مثبط نشاط RssB بعد تلف الحمض النووي) يمنع تحلل البروتينات sigmaS في كل من الجسم الحي وفي المختبر. تكشف نتائجنا أن العديد من البروتينات المضادة للمحول تسمح بتنظيم استقرار سيجما من خلال تنظيم نشاط RssB في ظل مجموعة متنوعة من ظروف الإجهاد.


التنظيم العالمي لعائلة الجينات السوطية التي تعتمد على سيجما 54 في Caulobacter crescentus بواسطة المنشط النسخي FlbD.

يتطلب التخليق الحيوي للجلد القطبي Caulobacter crescentus التعبير عن عدد كبير من الجينات السوطية (fla) التي يتم تنظيمها في تسلسل هرمي تنظيمي من أربع فئات (من الأول إلى الرابع). يتم تحديد توقيت التعبير الجيني fla في دورة الخلية من خلال الأشكال المتخصصة من بوليميريز RNA وظهور و / أو تنشيط البروتينات التنظيمية. نحن هنا نُبلغ عن تحقيق في دور البروتين التنظيمي للنسخة C. crescentus FlbD في تنشيط جينات sigma 54 المعتمدة من الفئة الثالثة والفئة IV من التسلسل الهرمي عن طريق إعادة تكوين النسخ من هؤلاء المروجين في المختبر. توضح نتائجنا أن النسخ من مروجي جينات الفئة الثالثة flbG و flgF و flgI والجين الرابع fliK بواسطة Escherichia coli E sigma 54 يتم تنشيطه بواسطة FlbD أو البروتين الطافر FlbDS140F (حيث يشير S140F إلى طفرة S-to-F في الموضع 140) ، والذي نعرضه هنا لديه إمكانية أعلى لتنشيط النسخ. أظهرت الدراسات المختبرية لمحفز flbG سابقًا أن التنشيط النسخي بواسطة بروتين FlbD يتطلب عناصر تسلسل ftr (ftr لتنظيم النسخ السوطي). لقد حددنا الآن تسلسلات ftr المتعددة التي يتم حفظها في كل من العمارة التسلسلية والمكانية في جميع المروجين من الفئة III والفئة IV المعروفة. يتم وضع عناصر ftr التي تم تحديدها حديثًا في كاليفورنيا. 100 نقطة أساس من مواقع بدء النسخ لكل مروج جيني fla يعتمد على سيجما 54 ، وتشير دراساتنا إلى أنها تلعب دورًا مهمًا في التحكم في مستويات النسخ من مختلف المروجين من الفئة الثالثة والفئة الرابعة. لقد استخدمنا أيضًا تحليل الطفرات لإظهار أن تسلسل ftr مطلوبة للتنشيط الكامل بواسطة بروتين FlbD في المختبر وفي الجسم الحي. وبالتالي ، تشير نتائجنا إلى أن FlbD ، المشفر بواسطة جين flbD من الدرجة الثانية ، هو منظم عالمي ينشط النسخ المنظم لدورة الخلية من جميع المروجين المعتمدين على سيجما 54 في التسلسل الهرمي للجينات C. crescentus fla.


تنظيم نشاط عامل سيجما

عامل سيجما هو المسؤول عن بدء النسخ بشكل صحيح.

أهداف التعلم

تحليل تنظيم تنشيط عامل سيجما

الماخذ الرئيسية

النقاط الرئيسية

  • تعمل بروتينات عامل سيجما على تعزيز ارتباط بوليميريز الحمض النووي الريبي بمواقع المحفز داخل تسلسل الحمض النووي للسماح ببدء النسخ.
  • عوامل سيجما خاصة بالجين وتتأثر بالبيئة الخلوية.
  • يمكن لعوامل سيجما أن تنظم على مستوى النسخ والترجمة.
  • العوامل المضادة للسيغما هي المسؤولة عن تثبيط وظيفة عامل سيجما وبالتالي تثبيط النسخ.

الشروط الاساسية

  • تحولات مرحلة النمو: المراحل المختلفة المطلوبة لنمو البكتيريا تشمل: مراحل التأخر ، والمراحل الأسية ، والمراحل الثابتة.

عوامل سيجما هي بروتينات تعمل في بدء النسخ. على وجه التحديد ، في البكتيريا ، تكون عوامل سيجما ضرورية للتعرف على بوليميراز الحمض النووي الريبي في موقع المروج الجيني. يسمح عامل سيجما لـ RNA polymerase بالارتباط بشكل صحيح بموقع المروج وبدء النسخ الذي سينتج عنه إنتاج جزيء mRNA. يختلف نوع عامل سيجما المستخدم في هذه العملية ويعتمد على الجين والبيئة الخلوية. تتميز عوامل سيجما التي تم تحديدها حتى الآن بناءً على الوزن الجزيئي وأظهرت تنوعًا بين الأنواع البكتيرية أيضًا. بمجرد اكتمال دور عامل سيجما ، يترك البروتين المركب وسيستمر بوليميريز الحمض النووي الريبي في النسخ.

عامل سيجما SigR: هيكل عامل سيجما.

يعد تنظيم نشاط عامل سيجما أمرًا بالغ الأهمية وضروريًا لضمان البدء السليم في النسخ. يتم التحكم في نشاط عوامل سيجما داخل الخلية بعدة طرق. يتم التحكم في توليف عامل سيجما على مستوى كل من النسخ والترجمة. في كثير من الأحيان ، يعتمد تعبير أو نشاط عامل سيجما على تحولات طور نمو معينة للكائن الحي. إذا كان نسخ الجينات المشاركة في النمو ضروريًا ، فسيتم ترجمة عوامل سيجما للسماح ببدء النسخ. ومع ذلك ، إذا لم يكن نسخ الجينات مطلوبًا ، فلن تكون عوامل سيجما نشطة.

في حالات محددة عندما يحتاج نشاط النسخ إلى منعه ، هناك عوامل مضادة للسيجما تؤدي هذه الوظيفة. سوف ترتبط العوامل المضادة لـ سيجما ببوليميراز الحمض النووي الريبي وتمنع ارتباطها بعوامل سيجما الموجودة في موقع المروج. عوامل مكافحة سيجما هي المسؤولة عن تنظيم تثبيط نشاط النسخ في الكائنات الحية التي تتطلب عامل سيجما لبدء النسخ السليم.


وظيفة عوامل سيجما البلاستيد في النباتات العليا: تنظيم التعبير الجيني أم مجرد الحفاظ على النسخ التأسيسي؟

التعبير الجيني البلاستيد معقد نوعًا ما. يتم إجراء النسخ بواسطة ثلاثة أنواع مختلفة من بوليمرات الحمض النووي الريبي ، اثنتان منها مشفرة بالنواة ، أحادية النواة ، من نوع الملتهمة (تسمى RPOTp و RPOTmp) وأحدها مشفر بلاستيد ، متعدد الوحدات ، من النوع eubacterial (يُسمى PEP) . يتم تنظيم نشاط بوليميريز الحمض النووي الريبي من النوع eubacterial من خلال ما يصل إلى ستة عوامل بدء نسخ مشفر النواة من نوع سيغما. هذا التعقيد في جهاز النسخ البلاستيد لم يتم فهمه جيدًا بعد ويثير التساؤل عما إذا كان خاضعًا لأي تنظيم أو يضمن فقط النسخ التأسيسي لجينوم البلاستيد. من ناحية أخرى ، تم إحراز تقدم كبير خلال السنوات الماضية يوضح دور عوامل سيجما للتعرف على المروج المحدد والنسخ المختار لبعض جينات البلاستيد. تم تحديد البروتينات المتفاعلة مع Sigma وتم الكشف عن التغيرات الوظيفية المعتمدة على الفسفرة لعوامل سيجما. تهدف المراجعة الحالية إلى تلخيص هذه التطورات الحديثة وإقناع القارئ بأن التعبير الجيني البلاستيد يتم تنظيمه على مستوى النسخ من خلال عمل عامل سيجما.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


المقالات الموصى بها (6)

هندسة حمض خيمريك مستقر α-amylase-glucoamylase (Amy-Glu) من أجل تسكر النشا بخطوة واحدة

لتكسير النشا في خطوة واحدة ، تم إنشاء محفز حيوي كيميري (Amy-Glu) من α-amylase (با جي تي ايمي) من عصية حمضية و glucoamylase (غلو) جين الرشاشيات النيجر. من أجل الانضمام إلى إنزيمين ، تم استخدام ببتيد رابط مكون من 25 حمضًا أمينيًا. خيمري ايمي جلو تم التعبير عنها في بكتريا قولونية. تبلغ قيمة Glu 75 كيلو دالتون ، بينما تبلغ قيمة Amy-Glu 145 كيلو دالتون. عرض كل من Amy-Glu و Glu ملف تعريف pH مماثل مع نشاط جيد في نطاق الأس الهيدروجيني الحمضي مثل نطاق Ba-Gt-amy مع درجة الحموضة 4.0. أظهرت جميع الإنزيمات الثلاثة (Ba-Gt-amy و Amy-Glu و glucoamylase) نشاطًا في نطاق درجة الحرارة بين 40 و 70 درجة مئوية مع الحد الأمثل عند 60 درجة مئوية. Amy-Glu و Glu لديهما T.1/2 90 و 70 دقيقة عند 60 و 70 درجة مئوية ، على التوالي. يعتبر حرف Kم، الخامسالأعلى وكقط قيم Glu (النشا القابل للذوبان) هي 0.34 مجم مل -1 ، 606 ميكرولجر مجم -1 دقيقة -1 و 727 ثانية -1 ، بينما بالنسبة لـ Amy-Glu هي 0.84 مجم مل -1 ، 13886 ميكرولتر ملغ -1 دقيقة -1 و 4.2 × 10 4 ث -1 ، على التوالي. اقترح تحليل المنتج النهائي أن Amy-Glu تحتفظ بنشاط كل من الإنزيمات الأبوية وتشكل مالتوديكسترين جنبًا إلى جنب مع الجلوكوز كمنتجات رئيسية. تقوم Amy-Glu بتكسير نشا القمح والذرة بكفاءة أكبر من Ba-Gt-amy و glucoamylase.

