معلومة

البروتينات المحفوظة غير مولدة للمناعة

البروتينات المحفوظة غير مولدة للمناعة


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

قرأت أن البروتينات التي تم الحفاظ عليها بشكل كبير ليست منشطة للمناعة.

لماذا هو كذلك ؟ ما هو الشيء المميز الذي يجعله غير مناعي (من الصعب تكوين أجسام مضادة ضدهم)؟


الاستمناع ليس له علاقة بكيفية الحفاظ على البروتين. كما أشار نيكو بالفعل ، إنها آلية لمنع المناعة الذاتية. لكن هذا صالح فقط للبروتينات التي تشبه البروتينات البشرية.

إذا قمت بتصميم لقاح ، فأنت تحاول اختيار البروتينات كقاح مرشح ، والتي يتم الحفاظ عليها قدر الإمكان. هذا يجعل اللقاح أكثر شمولية (حيث يتم مشاركة البروتينات المحفوظة بين سلالات مختلفة من البكتيريا أو الفيروسات) ويمنعها أيضًا من أن تصبح غير فعالة عندما يتحور البروتين المستهدف. مثال على ذلك هو فيروس الأنفلونزا حيث تحتاج إلى التنبؤ بالسلالات التي سيتم تداولها لتكوين لقاح. إذا كان من الممكن العثور على بروتين محفوظ ، والذي يتم مشاركته بين جميع الفيروسات (وبالطبع ليس له أي تشابه مع البروتينات البشرية) من لقاح الإنفلونزا الشامل.

يمكن (ويتم) تصميم الأجسام المضادة بشكل مصطنع ، وهذا على سبيل المثال يتم إجراؤه للبكتيريا المحبوسة مثل Menningococcus B ، حيث لا يتوفر لقاح حتى الآن. هذه اللقاحات إما عبارة عن ببتيدات قصيرة نسبيًا أو بروتينات مفردة من العامل الممرض. تُصنع بروتينات اللقاح عادةً بطريقة التكنولوجيا الحيوية ، وتنقيتها ويمكن استخدامها كلقاح. هذا النهج يسمى التطعيم العكسي.


الاستمناع هو

قدرة مادة معينة ، مثل مستضد أو حاتمة ، على إثارة استجابة مناعية في جسم الإنسان أو الحيوان. بعبارة أخرى ، الاستمناع هو القدرة على إحداث استجابة مناعية خلطية و / وخلوية.

إذا كان البروتين محفوظًا بدرجة عالية بين الأنواع ، فهذا يعني أنه سيتم التعرف على حواتمه على أنها الذات من قبل معظم الأنواع ، وبالتالي فإن الكائن الحي سوف يتجنب إنتاج الأجسام المضادة ضدها لمنع المناعة الذاتية.

قد ترغب في القراءة عن التسامح المركزي لترى كيف يتم جعل الخلايا التائية والخلايا البائية غير تفاعلية مع الذات.


تحدد الأشكال المحفوظة مكانيًا في مجالات بروتين التحكم التكميلية الوظائف في منظمات بروتينات عائلة التنشيط التكميلية

يتم التوسط في تنظيم التنشيط التكميلي في الخلايا المضيفة بشكل أساسي عن طريق منظمات بروتينات عائلة التنشيط التكميلي (RCA) التي يتم تشكيلها عن طريق تكرار مجالات بروتين التحكم التكميلي (CCP). ومع ذلك ، فإن التعليق التوضيحي الوظيفي لهذه البروتينات يمثل تحديًا حيث توجد مجالات CCP المتجاورة في البروتينات ذات الوظائف المتنوعة. هنا ، من خلال استخدام نهج in silico ، نحدد خمسة أشكال يتم حفظها مكانيًا بترتيب معين في مجالات CCP التنظيمية لبروتينات RCA المعروفة. لقد أبلغنا أن وجود هذه الأشكال في نمط معين كافٍ لتوضيح المجالات التنظيمية في بروتينات RCA. نظهر أن دمج الحافز المفقود في التكرار المتماثل الطويل الرابع (LHR-D) في المستقبل التكميلي 1 يستعيد نشاطه التنظيمي. بالإضافة إلى ذلك ، ساعد نمط الحافز أيضًا في شرح تعدد الأشكال البشرية كمنظم مكمل. وبالتالي ، نقترح أن الأشكال المحددة هنا هي محددات الوظيفة في بروتينات RCA.


2. المواد والأساليب

في هذا القسم ، في البداية يتم إعداد البيانات بالتفصيل متبوعًا بالمناقشة حول خط الأنابيب للعمل المقترح. لفائدة القراء ، يتم تقديم مناقشات موجزة حول اللقاح المعتمد على الحاتمة والخلايا التائية والخلايا البائية وأدوات التنبؤ الخاصة بهم والخصائص الفيزيائية والكيميائية للحواتم ورسو حواتم الخلايا التائية في الملف التكميلي. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن أدوات التنبؤ الخاصة بحلقات الخلايا التائية والخلايا البائية في الجدولين التكميليين S1 و S2.