رسم خرائط جينات تحلل الأترازين والفينول في الزائفة ص. EGD-AKN5

تعتبر العزلات البكتيرية ذات القدرات التحلل المتعددة الركائز مرشحة جيدة للمعالجة الحيوية للمنافذ البيئية. عزل معمل الزائفة ص. تم العثور على EGD-AKN5 لتحلل الأترازين والبنزوات والفينول والتولوين والكاتيكول بمعدل 1.88 ± 0.01 و 16.5 ± 1.37 و 9.08 ± 2.20 و 3.86 ± 0.11 و 3.3 ± 0.29 مجم لتر -1 ساعة على التوالي. أظهر مشروع تحليل تسلسل الجينوم وجود مسار تحلل كامل للأترازين والفينول. أشارت نتائج الشرح الجيني إلى أن الأترازين يتحلل عبر مسار الكلوروهيدولاز مع atzجينات A / B / C / D / E / F ، بينما تم تحويل الفينول إلى الكاتيكول عبر هيدروكسيلاز الفينول متعدد المكونات من مسار phc. كانت الجينات من مسار ortho مسؤولة عن مزيد من التحلل البيولوجي للكاتيكول نتيجة تم تأكيدها بواسطة فحوصات الإنزيم. تم تطبيق نموذج لوصف النمو والتحلل الحيوي للأترازين والفينول والمركبات ذات الصلة وتناسبها مع سلسلة من تجارب التحلل الهوائي. كشفت الدراسات الحركية أن EGD-AKN5 أظهر إمكانية تحلل كل من الفينول والأترازين في وقت واحد باستخدام الفينول كمصدر للكربون والأترازين كمصدر للنيتروجين. أشارت دراسات التعبير الجيني إلى مرحلة تأخر أطول للتعبير عن الجينات من مسار تحلل الأترازين ، عند مقارنتها بالتعبير عن تحلل الفينول والكاتيكول.

تعمل الأحماض العضوية منخفضة الوزن الجزيئي على تعزيز إطلاق بقايا الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات في التربة

يعد فهم إطلاق وتوافر المخلفات المقيدة للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAHs) في منطقة الجذور أمرًا ضروريًا عند تقييم مصيرها ومخاطرها في بيئة التربة. ومع ذلك ، تتوفر معلومات محدودة فيما يتعلق بتأثير الأحماض العضوية منخفضة الوزن الجزيئي التي يتم إفرازها من الجذور (LMWOAs) على إطلاق بقايا الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات المقيدة في التربة. كان الهدف من هذه الدراسة هو التحقيق في تأثير LMWOA على إطلاق بقايا الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات المرتبطة بالتربة. ان ن- تم استخدام إجراء استخراج البوتانول لتقييم إطلاق مخلفات الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات المرتبطة بالتربة. يمكن أن تعزز LMWOAs بشكل كبير إطلاق بقايا الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات المقيدة وتعزز قابلية استخراج الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات وتوافرها في التربة. أدت إضافة LMWOAs إلى زيادة كبيرة في التركيزات القابلة للاستخراج لـ ΣPAH وكل فرد من الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات في التربة التي تحتوي على بقايا الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات المقيدة بطريقة تعتمد على تركيز LMWOA. بالمقارنة مع معالجات الشاهد دون إضافة LMWOA ، كانت تركيزات ΣPAH القابل للاستخراج من البوتانول وكل من الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات في التربة بعد إضافة 10-100 مليمول / كغ LMWOAs 54-745٪ و 58-605٪ أكبر بعد 40 و 80 يومًا ، على التوالي . ينتج حامض الستريك دائمًا أكبر إطلاق للهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات من بقايا الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات المرتبطة بالتربة ، بينما ينتج حمض الماليك أقل إطلاق من بين الثلاثة LMWOAs التي تم اختبارها. توفر نتائج هذا العمل معلومات مهمة بشأن مصير مخلفات الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات المقيدة في بيئة التربة ، وستكون مفيدة لتقييم مخاطر التربة الملوثة بالهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات ووضع استراتيجيات علاجية للمواقع الملوثة.

توفر بنية البروتين والمخلفات الأساسية في حلزونات α غير الملفوفة رؤى لوظيفة النقل في مصنع AtCHX17

استخدام نبات الأرابيدوبسيس thaliana AtCHX17 كمثال ، نحن نجمع بين النمذجة الهيكلية والطفرات لتوفير رؤى حول بنية البروتين ووظيفة النقل التي تتميز بشكل سيء. يعتمد هذا النهج على ملاحظة أن هياكل البروتين يتم الحفاظ عليها بشكل ملحوظ في التطور أكثر من التسلسلات الخطية ، وأن التشابه الميكانيكي بين ناقلات متنوعة آخذة في الظهور. تم الحصول على نموذجين متماثلين من AtCHX17 يظهران طية بروتينية مشابهة للتركيبات المعروفة لمضادات البكتيريا Na + / H + ، EcNhaA و TtNapA. سلطت نماذج البنية الثانوية والثالثية المتميزة الضوء على المخلفات في المواضع التي يحتمل أن تكون مهمة لنشاط CHX17. أظهر الطفرات أن الأسباراجين- N200 والأسبارتات- D201 داخل الغشاء الغشائي 5 (TM5) ، والليسين- K355 داخل TM10 ضروريان لنشاط AtCHX17. لقد كشفنا عن ثريونين- T170 و ليسين- K383 غير معترف بهما سابقًا كمخلفات رئيسية في المناطق غير الملتفة في منتصف حلزونات TM4 و TM11 α ، على التوالي. أدى تحور الجلوتامات E111 الموجود بالقرب من سطح الغشاء إلى تثبيط نشاط AtCHX17 ، مما يشير إلى دور في استشعار الأس الهيدروجيني. يحتوي الذيل الكربوكسيل الطويل ذو الغرض غير المعروف على هيكل ثانوي بديل للصفائح و α-helix يتم حفظه في بروتينات الإجهاد العالمية بدائيات النواة. تدعم هذه النتائج البنية العامة لـ AtCHX17 وتحديد D201 و N200 والمخلفات الجديدة T170 و K383 في النواة الوظيفية التي من المحتمل أن تشارك في التعرف على الأيونات والتنسيق و / أو الانتقال ، على غرار مبادلات الكاتيون / H + المميزة. يتجه جوهر نماذج AtCHX17 وفقًا لقوالب EcNhaA و TtNapA إلى الداخل والخارج ، على التوالي ، مما قد يعكس حالتين توافقيتين لوضع نقل الوصول المتناوب للبروتينات التي تنتمي إلى عائلة CHX النباتية.

دور التفاعل بين منظم استشعار النصاب VqsR و الزائفة إشارة الكينولون في التوسط في تحمل الكاربابينيم الزائفة الزنجارية

الزائفة الزنجارية ينسق استجابته للظروف البيئية من خلال تفعيل نظام استشعار النصاب (QS). في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في التفاعل التنظيمي بين منظم النسخ QS VqsR و الزائفة إشارة الكينولون (PQS) من خلال تكامل عامل سيجما RpoS ، وتناولنا ما إذا كان يمكن أن يُعزى أحد المسارات التي تتحكم في تحمل الكاربابينيم إلى VqsR. نظهر ذلك vqsR التعبير على مستوى النسخ ينظمه pqs, pqsR، و pqs. تقييم التعبير النصي ل vqsR, أنا, rhl، و qscR في Δpqs و ΔpqsΔrpoS المسوخ نظرة ثاقبة pqs- و rpoS- تنظيم مستقل vqsR و vqsRالجينات الخاضعة للرقابة. مكمل خارجي PQS عكس التعبير عن vqsR و vqsRالجينات الخاضعة للرقابة في Δpqs متحولة إلى مستويات من النوع البري ، لكنها فشلت في زيادة مستويات التعبير عن أنا و qscR في ΔpqsΔrpoS متحولة إلى المستويات التي لوحظت في النوع البري PAO1. ΔvqsR المتحولة أظهرت انخفاضًا في معدل البقاء على قيد الحياة عند تحدي الكاربابينيمات مقارنةً بالنوع البري PAO1. مقدمة من أ pqs طفرة في ΔvqsR متحولة ألغت تمامًا النمط الظاهري الحساس للكاربابينيم.

نستنتج أن هناك رابطًا تنظيميًا بين PQS و vqsR موجود ، وأن RpoS مهم في تفاعلهم. نوضح أيضًا أن VqsR يؤثر على تحمل الكاربابينيم.


مقدمة

الريكتسيات هي بكتيريا سالبة الجرام تنتقل إلى الإنسان عن طريق نواقل المفصليات. وفقًا لنوع المرض الذي تسببه بالإضافة إلى سماتها المستضدية والوراثية ، فإن ريكتسيا تم تقسيم الجنس إلى مجموعتين رئيسيتين ، مجموعة الحمى المبقعة ومجموعة التيفوس (Raoult and Roux ، 1997). نظرًا لأن الريكتسيات تتميز بموقع داخل الخلايا بشكل صارم والذي منعت دراستهم التفصيلية لفترة طويلة ، فإن الآليات الجزيئية المشاركة في إمراضها لا تزال غير مفهومة جيدًا. على الرغم من الجهود العديدة (Wood and Azad، 2000، Rachek et al.، 2000، Renesto et al.، 2002، Qin et al.، 2004) ، لا تزال الأدوات الموثوقة للتلاعب الجيني مفقودة. في الآونة الأخيرة ، تم تحقيق تسلسل العديد من الجينوم الريكتسي (بلان وآخرون ، 2007) ، مما يوفر دعمًا مفيدًا للدراسات التي تهدف إلى معرفة أفضل بهذه الكائنات الحية الدقيقة.

يتيح توافر تسلسل الجينوم الريكتسي إجراء تحقيقات واسعة النطاق بما في ذلك التجارب القائمة على المصفوفات الدقيقة للحمض النووي. يعد هذا التطبيق الوظيفي لما بعد الجينوم مفيدًا جدًا لفهم كيفية تكيف مسببات الأمراض مع بيئتها وقد قدم بعض الأفكار حول الاستراتيجيات المسببة للأمراض التي أظهرتها العديد من الكائنات الحية الدقيقة أثناء العملية المعدية (Boyce et al. ، 2004 ، Jansen and Yu ، 2006). ومع ذلك ، فإن التنميط الجيني للتعبير الجيني القائم على ميكروأري الحمض النووي لدراسة العدوى البكتيرية قد أعاقته العديد من التحديات (Hinton et al. ، 2004). على عكس mRNAs حقيقية النواة ، فإن mRNAs البكتيرية خالية من ذيول poly-A ولديها نصف عمر مخفض يقدر بحوالي 15 دقيقة من أجل الريكتسيا prowazekii (Winkler ، 1995) ، مما يجعل عزلهم صعبًا. عند البدء من الخلايا المصابة حقيقية النواة ، كما هو الحال عند دراسة البكتيريا الملزمة داخل الخلايا ، يكون الحصول على mRNAs بدائية النواة عالية الجودة أكثر صعوبة (Hinton et al. ، 2004). يمكن ضمان استقرار الرنا المرسال عن طريق الاستخراج المشترك للأحماض النووية حقيقية النواة وبدائية النواة ، كما يتم إجراؤها عادةً لمقايسات RT-PCR. لذلك ، نظرًا لأن الحمض النووي الريبي حقيقي النواة يمكن أن يتنافس مع الحمض النووي الريبي البكتيري أثناء تخليق الحمض النووي الريبي (cDNA) ووضع العلامات على الفلوروكروم ، يجب إزالته من هذه العينات للنجاح في تهجين المصفوفات الدقيقة (Belland et al. ، 2003 ، Di Cello et al. ، 2005). إلى جانب الجودة ، هناك قيد رئيسي آخر في تفاعلات وضع العلامات والتهجين وهو انخفاض كمية الحمض النووي الريبي المتاح (Hinton et al. ، 2004). على حد علمنا ، فإن التحليل الترانسكريبتومي العالمي الدقيق الوحيد للبكتيريا الملزمة داخل الخلايا التي تتحايل على كل من تلوث الحمض النووي الريبي حقيقية النواة والكمية المنخفضة من القالب ، كان هو ذلك الذي وصفه بيلاند وآخرون. (2003). تطبيق استراتيجيتهم المتدثرة الحثرية ، جمعت إزالة الحمض النووي الريبي حقيقية النواة من إجمالي الحمض النووي الريبي متبوعة بخطوة تضخيم (كدنا) مع مجموعة كاملة من قليل النوكليوتيدات المصممة خصيصًا لهذا الكائن الدقيق. تم تحديد طريقة تضخيم أخرى غير متحيزة تعتمد على استخدام البادئات العشوائية مؤخرًا وثبت أنها متوافقة حتى مع الكائنات الحية الدقيقة الغنية بـ AT (Francois et al. ، 2007).

هنا ، تم التحقيق في إستراتيجية جديدة تجمع بين إزالة الملوثات حقيقية النواة مع التضخيم العشوائي اللاحق لـ cDNA (فرانسوا وآخرون ، 2007) باعتبارها أفضل فرصة لتحقيق تحليل نسبي قائم على المصفوفات الدقيقة للريكتسيات.. يتجلى صعوبة الحصول على إنتاجية عالية وجودة RNA من هذه البكتيريا داخل الخلايا الملزمة في نقص البيانات المنشورة المتعلقة بتحليل النسخ العالمي. في حين R. prowazekii تم إنشاء المصفوفات الدقيقة للحمض النووي بالكامل ، ولم يتم الإبلاغ إلا عن تجارب تهجين الحمض النووي (Ge et al. ، 2004).

تم تنفيذ العمل المقدم في هذه الورقة باستخدام ريكتسيا كونوري، العامل المسبب لحمى البحر الأبيض المتوسط ​​المنقطة التي تنتقل إلى الإنسان عن طريق Rhipicephalus الدم، القراد البني (Raoult and Roux ، 1997). لتقييم كل من جدوى ودقة النهج المقترح في مراقبة التغييرات النسخية للكساح بواسطة المصفوفات الدقيقة ، تعرضت البكتيريا لضغط المغذيات. من التجارب المستندة إلى RT-PCR ، لاحظنا أنه في ظل هذه الظروف ، ر.كونوري لا يخضع لبعض التعديلات على النسخ (Rovery et al. ، 2005a ، Rovery et al. ، 2005b). مصفوفة ميكروأري صغيرة تتكون من عدد محدود من الأهداف ، بما في ذلك ر.كونوري تم إنشاء ORFs التي تم العثور عليها سابقًا بأعلى أو لأسفل. أهداف أخرى ، بما في ذلك عوامل النسخ ، المرافقون أو فيرب الجينات ، عرضة لتحسين بقاء البكتيريا خلال فترات الجوع الطويلة. نظرًا لتنظيمهم المفترض ، فقد تم تضخيمهم ورصدهم أيضًا على المصفوفة الدقيقة الخاصة بنا. تم التحقق من صحة الجينات المعبر عنها تفاضليًا التي تم تحديدها من خلال التجارب المستندة إلى ميكروأري ، مما يضمن أن البروتوكول المقترح الذي يجمع بين إزالة الملوثات حقيقية النواة وتضخيم الحمض النووي الريبي البكتيري المنقى يحافظ على محتوى المعلومات للعينات الأصلية.


مراجعة المادة

  • Institut f & # x000FCr Biochemie und Biotechnologie، Martin-Luther-Universit & # x000E4t Halle-Wittenberg، Halle (Saale)، Germany

بعد أربعين عامًا من الاكتشاف الأولي لفسفرة البروتين المعتمدة على الضوء في نظام غشاء الثايلاكويد ، بدأنا الآن في فهم دور شبكات فسفرة البلاستيدات الخضراء في وظيفتها لفك تشفير المعلومات والتوسط فيها حول الحالة الأيضية للعضية للتكيفات طويلة المدى في التعبير الجيني البلاستيد والنووي. بمساعدة علم الوراثة وأدوات الجينوم الوظيفية ، تم تحديد كينازات البلاستيدات الخضراء وعدة مئات من البروتينات الفوسفورية التي تنتظر الآن توصيفًا وظيفيًا مفصلاً. يتم فهم التنظيم وطيف البروتين المستهدف لبعض الكينازات ، ولكن هذه المعلومات مجزأة فيما يتعلق بالكيناز والحديث المتبادل للبروتين المستهدف في بيئة متغيرة. في هذه المراجعة ، سنسلط الضوء على أحدث التطورات في هذا المجال ونناقش الأساليب التي قد تؤدي إلى فهم شامل لتكامل إشارة البلاستيد عن طريق فسفرة البروتين.