2.1. تحضير البيانات

من أجل تعيين بروتينات SARS-CoV-2 ، استخدمنا جينوم SARS-CoV-2 المرجعي (<"type": "entrez-nucleotide" ، "attrs": <"text": "NC_045512.2" ، "term_id": "1798174254" ، "term_text": "NC_045512.2" >> NC_045512.2) 2 و 44583 متواليات البروتين المتاحة من المركز الوطني للتكنولوجيا الحيوية (NCBI). لإنشاء تسلسل البروتين ، أخذنا التسلسل المرجعي لجينوم SARS-CoV-2 واعتبرنا مفاهيم إطار القراءة. يقسم إطار القراءة تسلسل النيوكليوتيدات للتسلسل المرجعي إلى مجموعة من ثلاثة توائم متتالية غير متداخلة. هناك ثلاثة أطر قراءة ممكنة: الإطار 1 الذي يبدأ من أول نيوكليوتيد من تسلسل مرجعي ويخلق الثلاثيات ، الإطار 2 الذي يبدأ من النيوكليوتيد الثاني ويخلق الثلاثيات والإطار 3 الذي يبدأ من النيوكليوتيد الثالث ويخلق التوائم الثلاثة. لكل إطار ، يتم بعد ذلك ترجمة هذه الثلاثة توائم إلى البروتينات المقابلة بناءً على جدول الكودون 3. أخيرًا ، حصلنا على 25 بروتينًا فريدًا من هذا القبيل والتي كانت أفضل مطابقة للإطار 2. أيضًا ، تم جمع التسلسلات الجينومية الحديثة لفيروس SARS-CoV-2 الهندي من المبادرة العالمية لمشاركة جميع بيانات الإنفلونزا (GISAID) 4 بتنسيق فاستا. يحتوي على 566 جينومات كاملة وشبه كاملة بمعرف التسلسل. متوسط ​​طول 566 جينومًا هو 29831 & # x000a0bp. تتم محاذاة تسلسل 566 SARS-CoV-2 باستخدام تقنيات محاذاة التسلسل المتعددة (MSA) لاستخراج المناطق المحفوظة. أيضا ، يتم استخراج البروتين المرتبط بكل منطقة محفوظة. لمحاذاة التسلسلات ، يتم استخدام وسيلة الحوسبة عالية الأداء (HPC) من NITTTR ، كولكاتا. تحتوي مجموعة HPC على عقدة رئيسية مع معالج Intel Xeon Gold 6130 ثنائي يحتوي على 32 نواة و 2.10 & # x000a0GHz و 22 & # x000a0MB L3 Cache و 128 & # x000a0GB DDR4 RAM و 2 GPU و 4 وحدات معالجة مركزية مع معالج Intel Xeon Gold 6152 مزدوج 44 نواة و 2.1 & # x000a0GHz و 30 & # x000a0MB L3 Cache و 192 & # x000a0GB DDR4 RAM لكل منهما ، بينما تحتوي عقد GPU على وحدة معالجة رسومات NVIDIA Tesla V100 مع ذاكرة 16 & # x000a0GB لكل منهما. تم إجراء MSA باستخدام 2 GPU و 4 عقد حوسبة CPU.

2.2. خط أنابيب سير العمل

يظهر خط أنابيب سير العمل في الشكل 1. بادئ ذي بدء ، ركزنا على العثور على المناطق المحفوظة في تسلسل الجينوم 566 SARS-CoV-2 الهندي الذي لا يتأثر بالطفرات الجينية. لنفس الغرض ، قمنا في البداية ببناء نهج توافق متعدد التسلسل (CMSA) استخدمنا فيه أربع تقنيات محاذاة مختلفة: ClustalW و MUSCLE و ClustalO و MAFFT من أجل محاذاة تسلسل 566 SARS-CoV-2. بعد ذلك ، يتم تحديد المناطق المحفوظة بالإجماع (CCnR) بعد العثور على المناطق المحفوظة من كل نتيجة محاذاة لتقنيات المحاذاة. يقوم ClustalW في البداية بإجراء محاذاة زوجية لجميع التسلسلات باستخدام طريقة k-tuple. بعد ذلك ، يتم إنشاء MSA من خلال المحاذاة التدريجية للتسلسلات الأكثر ارتباطًا استنادًا إلى طريقة شجرة دليل الجوار والربط. في تقنية MUSCLE ، يتم استخدام مقياسين للمسافات: k-mer للأزواج غير المحاذاة وطريقة Kimura لأزواج التسلسلات المحاذاة. في البداية ، يتم إنتاج مسودة MSA في MUSCLE باستخدام طريقة k-mer. بعد ذلك ، يتم إنشاء محاذاة تدريجية بناءً على شجرة التوجيه كما تم إنتاجها بواسطة طريقة UPGMA. ثم يتم إعادة تقدير هذه الشجرة الأولية باستخدام طريقة Kimura للمسافة وبعد ذلك يتم استخدام طريقة UPGMA مرة أخرى لإنتاج شجرة دليل جديدة ، وبالتالي إنشاء MSA ثاني. يتم أخيرًا إنشاء MSA الجديد من خلال إعادة تنظيم التسلسلين اللذين تم إنشاؤهما مسبقًا. يستخدم ClustalO طريقة k-tuple لإنتاج محاذاة زوجية. ثم يتم استخدام mBed لتجميع التسلسلات متبوعة بخوارزمية التجميع k-mean. بعد ذلك ، يتم إنشاء شجرة الدليل باستخدام طريقة مجموعة الأزواج غير الموزونة مع طريقة المتوسط ​​الحسابي (UPGMA). أخيرًا ، تم إنشاء MSA باستخدام حزمة HHalign. يستخدم MAFFT طريقتين مختلفتين عن مجريات الأمور ، وهما التدريجي (FFT-NS-2) والصقل التكراري (FFT-NS-i). الهدف الرئيسي من MAFFT هو دمج الخوارزميات المحلية والعالمية لـ MSA. في البداية ، يتم استخدام FFT-NS-2 لحساب جميع المسافات الزوجية لإنشاء MSA مؤقت يتم من خلاله حساب المسافات المكررة. بعد ذلك ، يتم إجراء FFT-NS-i للحصول على MSA النهائي. بعد ذلك ، لتحديد المناطق المحفوظة ، يتم استخدام هذه التسلسلات المتوافقة لحساب الانتروبيا (E).