مراجع

Silhavy ، T. J. ، Kahne ، D. & amp Walker ، S. غلاف الخلية البكتيرية. كولد سبرينج حرب. وجهة نظر. بيول. 2، a000414 (2010). يقدم هذا العمل مراجعة شاملة لهيكل الغلاف البكتيري.

Raetz ، C. R. & amp Whitfield ، C. الذيفان الداخلي لعديد السكاريد الدهني. Annu. القس Biochem. 71, 635–700 (2002).

نيكايدو ، H. الأساس الجزيئي لنفاذية الغشاء الخارجي البكتيري تمت إعادة النظر فيه. ميكروبيول. مول. بيول. القس. 67, 593–656 (2003).

Li، X.-Z.، Plésiat، P. & amp Nikaido، H. التحدي المتمثل في مقاومة المضادات الحيوية بوساطة التدفق في البكتيريا سالبة الجرام. كلين. ميكروبيول. القس. 28, 337–418 (2015).

Navarro Llorens، J.M، Tormo، A. & amp Martinez-Garcia، E. المرحلة الثابتة في البكتيريا سالبة الجرام. FEMS ميكروبيول. القس. 34, 476–495 (2010).

روجاس ، إي آر وآخرون. الغشاء الخارجي هو عنصر أساسي محمل للبكتيريا سالبة الجرام. طبيعة سجية 559, 617–621 (2018). توضح هذه الدراسة أن الغشاء الخارجي يلعب دورًا كبيرًا في السلامة الجسدية للخلية ، وهو دور يُعتقد تقليديًا أنه لا يقوم به إلا الببتيدوغليكان..

Berry، J.، Rajaure، M.، Pang، T. & amp Young، R. مجمع السبانين ضروري لتحلل لامدا. J. باكتيريول. 194, 5667–5674 (2012).

Flores-Kim، J. & amp Darwin، A.J. استجابة بروتين الصدمة العاثية. Annu. القس ميكروبيول. 70, 83–101 (2016).

Wall، E.، Majdalani، N. & amp Gottesman، S. السلسلة التنظيمية المعقدة لـ Rcs. Annu. القس ميكروبيول. 72, 111–139 (2018).

Raivio، T.L. كل شيء قديم أصبح جديدًا مرة أخرى: تحديث للبحث الحالي حول استجابة ضغط غلاف Cpx. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1843, 1529–1541 (2014).

Grabowicz، M. & amp Silhavy، T.J. استجابات الضغط المغلف: شبكة أمان مترابطة. اتجاهات Biochem. علوم. 42, 232–242 (2017).

Raivio ، T. L. استجابات الإجهاد المغلف والتسبب الجرثومي سالب الجرام. مول. ميكروبيول. 56, 1119–1128 (2005).

بوجليانو ، K. J. & amp Beckwith ، J. The Cs ثانية المسوخ الإشريكية القولونية تعكس الحساسية الباردة لتصدير البروتين نفسه. علم الوراثة 133, 763–773 (1993).

وانج ، ج. الحركية المعقدة لطي البروتين في نطاقات درجة حرارة واسعة. بيوفيز. ج. 87, 2164–2171 (2004).

Sinensky، M. تكيف متماثل اللزوجة - عملية استتبابية تنظم لزوجة دهون الغشاء في الإشريكية القولونية. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 71, 522–525 (1974).

Laminet ، A. A. ، Ziegelhoffer ، T. ، Georgopoulos ، C. & amp Pluckthun ، A. The الإشريكية القولونية تعدل بروتينات الصدمة الحرارية GroEL و GroES طي سلائف بيتا لاكتاماز. EMBO J. 9, 2315–2319 (1990).

تشارلسون ، E. S. ، Werner ، J.N & amp Misra ، R. التأثيرات التفاضلية لـ yfgL طفرة على الإشريكية القولونية بروتينات الغشاء الخارجي وعديد السكاريد الدهني. J. باكتيريول. 188, 7186–7194 (2006).

Konovalova، A.، Schwalm، J.A & amp Silhavy، T.JA Suppressor mutation الذي يخلق استجابة أسرع وأكثر قوة للضغط على غلاف σ E. J. باكتيريول. 198, 2345–2351 (2016). تحدد هذه الدراسة طفرة في σ ه الذي يسبب تحريض أسرع لـ σ ه استجابة وقمع عيوب التكوين الحيوي OMP.

Wood، J.M. الاستجابات البكتيرية للتحديات التناضحية. J. الجنرال فيزيول. 145, 381–388 (2015).

Arts ، I. S. ، Gennaris ، A. & amp Collet ، J.-F. تقليل الأنظمة التي تحمي غلاف الخلية البكتيرية من التلف التأكسدي. FEBS ليت. 589, 1559–1568 (2015).

Leonardi، R. & amp Jackowski، S. التخليق الحيوي لحمض البانتوثنيك وأنزيم أ. EcoSal Plus https://doi.org/10.1128/ecosalplus.3.6.3.4 (2007).

Zientz، E.، Dandekar، T. & amp Gross، R. الترابط الأيضي للبكتيريا الملزمة داخل الخلايا ومضيفيها من الحشرات. ميكروبيول. مول. بيول. القس. 68, 745–770 (2004).

Price، C.E & amp Driessen، A. J.M. التكاثر الحيوي للمجمعات التنفسية المرتبطة بالغشاء في الإشريكية القولونية. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1803, 748–766 (2010).

مارفن ، H. J. ، Ter Beest ، M. B. & amp Witholt ، B. تحرير شظايا الغشاء الخارجي من النوع البري الإشريكية القولونية ومن عدة بكتريا قولونية طفرات عديدات السكاريد الدهنية بواسطة EDTA وعلاجات الصدمة الحرارية. J. باكتيريول. 171, 5262–5267 (1989).

Kershaw، C.J.، Brown، N.L، Constantinidou، C.، Patel، M.D & amp Hobman، J.L. ملف تعريف التعبير عن الإشريكية القولونية K-12 استجابة لتركيزات النحاس الدنيا والمثلى والزائدة. علم الاحياء المجهري 151, 1187–1198 (2005).

Wang، D. & amp Fierke، C.A The BaeSR regulon متورط في الدفاع ضد سمية الزنك في بكتريا قولونية. علم المعادن 5, 372–383 (2013).

Laubacher، M.E & amp Ades، S. E. إن Rcs phosphorelay هو استجابة إجهاد مغلف الخلية يتم تنشيطه بواسطة إجهاد الببتيدوغليكان ويساهم في مقاومة المضادات الحيوية الذاتية. J. باكتيريول. 190, 2065–2074 (2008).

Farris، C.، Sanowar، S.، Bader، M.W، Pfuetzner، R. & amp Miller، S. I. تقوم الببتيدات المضادة للميكروبات بتنشيط Rcs regulon من خلال البروتين الدهني الغشائي الخارجي RcsF. J. باكتيريول. 192, 4894–4903 (2010).

van Stelten، J.، Silva، F.، Belin، D. & amp Silhavy، T. J. علم 325, 753–756 (2009).

Hibbing ، M.E ، Fuqua ، C. ، Parsek ، M.R & amp Peterson ، S.B. المنافسة البكتيرية: البقاء على قيد الحياة والازدهار في الغابة الميكروبية. نات. القس ميكروبيول. 8, 15–25 (2010).

Hancock، R.E W. & amp Diamond، G. دور الببتيدات الكاتيونية المضادة للميكروبات في دفاعات المضيف الفطرية. اتجاهات ميكروبيول. 8, 402–410 (2000).

Merritt، M. E. & amp Donaldson، J.R. تأثير الأملاح الصفراوية على الحمض النووي وسلامة الأغشية للبكتيريا المعوية. جيه ميد. ميكروبيول. 58, 1533–1541 (2009).

Guest، R. L. & amp Raivio، T. L. دور استجابة إجهاد الغلاف سالب الجرام في وجود عوامل مضادة للميكروبات. اتجاهات ميكروبيول. 24, 377–390 (2016).

موهلر ، ك. & إبا ، إم. الإخلاص الانتقالي وسوء الترجمة في الاستجابة الخلوية للإجهاد. نات. ميكروبيول. 2, 17117 (2017).

Morra، R. et al. ينظم إجهاد الترجمة بشكل إيجابي إفراز البروتينات السيتوبلازمية المعتمد على MscL. مبيو 9، e02118–17 (2018). توضح هذه الدراسة أن الإفراط في التعبير عن البروتين أو المضادات الحيوية التي تثبط استطالة الترجمة تسبب إفراز البروتين الشاذ بطريقة تعتمد على قناة بروتين كبيرة حساسة ميكانيكيًا تشارك في الحماية من الصدمة التناضحية.

Grabowicz ، M. & amp Silhavy ، T. J. إعادة تعريف مسار الاتجار الأساسي للبروتينات الدهنية للأغشية الخارجية. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 114, 4769–4774 (2017).

Konovalova، A.، Mitchell، A. M. & amp Silhavy، T.J. يراقب مركب البروتين الدهني / بيتا برميل تكامل عديد السكاريد الدهني في تحويل المعلومات عبر الغشاء الخارجي. eLife 5، e15276 (2016).

Danese ، P. N. et al. يحفز تراكم البكتريا المعوية المشتركة الدهنية الدهنية الوسيطة التخليقية الحيوية درجة النسخ في الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 180, 5875–5884 (1998).

جرجس ، H. S. ، Liu ، Y. ، Ryu ، W. S. & amp Tavazoie ، S. A. التوصيف الجيني الشامل للحركة البكتيرية. بلوس جينيت. 3، e154 (2007).

Walsh، N. P.، Alba، B. M.، Bose، B.، Gross، C.A & amp Sauer، R. T. زنزانة 113, 61–71 (2003).

Mecsas، J.، Rouviere، P. E.، Erickson، J.W، Donohue، T.J & amp Gross، C. A. نشاط سيجما إي ، وهو الإشريكية القولونية عامل سيغما المحرض بالحرارة ، يتم تعديله عن طريق التعبير عن بروتينات الغشاء الخارجي. تطوير الجينات. 7, 2618–2628 (1993).

Lima ، S. ، Guo ، M. S. ، Chaba ، R. ، Gross ، C.A & amp Sauer ، R. T. الإشارات الجزيئية المزدوجة تتوسط الاستجابة البكتيرية لإجهاد الغشاء الخارجي. علم 340, 837–841 (2013).

كلاين ، جي وآخرون. تنظم عوامل النسخ المتعددة نسخ ملف rpoE الجين فيها الإشريكية القولونية في ظل ظروف نمو مختلفة وعندما يكون التخليق الحيوي لعديد السكاريد الدهني معيبًا. J. بيول. تشيم. 291, 22999–23019 (2016).

Amar، A.، Pezzoni، M.، Pizarro، R.A & amp Costa، ​​C. S. rpoE الطفرات في السالمونيلا المعوية. علم الاحياء المجهري 164, 1293–1307 (2018). تحدد هذه الدراسة إشارات تحفيز جديدة لـ σ ه استجابة في السالمونيلا ويحدد أن σ ه استجابة في السالمونيلا يصبح ضروريًا في حالة عدم وجود مستضد O.

Wang، Q.P & amp Kaguni، J.M. عامل سيجما جديد متورط في التعبير عن rpoH جين الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 171, 4248–4253 (1989).

Ades ، S. E. ، Connolly ، L. E. ، Alba ، B. M. & amp Gross ، C. A. The الإشريكية القولونية σ يتم التحكم في استجابة الإجهاد خارج السيتوبلازم المعتمد على E عن طريق التحلل البروتيني المنظم لعامل مضاد. تطوير الجينات. 13, 2449–2461 (1999).

كامبل ، إي إيه وآخرون. الهيكل البلوري لـ الإشريكية القولونية σ E مع المجال السيتوبلازمي لمضاد E RseA. مول. زنزانة 11, 1067–1078 (2003).

تشابا ، ر. وآخرون. يحكم تكامل الإشارة بواسطة DegS و RseB استجابة إجهاد الغلاف بوساطة E في الإشريكية القولونية. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 108, 2106–2111 (2011). توضح هذه الدراسة أن كلاً من تنشيط DegS وتعطيل RseB ضروريان لتنشيط σ ه استجابة وتقترح أن OMPs غير المكشوفة قد تكون كافية لكلتا الإشارتين.

Akiyama، Y.، Kanehara، K. & amp Ito، K. RseP (YaeL)، an الإشريكية القولونية RIP protease ، يشق متواليات الغشاء. EMBO J. 23, 4434–4442 (2004).

أكياما ، ك وآخرون. أدوار الحلقة الشبيهة بغشاء β- دبوس الشعر لبروتياز RseP في انشقاق الركيزة الانتقائي. eLife 4، e08928 (2015).

Flynn, J. M., Levchenko, I., Sauer, R. T. & Baker, T. A. Modulating substrate choice: the SspB adaptor delivers a regulator of the extracytoplasmic-stress response to the AAA+ protease ClpXP for degradation. تطوير الجينات. 18, 2292–2301 (2004).

Rhodius, V. A., Suh, W. C., Nonaka, G., West, J. & Gross, C. A. Conserved and variable functions of the σ E stress response in related genomes. PLOS Biol. 4, e2 (2006).

Dartigalongue, C., Missiakas, D. & Raina, S. Characterization of the الإشريكية القولونية σ E regulon. J. بيول. تشيم. 276, 20866–20875 (2001).

Guillier, M., Gottesman, S. & Storz, G. Modulating the outer membrane with small RNAs. تطوير الجينات. 20, 2338–2348 (2006).

Guo, M. S. et al. MicL, a new sigmaE-dependent sRNA, combats envelope stress by repressing synthesis of Lpp, the major outer membrane lipoprotein. تطوير الجينات. 28, 1620–1634 (2014).

McEwen, J. & Silverman, P. Chromosomal mutations of الإشريكية القولونية that alter expression of conjugative plasmid functions. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 77, 513–517 (1980).

Danese, P. N. & Silhavy, T. J. CpxP, a stress-combative member of the Cpx regulon. J. باكتيريول. 180, 831–839 (1998).

Jubelin, G. et al. CpxR/OmpR interplay regulates Curli gene expression in response to osmolarity in الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 187, 2038–2049 (2005).

Otto, K. & Silhavy, T. J. Surface sensing and adhesion of الإشريكية القولونية controlled by the Cpx-signaling pathway. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 99, 2287–2292 (2002).

Evans, K. L., Kannan, S., Li, G., de Pedro, M. A. & Young, K. D. Eliminating a set of four penicillin binding proteins triggers the Rcs phosphorelay and Cpx stress responses in الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 195, 4415–4424 (2013).

Bury-Moné, S. et al. Global analysis of extracytoplasmic stress signaling in الإشريكية القولونية. PLOS Genet. 5, e1000651 (2009).

Yamamoto, K. & Ishihama, A. Characterization of copper-inducible promoters regulated by CpxA/CpxR in الإشريكية القولونية. بيوسكي. التكنولوجيا الحيوية. بيوتشيم. 70, 1688–1695 (2006).

Mileykovskaya, E. & Dowhan, W. The Cpx two-component signal transduction pathway is activated in الإشريكية القولونية mutant strains lacking phosphatidylethanolamine. J. باكتيريول. 179, 1029–1034 (1997).

Kwon, E. et al. The crystal structure of the periplasmic domain of فيبرايو بارايموليتيكوس CpxA. علوم البروتين. 21, 1334–1343 (2012).

Cosma, C. L., Danese, P. N., Carlson, J. H., Silhavy, T. J. & Snyder, W. B. Mutational activation of the Cpx signal transduction pathway of الإشريكية القولونية suppresses the toxicity conferred by certain envelope-associated stresses. مول. ميكروبيول. 18, 491–505 (1995).

Danese, P. N., Snyder, W. B., Cosma, C. L., Davis, L. J. & Silhavy, T. J. The Cpx two-component signal transduction pathway of الإشريكية القولونية regulates transcription of the gene specifying the stress-inducible periplasmic protease, DegP. تطوير الجينات. 9, 387–398 (1995).

Raivio, T. L. & Silhavy, T. J. Transduction of envelope stress in الإشريكية القولونية by the Cpx two-component system. J. باكتيريول. 179, 7724–7733 (1997).

Price, N. L. & Raivio, T. L. Characterization of the Cpx regulon in الإشريكية القولونية strain MC4100. J. باكتيريول. 191, 1798–1815 (2009). This study provides the first comprehensive analysis of the Cpx regulon.

Raivio, T. L., Popkin, D. L. & Silhavy, T. J. The Cpx envelope stress response is controlled by amplification and feedback inhibition. J. باكتيريول. 181, 5263–5272 (1999).

Chao, Y. & Vogel, J. A. 3΄ UTR-derived small RNA provides the regulatory noncoding arm of the inner membrane stress response. مول. زنزانة 61, 352–363 (2016). This study identifies the CpxQ sRNA, which is transcribed with CpxP and downregulates inner membrane proteins that tend to misfold, as well as Skp, a periplasmic chaperone.