اينx يشير y إلى تكرار كل بقايا x تحدث في الموقع ذ و 5 يمثل البقايا الأربعة المحتملة مثل فجوة نيوكليوتيد زائد. لتحديد المناطق المحفوظة (CnRs) لكل تقنية محاذاة ، يتم اعتبار الحد الأدنى لطول المقطع 15 مع أقصى متوسط ​​للإنتروبيا يبلغ 0.2. علاوة على ذلك ، يتم أخذ أقصى إنتروبيا لكل موضع على أنه 0.2 مع عدم وجود فجوات بعد العثور على تسلسل الإجماع لـ 566 تسلسل جينومي. يتم أخذ كل هذه القيم بعد اتباع الأدبيات. بعد ذلك ، يتم تحديد CCnRs مع مراعاة CnRs لجميع تقنيات المحاذاة. بعد ذلك ، يتم تنفيذ عملية تنقية لـ CCnRs بناءً على المعايير التي تفيد بأن طولها أكبر من أو يساوي 60nt ولا يوجد كودون توقف في تسلسل البروتين المرتبط. علاوة على ذلك ، يتم استخدام Nucleotide BLAST للتحقق من خصوصية CCnRs كتغطية استعلام أيضًا. بعد ذلك ، يتم تحديد حواتم الخلايا التائية والخلايا البائية من هذه CCnRs. للتنبؤ بحلقات الخلية التائية والخلايا البائية ولإيجاد درجاتها المناعية المقابلة ، يتعرض كل CCnR لـ IEDB 5 و ABCPred 6 على التوالي. وفقًا لتوصية IEDB ، للتنبؤ بحلقات الخلايا التائية MHC-I و MHC-II ، يتم تحديد NetMHCpan 7 ونهج التوافق 8 [40] على التوالي بينما بالنسبة إلى حلقات B-cell ، يتم التنبؤ بواسطة ABCPred الذي يستخدم Recurrent Neural شبكة الاتصال. ثم ، باستخدام الحلقات المتوقعة ، يتم حساب درجات المستضد بمساعدة VaxiJen2.0 9. لكل CCnR ، يتم تحديد حواتم الخلايا التائية والخلايا البائية المتعددة جنبًا إلى جنب مع درجاتها المناعية والمستضدية المقابلة. بعد ذلك ، بالنسبة لكل CCnR ، تعتبر أعلى الدرجات المناعية والمستضدية لاختيار الحلقات المقابلة. علاوة على ذلك ، يتم استخدام هذه الدرجات لتصنيف CCnRs على أساس المتوسط ​​الهندسي كما هو وارد في المعادلة. (2). إن استخدام المتوسط ​​الهندسي هو لتجنب انحراف درجات المستضدات والمناعة التي تم الحصول عليها من أجل حواتم الخلايا التائية والخلايا البائية بحيث يمكن إجراء الترتيب المناسب للمناطق المحفوظة بالإجماع. علاوة على ذلك ، للتحقق من صحة الحلقات المحددة ، تمت دراسة الهياكل غير التساهمية 2D المطابقة للحواتم المحددة باستخدام LigPlot + [41]. علاوة على ذلك ، يتم استخدام خادم BepiPred2.0 10 [42] للتحقق من حلقات الخلية B المتوقعة أيضًا ، يتم الإبلاغ عن الخواص الفيزيائية والكيميائية للحلقات جنبًا إلى جنب مع مخطط Ramachandran من خلال PyMOL [43] ومكتباتها الواسعة Autodock Vina (للإرساء) [44] و PyMOD 3 [45] بينما يتم استخدام خادم ProSA 11 [46] لحساب درجة Z.

أين ، رCCnR يمثل مرتبة المنطقة المحفوظة بالإجماع (CCnR) بناءً على المتوسط ​​الهندسي للدرجات المستضدية والمناعة للخلايا التائية والخلايا البائية ، ISأنا و كماأنا هي الدرجات المناعية والمستضدية المقاسة لـ MHC-I و MHC-II و B-cell epitopes على التوالي.


نتائج

استراتيجية التصميم

من أجل تحديد المخلفات المحفوظة في إنزيمات PHBH التي تحدث بشكل طبيعي ، تم البحث في قاعدة بيانات DDBJ تم العثور على 92 تسلسل PHBH ، بما في ذلك 36 تسلسل من α-protobacteria ، و 15 من β- بروتيوباكتيريا ، و 31 من γ- بروتيوباكتيريا ، و 8 من الفطريات الشعاعية ، و 1 من الحمضية و 1 من أ عصية أضنى. احتوى أطول تسلسل على 410 من الوحدات البنائية وأقصر تسلسل يحتوي على 389 وحدة بنائية. تتألف معظم إنزيمات PHBH البروتينية البكتيرية من 389-393 وحدة بنائية ، بينما تتكون إنزيمات β- بروتيوبكتريا عمومًا من 407 أو 410 من البقايا ومعظم إنزيمات البكتريا البروتينية تحتوي على 394 أو 395 من البقايا (الشكل التكميلي S1). تم إنشاء شجرة نسج غير متجذرة (الشكل التكميلي S2) ، وكشف عن أربع مجموعات ، مما يشير بوضوح إلى أنه بعد التفرع التطوري للبكتيريا البروتينية والبكتيريا الأخرى ، نشأ فصل PHBHs من α- و-و / أو-بروتينات. اقترحت بعض التسلسلات التي نشأت من β- أو-بروتيوبكتيريا أيضًا حالة نقل جيني أفقي قديم.