Grabowicz, M., Koren, D. & Silhavy, T. J. The CpxQ sRNA negatively regulates Skp to prevent mistargeting of β-barrel outer membrane proteins into the cytoplasmic membrane. مبيو 7, e00312–16 (2016). This study determines that CpxQ downregulates Skp to prevent the insertion of OMPs into the inner membrane, which would lead to the dissipation of the PMF.

Snyder, W. B., Davis, L. J., Danese, P. N., Cosma, C. L. & Silhavy, T. J. Overproduction of NlpE, a new outer membrane lipoprotein, suppresses the toxicity of periplasmic LacZ by activation of the Cpx signal transduction pathway. J. باكتيريول. 177, 4216–4223 (1995).

May, K. L., Lehman, K. M., Mitchell, A. M. & Grabowicz, M. Identification of a stress response monitoring lipoprotein trafficking to the outer membrane. مبيو https://doi.org/10.1128/mBio.00618-19 (2019).

Guest, R. L., Wang, J., Wong, J. L. & Raivio, T. L. A. Bacterial stress response regulates respiratory protein complexes to control envelope stress adaptation. J. باكتيريول. 199, e00153–17 (2017).

López, C., Checa, S. K. & Soncini, F. C. CpxR/CpxA controls scsABCD transcription to counteract copper and oxidative stress in السالمونيلا المعوية serovar Typhimurium. J. باكتيريول. 200, e00126–18 (2018).

Gottesman, S., Trisler, P. & Torres-Cabassa, A. Regulation of capsular polysaccharide synthesis in الإشريكية القولونية K-12: characterization of three regulatory genes. J. باكتيريول. 162, 1111–1119 (1985).

Shiba, Y. et al. Exploring the relationship between lipoprotein mislocalization and activation of the Rcs signal transduction system in الإشريكية القولونية. علم الاحياء المجهري 158, 1238–1248 (2012). This study determines that the temperature sensitivity of a psgA mutant is due to the inner membrane localization of RcsF, caused by inefficiency in lipoprotein processing.

Ebel, W., Vaughn, G. J., Peters, H. K. 3rd & Trempy, J. E. Inactivation of mdoH leads to increased expression of colanic acid capsular polysaccharide in الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 179, 6858–6861 (1997).

Konovalova, A., Perlman, D. H., Cowles, C. E. & Silhavy, T. J. Transmembrane domain of surface-exposed outer membrane lipoprotein RcsF is threaded through the lumen of beta-barrel proteins. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 111, E4350–E4358 (2014).

Cho, S.-H. وآخرون. Detecting envelope stress by monitoring β-barrel assembly. زنزانة 159, 1652–1664 (2014).

Hussein, N. A., Cho, S.-H., Laloux, G., Siam, R. & Collet, J.-F. Distinct domains of الإشريكية القولونية IgaA connect envelope stress sensing and down-regulation of the Rcs phosphorelay across subcellular compartments. PLOS Genet. 14, e1007398 (2018).

Takeda, S., Fujisawa, Y., Matsubara, M., Aiba, H. & Mizuno, T. A novel feature of the multistep phosphorelay in الإشريكية القولونية: a revised model of the RcsC -→ YojN -→ RcsB signalling pathway implicated in capsular synthesis and swarming behaviour. مول. ميكروبيول. 40, 440–450 (2001).

Torres-Cabassa, A. S. & Gottesman, S. Capsule synthesis in الإشريكية القولونية K-12 is regulated by proteolysis. J. باكتيريول. 169, 981–989 (1987).

Jubete, Y., Maurizi, M. R. & Gottesman, S. Role of the heat shock protein DnaJ in the Lon-dependent degradation of naturally unstable proteins. J. بيول. تشيم. 271, 30798–30803 (1996).

Ebel, W. & Trempy, J. E. الإشريكية القولونية RcsA, a positive activator of colanic acid capsular polysaccharide synthesis, functions to activate its own expression. J. باكتيريول. 181, 577–584 (1999).

Majdalani, N., Hernandez, D. & Gottesman, S. Regulation and mode of action of the second small RNA activator of RpoS translation, RprA. مول. ميكروبيول. 46, 813–826 (2002).

Majdalani, N., Chen, S., Murrow, J., St John, K. & Gottesman, S. Regulation of RpoS by a novel small RNA: the characterization of RprA. مول. ميكروبيول. 39, 1382–1394 (2001).

Ferrieres, L., Aslam, S. N., Cooper, R. M. & Clarke, D. J. The yjbEFGH مكان في الإشريكية القولونية K-12 is an operon encoding proteins involved in exopolysaccharide production. علم الاحياء المجهري 153, 1070–1080 (2007).

Wehland, M. & Bernhard, F. The RcsAB box. Characterization of a new operator essential for the regulation of exopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria. J. بيول. تشيم. 275, 7013–7020 (2000).

Francez-Charlot, A. et al. RcsCDB His-Asp phosphorelay system negatively regulates the flhDC أوبرون في الإشريكية القولونية. مول. ميكروبيول. 49, 823–832 (2003).

Venkatesh, G. R. et al. BglJ–RcsB heterodimers relieve repression of the Escherichia coli bgl operon by H-NS. J. باكتيريول. 192, 6456–6464 (2010).

Castanie-Cornet, M. P., Treffandier, H., Francez-Charlot, A., Gutierrez, C. & Cam, K. The glutamate-dependent acid resistance system in الإشريكية القولونية: essential and dual role of the His-Asp phosphorelay RcsCDB/AF. علم الاحياء المجهري 153, 238–246 (2007).

Pannen, D., Fabisch, M., Gausling, L. & Schnetz, K. Interaction of the RcsB response regulator with auxiliary transcription regulators in الإشريكية القولونية. J. بيول. تشيم. 291, 2357–2370 (2016).

Nagasawa, S., Ishige, K. & Mizuno, T. Novel members of the two-component signal transduction genes in الإشريكية القولونية. J. Biochem. 114, 350–357 (1993).

Raffa, R. G. & Raivio, T. L. A third envelope stress signal transduction pathway in الإشريكية القولونية. مول. ميكروبيول. 45, 1599–1611 (2002). This study identifies the BaeSR two-component system as an envelope stress response that induces spy expression in response to envelope damage.

Zhou, L., Lei, X.-H., Bochner, B. R. & Wanner, B. L. Phenotype microarray analysis of الإشريكية القولونية K-12 mutants with deletions of all two-component systems. J. باكتيريول. 185, 4956–4972 (2003).

Leblanc, S. K. D., Oates, C. W. & Raivio, T. L. Characterization of the induction and cellular role of the BaeSR two-component envelope stress response of الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 193, 3367–3375 (2011).

Nishino, K., Honda, T. & Yamaguchi, A. Genome-wide analyses of الإشريكية القولونية gene expression responsive to the BaeSR two-component regulatory system. J. باكتيريول. 187, 1763–1772 (2005).

Nagakubo, S., Nishino, K., Hirata, T. & Yamaguchi, A. The putative response regulator BaeR stimulates multidrug resistance of الإشريكية القولونية via a novel multidrug exporter system, MdtABC. J. باكتيريول. 184, 4161–4167 (2002).

Brissette, J. L., Russel, M., Weiner, L. & Model, P. Phage shock protein, a stress protein of الإشريكية القولونية. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 87, 862–866 (1990).

van der Laan, M. et al. A conserved function of YidC in the biogenesis of respiratory chain complexes. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 100, 5801–5806 (2003).

Maxson, M. E. & Darwin, A. J. Identification of Inducers of the يرسينيا القولون phage shock protein system and comparison to the regulation of the RpoE and Cpx extracytoplasmic stress responses. J. باكتيريول. 186, 4199–4208 (2004).

Becker, L. A., Bang, I. S., Crouch, M. L. & Fang, F. C. Compensatory role of PspA, a member of the phage shock protein operon, in rpoE mutant السالمونيلا المعوية serovar Typhimurium. مول. ميكروبيول. 56, 1004–1016 (2005).

Kobayashi, H., Yamamoto, M. & Aono, R. Appearance of a stress-response protein, phage-shock protein A, in الإشريكية القولونية exposed to hydrophobic organic solvents. علم الاحياء المجهري 144, 353–359 (1998).

Jones, S. E., Lloyd, L. J., Tan, K. K. & Buck, M. Secretion defects that activate the phage shock response of الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 185, 6707–6711 (2003).

Carlson, J. H. & Silhavy, T. J. Signal sequence processing is required for the assembly of LamB trimers in the outer membrane of الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 175, 3327–3334 (1993).

Weiner, L. & Model, P. Role of an الإشريكية القولونية stress-response operon in stationary-phase survival. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 91, 2191–2195 (1994).

Engl, C. et al. Dissipation of proton motive force is not sufficient to induce the phage shock protein response in الإشريكية القولونية. بالعملة. ميكروبيول. 62, 1374–1385 (2011).

Wang, P., Kuhn, A. & Dalbey, R. E. Global change of gene expression and cell physiology in YidC-depleted الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 192, 2193–2209 (2010).