عندما تمت محاذاة تسلسلات PHBH ، تم العثور على 49 موقعًا تحتوي على نوع واحد فقط من الأحماض الأمينية (المجموعة أ) ، بينما احتوت 43 موقعًا على نوعين من الأحماض الأمينية (المجموعة ب) (الجدول التكميلي SI والشكل التكميلي S3). أشارت محاذاة هذه التسلسلات إلى 11 منطقة ذات درجات حفظ عالية ، أي I7 - L17 ، R44 – E49 ، G157 – G160 ، Y181 – G187 ، E198 – Y201 ، G207 – R214 ، R220 – Q224 ، P275 – D305 ، L333 –W337 و F342-T347 و A382-G387 ، على الرغم من ملاحظة بعض المواقع في المجموعتين A و B في مناطق ذات مستويات منخفضة من الحفظ. تمثل البقايا من المجموعتين A و B حوالي 20٪ من التسلسل الكامل الطول ، مع 18٪ من المواقع الموجودة في مجال ربط FAD ، و 24٪ في مجال ربط الركيزة ، و 29٪ في مجال الواجهة ( الجدول التكميلي SI) (Entsch and van Berkel ، 1995).

لإنشاء قاعدة بيانات متحولة واحدة عن طريق الاستعاضة عن الأحماض الأمينية التي تحدث بشكل طبيعي ، تم اختيار جميع المواقع الـ 49 في المجموعة أ و 4 مواقع من المجموعة ب كأهداف. تم اختيار أربعة بقايا (G9 و L199 و S212 و L299) من المجموعة B بناءً على المعلومات البلورية. يوجد G9 في شكل GxGxxG المحفوظ في أوكسيجينازات المحتوية على الفلافين. يقع L199 بالقرب من الركيزة ، ص-هيدروكسي بنزوات ، وقد لوحظت سلسلته الجانبية بالقرب من نهاية 3 درجات مئوية من جزيء الركيزة. يقع S212 أيضًا بالقرب من الركيزة ، وتتحد سلسلته الجانبية مع سلسلة كربوكسيلية من ص- هيدروكسي بنزوات (موران وآخرون.، 1999). تقع البقايا النهائية في المجموعة B ، L299 ، بالقرب من الحلقة P293 ، وتشكل السلسلة الجانبية روابط هيدروجينية مع R44 و A45 و G46 و Y100 و Q102. فيما يتعلق بالبدائل التي تحدث بشكل طبيعي ، لوحظ 1 G9A ، 1 L199V ، 1 S212T و 12 L299M في محاذاة 92 PHBH تسلسل. أخيرًا ، تم تحديد المخلفات المحفوظة التالية: 12 Gly ، 3 Ala ، 1 Val ، 5 Leu ، 1 Ile ، 2 Ser ، 1 Gln ، 3 Pro ، 2 Phe ، 5 Tyr ، 3 Trp ، 4 Asp ، 2 Glu ، 2 His ، لا توجد مخلفات Lys و 5 Arg (الجدول التكميلي SII).

لاستكشاف العلاقة بين موقع كل بقايا محفوظة وتأثيرات الاستبدال على بنية ووظيفة PHBHs ، تم تحديد المسافة بين البقايا المحفوظة البالغ عددها 53 عن طريق تحليل الكتلة. في الواقع ، لا ترتبط المسافة بين أي بقايا في التسلسل الأولي لجزيء البروتين بالضرورة بالمسافة الثالثة في بنية البروتين ثلاثية الأبعاد (الشكل التكميلي S4). أسفر هذا التحليل عن مخطط شجعي يتضمن 3 مجموعات تصنيفية 1 و 2 و 3 و 5 بقايا أخرى تم دمجها لإنشاء المجموعة 4 (الشكل التكميلي S5).

يوضح الشكل 2 مواقع البقايا المحفوظة البالغ عددها 53 من المجموعات 1 و 2 و 3 و 4 في هياكل مونومر ثالثية وأولية في PHBH. أربعة عشر من البقايا المحفوظة في المجموعة 1 مجمعة حول FAD ، يبدو أن 14 من البقايا المحفوظة في المجموعة 2 تتجمع حول موقع ربط الركيزة ، و 20 من البقايا المحفوظة في المجموعة 3 كانت موجودة بشكل أساسي حول حلقة P293. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه لم يلاحظ أي ارتباط لتوزيع المخلفات المحفوظة بين مجال ربط FAD والمجموعة 1 ولا بين مجال ربط الركيزة والمجموعة 2 ، على سبيل المثال تتألف البقايا المحفوظة الثمانية عشر في مجال ربط FAD من 9 وحدات بنائية من المجموعة 1 و 7 من بقايا المجموعة 3 و 2 من المجموعة 4 (الجدول التكميلي SII).

موقع 53 من المخلفات المحفوظة أو 19 من البقايا الوظيفية المفترضة في الهياكل الأولية والثالثية لـ PHBH. المخلفات المحفوظة (أ) في subaxa a و b و c للمجموعة 1 باللون الأصفر والأصفر الداكن والبني ، على التوالي (ب) في subaxa a و b و c للمجموعة 2 باللون الأحمر والوردي والوردي الفاتح (ج) في subaxa a و b و c و d للمجموعة 3 باللون الأزرق الفاتح والأزرق الداكن والأرجواني على التوالي و (د) في المجموعة 4 باللون الأخضر النعناعي. (ه) تظهر المخلفات الوظيفية المفترضة في المجموعات 5 و 6 و 7 باللون الأصفر والأزرق الفاتح والأرجواني على التوالي. (F) توجد بقايا السيستالات والأرصاد الجوية في مغرة. يظهر جزيء PHBH بناءً على بنية 1pbe. تم إنشاء شعارات التسلسل باستخدام 92 سلسلة من الأحماض الأمينية PHBH المستخرجة من DDBJ.

موقع 53 من المخلفات المحفوظة أو 19 من البقايا الوظيفية المفترضة في الهياكل الأولية والثالثية لـ PHBH. المخلفات المحفوظة (أ) في subaxa a و b و c للمجموعة 1 باللون الأصفر والأصفر الداكن والبني ، على التوالي (ب) في subaxa a و b و c للمجموعة 2 باللون الأحمر والوردي والوردي الفاتح (ج) في subaxa a و b و c و d للمجموعة 3 باللون الأزرق الفاتح والأزرق الداكن والأرجواني على التوالي و (د) في المجموعة 4 باللون الأخضر النعناعي. (ه) تظهر المخلفات الوظيفية المفترضة في المجموعات 5 و 6 و 7 باللون الأصفر والأزرق الفاتح والأرجواني على التوالي. (F) Cys و Met بقايا في مغرة. يظهر جزيء PHBH بناءً على بنية 1pbe. تم إنشاء شعارات التسلسل باستخدام 92 سلسلة من الأحماض الأمينية PHBH المستخرجة من DDBJ.

لمقارنة آثار الاستبدالات في المخلفات المحفوظة وغير المحفوظة ، تم اختيار البقايا غير المحفوظة ، والتي استنتج أنها مرتبطة بشكل مباشر أو غير مباشر ببنية و / أو وظيفة PHBHs ، للتحليل على أساس الدراسات السابقة: على التركيب البلوري لـ PHBHs اقترح بقوة أن S13 و E32 و R33 و R42 و R44 و A45 و G46 و V47 و Q102 و D286 و L299 و N300 تشكل روابط هيدروجينية مع جزيء FAD (شرودر وآخرون.، 1988 شرودر وآخرون.، 1989). من بين هذه المخلفات ، لم يتم تحديد خمسة في وقت سابق على أنها مخلفات محفوظة: S13 و E32 و R33 و R42 و V47 (المجموعة 5) (الشكل التكميلي S3). منذ أن تم الادعاء بأن Q34 و T35 و Y38 ، والموجودة في هيكل اللولب ، قد تتفاعل بشكل مباشر أو غير مباشر مع جزيء FAD (Eppink وآخرون.، 1999 أ) ، تسعة مخلفات ، أي A34 ، S35 ، A36 ، D37 ، Y38 ، V39 ، Q40 ، G41 و I43 ، تم اختيارها (المجموعة 6) (الشكل التكميلي S3). أظهرت الدراسات أن F161 و H162 و Q167 و P267 و R269 قد تشارك في التفاعل بين FAD و NADPH (van Berkel وآخرون.، 1988 موران وآخرون.، 1996 إبينك وآخرون.، 1998a إيبينك وآخرون.، 1999 ب) تم اختيار هذه البقايا كمجموعة 7 (الشكل التكميلي S3). يوضح الشكل 2 المواقع الأولية والثالثية لهذه المخلفات غير المحفوظة بالإضافة إلى تلك الخاصة بالمخلفات المحفوظة.

بناء قاعدة بيانات متحولة واحدة

تم إنشاء قاعدة بيانات أحادية الطافرة عن طريق إجراء استبدال شامل لكل بقايا محفوظة وغير محفوظة في P. الفلورية NBRC14160 PHBH مع واحد من 19 حمضًا أمينيًا آخر طبيعيًا. احتوت قاعدة البيانات على 619 طفرة مفردة نشطة ، بما في ذلك 365 طفرة مفردة نشطة في المخلفات المحفوظة من المجموعات 1 و 2 و 3 و 4 و 254 طفرات مفردة نشطة في بقايا غير محفوظة من المجموعات 5 و 6 و 7. النشاط الرئيسي ، النشاط الفرعي بالنسبة لـ NADPH ، وخصوصية تفاعل NADPH لكل متحولة (الجدول التكميلي SIII). يوضح الشكل 3 توزيع النشاط الرئيسي وخصوصية تفاعل NADPH في قاعدة بيانات متحولة (الشكل التكميلي S6).

توزيع النشاط الرئيسي وخصوصية تفاعل NADPH بين المسوخات المفردة التي تم الحصول عليها. (أ) المسوخ في المخلفات في المجموعة 1 باللون الأصفر (ب) في المجموعة 2 باللون الأحمر (ج) في المجموعة 3 باللون الأزرق (د) في المجموعة 4 باللون الأخضر النعناعي (ه) في المجموعات 5 و 6 و 7 باللون الأصفر والأزرق الفاتح والأرجواني على التوالي و (F) في مخلفات Cys و Met في مغرة. في المخططات الصندوقية ، الترميز اللوني لـ (ز) و (ح) هي نفسها.

توزيع النشاط الرئيسي وخصوصية تفاعل NADPH بين المسوخات المفردة التي تم الحصول عليها. (أ) المسوخ في المخلفات في المجموعة 1 باللون الأصفر (ب) في المجموعة 2 باللون الأحمر (ج) في المجموعة 3 باللون الأزرق (د) في المجموعة 4 باللون الأخضر النعناعي (ه) في المجموعات 5 و 6 و 7 باللون الأصفر والأزرق الفاتح والأرجواني على التوالي و (F) في مخلفات Cys و Met في مغرة. في المخططات الصندوقية ، الترميز اللوني لـ (ز) و (ح) هي نفسها.

أسفر استبدال الـ 14 من المخلفات المحفوظة في المجموعة 1 عن 79 طفرة مفردة ذات نشاط رئيسي قابل للقياس ، أي طفرات مفردة نشطة. ومع ذلك ، لوحظ أيضًا 187 طفرة مفردة ، والتي تم التعبير عنها بثبات ولكن لم تظهر نشاطًا رئيسيًا. وبالمثل ، تم الحصول على 76 طفرة مفردة نشطة في 14 من البقايا المحفوظة في المجموعة 2 ، و 132 متحورًا منفردًا نشطًا في 20 من البقايا المحفوظة في المجموعة 3 و 78 متحولة مفردة نشطة في 5 بقايا محفوظة في المجموعة 4.