McDonald, C., Jovanovic, G., Ces, O. & Buck, M. Membrane stored curvature elastic stress modulates recruitment of maintenance proteins PspA and Vipp1. مبيو 6, e01188–15 (2015). This study identifies stored curvature elastic stress of the inner membrane as the direct cause of PspA binding to the inner membrane rather than dissipation of the PMF.

Dworkin, J., Jovanovic, G. & Model, P. The PspA protein of الإشريكية القولونية is a negative regulator of σ 54 -dependent transcription. J. باكتيريول. 182, 311–319 (2000).

Elderkin, S., Bordes, P., Jones, S., Rappas, M. & Buck, M. Molecular determinants for PspA-mediated repression of the AAA transcriptional activator PspF. J. باكتيريول. 187, 3238–3248 (2005).

Yamaguchi, S., Reid, D. A., Rothenberg, E. & Darwin, A. J. Changes in Psp protein binding partners, localization and behaviour upon activation of the يرسينيا القولون phage shock protein response. مول. ميكروبيول. 87, 656–671 (2013).

Weiner, L., Brissette, J. L., Ramani, N. & Model, P. Analysis of the proteins and رابطة الدول المستقلة-acting elements regulating the stress-induced phage shock protein operon. الدقة الأحماض النووية. 23, 2030–2036 (1995).

Weiner, L., Brissette, J. L. & Model, P. Stress-induced expression of the الإشريكية القولونية phage shock protein operon is dependent on σ 54 and modulated by positive and negative feedback mechanisms. تطوير الجينات. 5, 1912–1923 (1991).

Jovanovic, G., Engl, C. & Buck, M. Physical, functional and conditional interactions between ArcAB and phage shock proteins upon secretin-induced stress in الإشريكية القولونية. مول. ميكروبيول. 74, 16–28 (2009).

Jovanovic, G., Weiner, L. & Model, P. Identification, nucleotide sequence, and characterization of PspF, the transcriptional activator of the الإشريكية القولونية stress-induced psp operon. J. باكتيريول. 178, 1936–1945 (1996).

Lloyd, L. J. et al. Identification of a new member of the phage shock protein response in الإشريكية القولونية, the phage shock protein G (PspG). J. بيول. تشيم. 279, 55707–55714 (2004).

Kobayashi, R., Suzuki, T. & Yoshida, M. الإشريكية القولونية phage-shock protein A (PspA) binds to membrane phospholipids and repairs proton leakage of the damaged membranes. مول. ميكروبيول. 66, 100–109 (2007).

Kleerebezem, M., Crielaard, W. & Tommassen, J. Involvement of stress protein PspA (phage shock protein A) of الإشريكية القولونية in maintenance of the protonmotive force under stress conditions. EMBO J. 15, 162–171 (1996).

Jovanovic, G., Lloyd, L. J., Stumpf, M. P. H., Mayhew, A. J. & Buck, M. Induction and function of the phage shock protein extracytoplasmic stress response in الإشريكية القولونية. J. بيول. تشيم. 281, 21147–21161 (2006).

De Las Peñas, A., Connolly, L. & Gross, C. A. σ E is an essential sigma factor in الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 179, 6862–6864 (1997).

Missiakas, D., Mayer, M. P., Lemaire, M., Georgopoulos, C. & Raina, S. Modulation of the الإشريكية القولونية σ E (RpoE) heat-shock transcription-factor activity by the RseA, RseB, and RseC proteins. مول. ميكروبيول. 24, 355–371 (1997).

De Las Peñas, A., Connolly, L. & Gross, C. A. The σE-mediated response to extracytoplasmic stress in الإشريكية القولونية is transduced by RseA, and RseB, two negative regulators of σ E . مول. ميكروبيول. 24, 373–385 (1997).

Nicoloff, H., Gopalkrishnan, S. & Ades, S. E. Appropriate regulation of the σ E -dependent envelope stress response is necessary to maintain cell envelope integrity and stationary-phase survival in الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 199, e00089–17 (2017). This study demonstrates that high-level σ ه activity leads to membrane permeability and is lethal during stationary phase due to the expression of sRNAs targeting OMP translation.

Price, M. N. et al. Mutant phenotypes for thousands of bacterial genes of unknown function. طبيعة سجية 557, 503–509 (2018).

Liu, A. et al. Antibiotic sensitivity profiles determined with an الإشريكية القولونية gene knockout collection: generating an antibiotic bar code. مضاد للميكروبات. وكلاء Chemother. 54, 1393–1403 (2010).

Hart, E. M. et al. Fine tuning of σ E activation suppresses multiple assembly-defective mutations in الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. https://doi.org/10.1128/JB.00745-18 (2019).

Nitta, T., Nagamitsu, H., Murata, M., Izu, H. & Yamada, M. Function of the σ E regulon in dead-cell lysis in stationary-phase الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 182, 5231–5237 (2000).

Pogliano, J. et al. Aberrant cell division and random FtsZ ring positioning in Escherichia coli cpxA* mutants. J. باكتيريول. 180, 3486–3490 (1998).

Delhaye, A., Collet, J.-F. & Laloux, G. Fine-tuning of the Cpx envelope stress response is required for cell wall homeostasis in الإشريكية القولونية. مبيو 7, e00047–16 (2016). This study demonstrates that many of the cell growth and division phenotypes caused by aberrant Cpx activation are due to overexpression of ldtD and increased peptidoglycan crosslinking.

Bernal-Cabas, M., Ayala, J. A. & Raivio, T. L. The Cpx envelope stress response modifies peptidoglycan cross-linking via the l , d -transpeptidase LdtD and the novel protein YgaU. J. باكتيريول. 197, 603–614 (2015).

Shiba, Y. et al. Activation of the Rcs signal transduction system is responsible for the thermosensitive growth defect of an الإشريكية القولونية mutant lacking phosphatidylglycerol and cardiolipin. J. باكتيريول. 186, 6526–6535 (2004).

Tao, K., Narita, S. & Tokuda, H. Defective lipoprotein sorting induces lolA expression through the Rcs stress response phosphorelay system. J. باكتيريول. 194, 3643–3650 (2012).

Boulanger, A. et al. Multistress regulation in الإشريكية القولونية: expression of osmB involves two independent promoters responding either to σ S or to the RcsCDB His-Asp phosphorelay. J. باكتيريول. 187, 3282–3286 (2005).

Umekawa, M. et al. Importance of the proline-rich region for the regulatory function of RcsF, an outer membrane lipoprotein component of the الإشريكية القولونية Rcs signal transduction system. علم الاحياء المجهري 159, 1818–1827 (2013).

Heacock, P. N. & Dowhan, W. Construction of a lethal mutation in the synthesis of the major acidic phospholipids of الإشريكية القولونية. J. بيول. تشيم. 262, 13044–13049 (1987).

Kikuchi, S., Shibuya, I. & Matsumoto, K. Viability of an Escherichia coli pgsA null mutant lacking detectable phosphatidylglycerol and cardiolipin. J. باكتيريول. 182, 371–376 (2000).

Costa, C. S., Pettinari, M. J., Mendez, B. S. & Anton, D. N. Null mutations in the essential gene yrfF (mucM) are not lethal in rcsB, yojN أو rcsC strains of السالمونيلا المعوية serovar Typhimurium. FEMS ميكروبيول. بادئة رسالة. 222, 25–32 (2003).

وو ، تي وآخرون. Identification of a multicomponent complex required for outer membrane biogenesis in الإشريكية القولونية. زنزانة 121, 235–245 (2005).

Ruiz, N., Falcone, B., Kahne, D. & Silhavy, T. J. Chemical conditionality: a genetic strategy to probe organelle assembly. زنزانة 121, 307–317 (2005).

Strauch, K. L. & Beckwith, J. An الإشريكية القولونية mutation preventing degradation of abnormal periplasmic proteins. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 85, 1576–1580 (1988).

Gerken, H., Charlson, E. S., Cicirelli, E. M., Kenney, L. J. & Misra, R. MzrA: a novel modulator of the EnvZ/OmpR two-component regulon. مول. ميكروبيول. 72, 1408–1422 (2009).

Leiser, O. P., Charlson, E. S., Gerken, H. & Misra, R. Reversal of the Δدرجة phenotypes by a novel rpoE allele of الإشريكية القولونية. بلوس واحد 7, e33979 (2012).

Rouvière, P. E. & Gross, C. A. SurA, a periplasmic protein with peptidyl-prolyl isomerase activity, participates in the assembly of outer membrane porins. تطوير الجينات. 10, 3170–3182 (1996).

Heusipp, G., Schmidt, M. A. & Miller, V. L. Identification of rpoE و nadB as host responsive elements of يرسينيا القولون. FEMS ميكروبيول. بادئة رسالة. 226, 291–298 (2003).