تم تحليل الارتباط بين موقع كل بقايا محفوظة وعدد الطفرات الفردية النشطة التي تم الحصول عليها عن كثب. لم يتم الحصول على طفرات نشطة للبدائل في G14 و G160 في المجموعة 1 E198 و R220 و R246 في المجموعة 2 و Q102 و G187 و N300 و F342 في المجموعة 3. تم الحصول على طفرة واحدة نشطة فقط في G9 و G11 و D286 في المجموعة 1 Y201 و H214 و G187 في المجموعة 2 و G295 في المجموعة 3. تم الحصول على أقل من 10 طفرات في 12/14 من المخلفات المحفوظة في المجموعة 1 ، و 10/14 من المخلفات المحفوظة في المجموعة 2 و 14/20 المخلفات المحفوظة في المجموعة 3. ومع ذلك ، أربعة من المخلفات الخمس المحفوظة في المجموعة 4 أنتجت أكثر من 10 طفرات (الشكل التكميلي S7). لم يتم الحصول على طفرات نشطة لـ 9 من أصل 53 من المخلفات المحفوظة ولكن تم الحصول على 365 طفرات نشطة للمتبقي البالغ عددها 44. كان عدد المسوخات الفردية النشطة بالنسبة إلى الرقم المتوقع 30 و 29 و 35 ٪ في المجموعات 1 و 2 و 3 ، على التوالي ، ومع ذلك ، كان العائد في المجموعة 4 82 ٪ (الجدول التكميلي SIV). توجد غالبية المخلفات المحفوظة في المجموعة 4 في المنطقة الخارجية وغير مرتبطة بمخلفات أخرى محفوظة ، مما يشير إلى أن البدائل في بعض بقايا المجموعة 4 قد يكون لها تأثير ضئيل على النشاط الإنزيمي.

أسفر الاستبدال الشامل لكل بقايا غير محفوظة في المجموعات 5 و 6 و 7 عن قاعدة بيانات للطفرات المفردة النشطة: 39 في 5 بقايا في المجموعة 5 ، 169 في 9 بقايا في المجموعة 6 و 46 في 5 بقايا في المجموعة 7 (الشكل 3). والجدول التكميلي SIII). تم إنتاج متحولة واحدة نشطة واحدة فقط في S13 و E32 و R42 في المجموعة 5 ، وتم إنتاج ثلاثة في H162 و F267 وتم إنتاج اثنين في R269 في المجموعة 7. ومع ذلك ، تم إنتاج جميع المسوخات الفردية النشطة البالغ عددها 19 في بقايا واحدة ، V47 ، في المجموعة 5 في 8 بقايا ، Q34 ، T35S ، P36A ، D37 ، V39 ، L40Q ، G41 و I43 ، في المجموعة 6 وفي 2 من البقايا ، F161 و Q167 ، في المجموعة 7.

بناءً على تحملها للاستبدال ، تم تصنيف المخلفات المحفوظة إلى ثلاث فئات: الفئة الأولى تتكون من الطفرات التي تعطل المنتجات أو تزعزع استقرارها ، وكانت الفئة الثانية مقيدة إلى حد ما في تحمل الاستبدال وكانت الفئة النهائية متسامحة مع جميع البدائل. وبالمثل ، تم تقسيم المخلفات غير المحفوظة إلى مجموعتين ، أي القطبين. اختلفت هذه الاتجاهات بوضوح عن تلك الموجودة في قاعدة البيانات الطافرة المفردة السابقة في 12 Cys / Met ، والتي أظهرت توزيعًا طبيعيًا (الشكل 3). يتم حفظ مخلفات Cys / Met هذه بشكل ضعيف ولكنها غير مرتبطة بهيكل وتشغيل جميع البدائل الـ 19 في 12 Cys / Met التي تنتج منتجات نشطة (Suemori و Iwakura ، 2007).

لم تسفر المجموعة 1 عن أي طفرات نشطة ذات نشاط أعلى من إنزيم النوع البري. وبالمثل ، أظهر المسوخ 1 و 2 و 4 و 0 و 2 و 0 نشاطًا رئيسيًا أكبر من النوع البري في المجموعات 2 و 3 و 4 و 5 و 6 و 7 على التوالي. تم تحليل توزيع النشاط الرئيسي للطفرات في كل بقايا محفوظة (الشكل التكميلي 8). شملت المخلفات المحفوظة 12 Gly و 3 Ala و 1 Val و 5 Leu و 1 Ile و 2 Ser و 1 Gln و 3 Pro و 2 Phe و 3 Tyr و 3 Trp و 4 Asp و 2 Glu و 2 His و 0 Lys و 5 Arg (الجدول التكميلي II). تميل Gly ، التي لوحظت في 12 من أصل 53 من المخلفات المحفوظة في إنزيم من النوع البري ، إلى أن تكون غير مسموح بها للاستبدال ، باستثناء G94 في المجموعة 4 ، كان استبدال Gly بأحماض أمينية صغيرة أخرى أكثر احتمالًا. باستثناء Y181 و W234 و W337 (المجموعة 4) ، تميل الأحماض الأمينية العطرية إلى عدم تحمل الاستبدال. كانت الأحماض الأمينية الكارهة للماء والصغيرة نسبيًا أكثر تحملاً للاستبدال ، بغض النظر عن الموقع في إنزيم PHBH. لم يلاحظ أي اتجاهات لاستبدال الأحماض الأمينية القطبية.