Davis, B. M. & Waldor, M. K. High-throughput sequencing reveals suppressors of ضمة الكوليرا rpoE mutations: one fewer porin is enough. الدقة الأحماض النووية. 37, 5757–5767 (2009).

Humphreys, S., Stevenson, A., Bacon, A., Weinhardt, A. B. & Roberts, M. The alternative sigma factor, σ E , is critically important for the virulence of السالمونيلا تيفيموريوم. تصيب. مناعة. 67, 1560–1568 (1999).

Craig, J. E., Nobbs, A. & High, N. J. The extracytoplasmic sigma factor, σ E , is required for intracellular survival of nontypeable المستدمية النزلية in J774 macrophages. تصيب. مناعة. 70, 708–715 (2002).

Martin, D. W., Holloway, B. W. & Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of الزائفة الزنجارية: AlgU shows sequence similarities with a عصية عامل سيجما. J. باكتيريول. 175, 1153–1164 (1993).

Davies, B., Brown, P. D., East, N., Crimmin, M. J. & Balkwill, F. R. A. Synthetic matrix metalloproteinase inhibitor decreases tumor burden and prolongs survival of mice bearing human ovarian carcinoma xenografts. الدقة السرطان. 53, 2087–2091 (1993).

Konovalova, A. et al. Inhibitor of intramembrane protease RseP blocks the σ E response causing lethal accumulation of unfolded outer membrane proteins. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 115, E6614–E6621 (2018). This study identifies a small-molecule inhibitor of RseP and demonstrates that unfolded OMPs accumulate with σ ه inhibition even in the absence of stress.

Bulieris, P. V., Behrens, S., Holst, O. & Kleinschmidt, J. H. Folding and insertion of the outer membrane protein OmpA is assisted by the chaperone Skp and by lipopolysaccharide. J. بيول. تشيم. 278, 9092–9099 (2003).

Payne, J. W. & Gilvarg, C. Size restriction on peptide utilization in الإشريكية القولونية. J. بيول. تشيم. 243, 6291–6299 (1968).

Kato, A., Tanabe, H. & Utsumi, R. Molecular characterization of the PhoP-PhoQ two-component system in الإشريكية القولونية K-12: identification of extracellular Mg 2+ -responsive promoters. J. باكتيريول. 181, 5516–5520 (1999).

Véscovi, E. G., Soncini, F. C. & Groisman, E. A. Mg 2+ as an extracellular signal: environmental regulation of السالمونيلا virulence. زنزانة 84, 165–174 (1996).

Prost, L. R. et al. Activation of the bacterial sensor kinase PhoQ by acidic pH. مول. زنزانة 26, 165–174 (2007).

Bader, M. W. et al. Recognition of antimicrobial peptides by a bacterial sensor kinase. زنزانة 122, 461–472 (2005).

Lippa, A. M. & Goulian, M. Perturbation of the oxidizing environment of the periplasm stimulates the PhoQ/PhoP system in الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 194, 1457–1463 (2012).

Zwir, I. et al. Dissecting the PhoP regulatory network of الإشريكية القولونية و السالمونيلا المعوية. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 102, 2862–2867 (2005).

Minagawa, S. et al. Identification and molecular characterization of the Mg 2+ stimulon of الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 185, 3696–3702 (2003).

Gunn, J. S. et al. PmrA–PmrB-regulated genes necessary for 4-aminoarabinose lipid A modification and polymyxin resistance. مول. ميكروبيول. 27, 1171–1182 (1998).

Pratt, L. A., Hsing, W., Gibson, K. E. & Silhavy, T. J. From acids to osmZ: multiple factors influence synthesis of the OmpF and OmpC porins in الإشريكية القولونية. مول. ميكروبيول. 20, 911–917 (1996).

Mitchell, A. M., Wang, W. & Silhavy, T. J. Novel RpoS-dependent mechanisms strengthen the envelope permeability barrier during stationary phase. J. باكتيريول. 199, e00708–16 (2017).

Hirschman, J., Wong, P. K., Sei, K., Keener, J. & Kustu, S. Products of nitrogen regulatory genes ntrA و ntrC of enteric bacteria activate glnA transcription in vitro: evidence that the ntrA product is a sigma factor. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 82, 7525–7529 (1985).


تعريفات

Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by a person skilled in the art to which this invention belongs. The following references provide one of skill with a general definition of many of the terms used in this invention: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994) The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988) The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991) and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). As used herein, the following terms have the meanings ascribed to them unless specified otherwise.

When introducing elements of the present disclosure or the preferred embodiments(s) thereof, the articles “a”, “an”, “the” and “said” are intended to mean that there are one or more of the elements. The terms “comprising”, “including” and “having” are intended to be inclusive and mean that there may be additional elements other than the listed elements.

As used herein, the term “endogenous sequence” refers to a chromosomal sequence that is native to the cell.

The term “exogenous,” as used herein, refers to a sequence that is not native to the cell, or a chromosomal sequence whose native location in the genome of the cell is in a different chromosomal location.

A “gene,” as used herein, refers to a DNA region (including exons and introns) encoding a gene product, as well as all DNA regions which regulate the production of the gene product, whether or not such regulatory sequences are adjacent to coding and/or transcribed sequences. Accordingly, a gene includes, but is not necessarily limited to, promoter sequences, terminators, translational regulatory sequences such as ribosome binding sites and internal ribosome entry sites, enhancers, silencers, insulators, boundary elements, replication origins, matrix attachment sites, and locus control regions.

The term “heterologous” refers to an entity that is not endogenous or native to the cell of interest. For example, a heterologous protein refers to a protein that is derived from or was originally derived from an exogenous source, such as an exogenously introduced nucleic acid sequence. In some instances, the heterologous protein is not normally produced by the cell of interest.

The terms “nucleic acid” and “polynucleotide” refer to a deoxyribonucleotide or ribonucleotide polymer, in linear or circular conformation, and in either single- or double-stranded form. For the purposes of the present disclosure, these terms are not to be construed as limiting with respect to the length of a polymer. The terms can encompass known analogs of natural nucleotides, as well as nucleotides that are modified in the base, sugar and/or phosphate moieties (e.g., phosphorothioate backbones). In general, an analog of a particular nucleotide has the same base-pairing specificity i.e., an analog of A will base-pair with T.

The term “nucleotide” refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides. The nucleotides may be standard nucleotides (i.e., adenosine, guanosine, cytidine, thymidine, and uridine) or nucleotide analogs. A nucleotide analog refers to a nucleotide having a modified purine or pyrimidine base or a modified ribose moiety. A nucleotide analog may be a naturally occurring nucleotide (e.g., inosine) or a non-naturally occurring nucleotide. Non-limiting examples of modifications on the sugar or base moieties of a nucleotide include the addition (or removal) of acetyl groups, amino groups, carboxyl groups, carboxymethyl groups, hydroxyl groups, methyl groups, phosphoryl groups, and thiol groups, as well as the substitution of the carbon and nitrogen atoms of the bases with other atoms (e.g., 7-deaza purines). Nucleotide analogs also include dideoxy nucleotides, 2′-O-methyl nucleotides, locked nucleic acids (LNA), peptide nucleic acids (PNA), and morpholinos.

The terms “polypeptide” and “protein” are used interchangeably to refer to a polymer of amino acid residues.

Techniques for determining nucleic acid and amino acid sequence identity are known in the art. Typically, such techniques include determining the nucleotide sequence of the mRNA for a gene and/or determining the amino acid sequence encoded thereby, and comparing these sequences to a second nucleotide or amino acid sequence. Genomic sequences can also be determined and compared in this fashion. In general, identity refers to an exact nucleotide-to-nucleotide or amino acid-to-amino acid correspondence of two polynucleotides or polypeptide sequences, respectively. Two or more sequences (polynucleotide or amino acid) can be compared by determining their percent identity. The percent identity of two sequences, whether nucleic acid or amino acid sequences, is the number of exact matches between two aligned sequences divided by the length of the shorter sequences and multiplied by 100. An approximate alignment for nucleic acid sequences is provided by the local homology algorithm of Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). This algorithm can be applied to amino acid sequences by using the scoring matrix developed by Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, and normalized by Gribskov, Nucl. الدقة الأحماض. 14(6):6745-6763 (1986). An exemplary implementation of this algorithm to determine percent identity of a sequence is provided by the Genetics Computer Group (Madison, Wis.) in the “BestFit” utility application. Other suitable programs for calculating the percent identity or similarity between sequences are generally known in the art, for example, another alignment program is BLAST, used with default parameters. For example, BLASTN and BLASTP can be used using the following default parameters: genetic code=standard filter=none strand=both cutoff=60 expect=10 Matrix=BLOSUM62 Descriptions=50 sequences sort by=HIGH SCORE Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Details of these programs can be found on the GenBank website.

As various changes could be made in the above-described cells and methods without departing from the scope of the invention, it is intended that all matter contained in the above description and in the examples given below, shall be interpreted as illustrative and not in a limiting sense.