من بين 365 طفرة نشطة من البقايا المحفوظة البالغ عددها 53 ، أظهر 64 نوعًا أعلى من خصوصية تفاعل NADPH من الإنزيم من النوع البري: 11 طفرة في كل من L199 و L210 في المجموعة 2 18 و 5 و 1 و 4 في R44 و G46 و L48 و L299 ، على التوالي ، في المجموعة 3 3 لكل من G94 و D108 و 11 في Y181 في المجموعة 4. على النقيض من ذلك ، من بين 254 طفرة نشطة من 19 بقايا غير محفوظة ، أظهر 2 فقط خصوصية تفاعل NADPH أعلى من إنزيم النوع البري . أظهرت بعض المسوخات في L199 و L210 و R44 و Y181 خصوصية تفاعل NADPH أعلى بكثير ، مثل Y181S (0.7٪) و Y181T (0.8٪) و L199Y (0.8٪). يسرد الجدول I المعلمات الحركية لـ Y181S و Y181T ، والتي من أجلها كد و كد كانت القيم أقل من تلك الخاصة بالنوع البري. في قاعدة بيانات 12 Cys / Met المتحولة ، والتي تضمنت 65 طفرة نشطة مفردة ذات خصوصية تفاعل NADPH أعلى من إنزيم النوع البري ، كانت أعلى خصوصية تفاعل NADPH 2.1٪ ، مقارنة بـ 4.7٪ للإنزيم من النوع البري (Suemori) وإواكورا ، 2007). تشير هذه النتيجة إلى أن طفرات البقايا المحفوظة أسفرت عن طفرات ذات خصوصية تفاعل NADPH أعلى بشكل غير متوقع من الإنزيم من النوع البري ، بحيث أن استبدال البقايا المحفوظة من شأنه أن يعطل النشاط أو الاستقرار الرئيسي.

توصيف الطفرات الفردية أو المزدوجة ذات الصلة بـ Y181

. A45G. Y181R / L268G. Y181S. Y181T. النوع البري . A45V.
كد (مم) مع ص- هيدروكسي بنزوات 0.7 3.5 4.1 3.9 9.5 1800
كد (مم) مع 2،4-ديهيدروكسي بنزوات 2200 1000 800 800 22 800
كد (مم) مع protocatechuate 14 65 93 82 230 اختصار الثاني
كقط (ق −1) 0.06 1.1 1.6 2.1 5.7 & lt0.007
. A45G. Y181R / L268G. Y181S. Y181T. النوع البري . A45V.
كد (مم) مع ص- هيدروكسي بنزوات 0.7 3.5 4.1 3.9 9.5 1800
كد (مم) مع 2،4-ديهيدروكسي بنزوات 2200 1000 800 800 22 800
كد (مم) مع protocatechuate 14 65 93 82 230 اختصار الثاني
كقط (ق −1) 0.06 1.1 1.6 2.1 5.7 & lt0.007

تم قياس النشاط عند درجة الحموضة 6.5 و 4 درجات مئوية.

توصيف الطفرات الفردية أو المزدوجة ذات الصلة بـ Y181

. A45G. Y181R / L268G. Y181S. Y181T. النوع البري . A45V.
كد (مم) مع ص- هيدروكسي بنزوات 0.7 3.5 4.1 3.9 9.5 1800
كد (مم) مع 2،4-ديهيدروكسي بنزوات 2200 1000 800 800 22 800
كد (مم) مع protocatechuate 14 65 93 82 230 اختصار الثاني
كقط (ق −1) 0.06 1.1 1.6 2.1 5.7 & lt0.007
. A45G. Y181R / L268G. Y181S. Y181T. النوع البري . A45V.
كد (مم) مع ص- هيدروكسي بنزوات 0.7 3.5 4.1 3.9 9.5 1800
كد (مم) مع 2،4-ديهيدروكسي بنزوات 2200 1000 800 800 22 800
كد (مم) مع protocatechuate 14 65 93 82 230 اختصار الثاني
كقط (ق −1) 0.06 1.1 1.6 2.1 5.7 & lt0.007

تم قياس النشاط عند درجة الحموضة 6.5 و 4 درجات مئوية.

بناء قاعدة بيانات مزدوجة متحولة

أظهر Y181S أعلى خصوصية لتفاعل NADPH ، لذلك تم دمج الطفرات الفردية Y181X مع طفرة L268G ، والتي تم اختيارها بواسطة طريقة التصميم العقلاني. أسفر الاستبدال عن 19 طفرة مزدوجة نشطة Y181X / L268G (الجدول التكميلي SIII). يوضح الشكل 4 النشاط الرئيسي وخصوصية تفاعل NADPH للطفرات المفردة Y181X والطفرات المزدوجة Y181X / L268G. على سبيل المثال ، أدى تغيير خصوصية تفاعل NADPH لـ Y181S إلى Y181S / L268G إلى تغيير من 0.7 إلى 0.5٪ ، وتراوحت التغييرات من 0.8٪ لـ Y181T إلى 0.5٪ لـ Y181T / L268G. ومع ذلك ، اختلفت خصوصية تفاعل NADPH لـ Y181R / L268G اختلافًا كبيرًا عن تلك الخاصة بـ Y181R (0.5 مقابل 4.1٪ للطفرة Y181R الوحيدة). يسرد الجدول الأول المعلمات الحركية للطفرة المزدوجة Y181R / L268G ، والتي أظهرت انخفاضًا كد و كد قيم من الانزيم من النوع البري.

مقارنة بين الأنشطة الرئيسية وخصائص تفاعل NADPH للطفرات المفردة Y181X والطفرات المزدوجة Y181X / L268G. يتم عرض المسوخات الفردية Y181X والطفرات المزدوجة Y181X / L268G كدوائر ومربعات ، على التوالي. من بين المسوخات الفردية Y181X أو المسوخات المزدوجة Y181X / L268G ، X = G و A و V و L و I باللون الرمادي X = S و T و N و Q باللون الأخضر الفاتح X = C و M باللون الأصفر X = P ، F و Y و W باللون الأرجواني X = D و E و H و K باللون البرتقالي و X = R باللون الأحمر. يصور الإنزيم من النوع البري باللون الأسود على مربع.

مقارنة بين الأنشطة الرئيسية وخصائص تفاعل NADPH للطفرات المفردة Y181X والطفرات المزدوجة Y181X / L268G. يتم عرض المسوخات الفردية Y181X والطفرات المزدوجة Y181X / L268G كدوائر ومربعات ، على التوالي. من بين المسوخات الفردية Y181X أو المسوخات المزدوجة Y181X / L268G ، X = G و A و V و L و I باللون الرمادي X = S و T و N و Q باللون الأخضر الفاتح X = C و M باللون الأصفر X = P ، F و Y و W باللون الأرجواني X = D و E و H و K باللون البرتقالي و X = R باللون الأحمر. يصور الإنزيم من النوع البري باللون الأسود على مربع.


محتويات

يحمل مسار Imd عددًا من أوجه التشابه مع إشارات TNFR للثدييات ، على الرغم من أن العديد من البروتينات التنظيمية داخل الخلايا لإشارات Imd تحمل أيضًا تماثلًا لتسلسلات إشارات مختلفة لمستقبلات شبيهة بالرموز البشرية. [6]

تشابه تحرير إشارات TNFR

الجينات التالية متشابهة أو متشابهة بين ذبابة الفاكهة سوداء البطن (بخط عريض) وإشارات TNFR1 البشرية: [7] [8]

  • إيمد: تقويم العظام البشري = RIP1
  • تاك 1: طبيب العظام البشري = Tak1
  • TAB2: تقويم العظام البشري = TAB2
  • دريد: تقويم العظام البشري = كاسباس -8
  • FADD: طبيب العظام البشري = FADD
  • مفتاح / Ikkγ: طبيب العظام البشري = NEMO [8]
  • Ird5: تقويم العظام البشري = IKK2
  • استمتع: تقويم العظام البشري = p65 / p50 و IκB
  • Iap2: طبيب العظام البشري = cIAP2
  • UEV1a: تقويم العظام البشري = UEV1a
  • يلوي: طبيب العظام البشري = UBC13

في حين يتم فحص الإيبستاس الدقيق لمكونات إشارات مسار Imd باستمرار ، فإن الترتيب الميكانيكي للعديد من المكونات الرئيسية للمسار راسخ جيدًا. تناقش الأقسام التالية إشارات Imd كما هي موجودة في ذبابة الفاكهة سوداء البطن، حيث يتميز بشكل استثنائي. [6] يتم تنشيط إشارات Imd من خلال سلسلة من الخطوات من التعرف على مادة بكتيرية (على سبيل المثال peptidoglycan) لنقل تلك الإشارة التي تؤدي إلى تنشيط عامل النسخ NF-B Relish. [7] ثم يشكل المذاق المنشط ثنائيات تتحرك إلى النواة وترتبط بالحمض النووي مما يؤدي إلى نسخ الببتيدات المضادة للميكروبات والمؤثرات الأخرى.

تحرير بروتينات التعرف على الببتيدوغليكان (PGRPs)

يتم إجراء استشعار الإشارات البكتيرية بواسطة بروتين التعرف على الببتيدوغليكان LC (PGRP-LC) ، وهو بروتين عبر الغشاء مع مجال داخل الخلايا. يؤدي ارتباط الببتيدوغليكان البكتيري إلى إضعاف PGRP-LC مما يولد التشكل اللازم لربط وتنشيط بروتين Imd. ومع ذلك ، يمكن أيضًا التعبير عن الأشكال الإسوية البديلة لـ PGRP-LC بوظائف مختلفة: يتعرف PGRP-LCx على الببتيدوجليكان البوليمر ، بينما لا يربط PGRP-LCa الببتيدوغليكان مباشرةً ولكنه يعمل جنبًا إلى جنب مع PGRP-LCx لربط شظايا الببتيدوجليكان الأحادية (تسمى Tcheal أو "السم الخلوي" ). يعمل PGRP آخر (PGRP-LE) أيضًا داخل الخلايا لربط TCT الذي عبر غشاء الخلية أو مشتق من عدوى داخل الخلايا. يعزز PGRP-LA تنشيط إشارات Imd في الخلايا الظهارية ، لكن الآلية لا تزال غير معروفة. [6] [7]

يمكن أن تمنع PGRPs الأخرى تنشيط إشارات Imd عن طريق ربط الإشارات البكتيرية أو تثبيط بروتينات إشارات المضيف: PGRP-LF عبارة عن PGRP عبر الغشاء يفتقر إلى مجال داخل الخلايا ولا يربط الببتيدوغليكان. وبدلاً من ذلك ، فإن أشكال PGRP-LF ثنائيات مع PGRP-LC تمنع تباين PGRP-LC وبالتالي تنشيط إشارات Imd. عدد من PGRPs التي تم إفرازها لها نشاط أميداز الذي يقلل من تنظيم مسار Imd عن طريق هضم الببتيدوغليكان إلى شظايا قصيرة غير مولدة للمناعة. وتشمل هذه PGRP-LB و PGRP-SC1A و PGRP-SC1B و PGRP-SC2. بالإضافة إلى ذلك ، فإن PGRP-LB هو المنظم الرئيسي في القناة الهضمية. [9]

تحرير مكونات الإشارات داخل الخلايا

بروتين الإشارة الأساسي داخل الخلايا هو Imd ، وهو بروتين يحتوي على مجال الموت يرتبط بـ FADD و Dredd ليشكل معقدًا. يتم تنشيط Dredd بعد التواجد في كل مكان بواسطة مجمع Iap2 (بما في ذلك Iap2 و UEV1a و bend و eff) ، مما يسمح لـ Dredd بشق 30 بقايا N-terminus من Imd ، مما يسمح لها أيضًا بالانتشار في كل مكان بواسطة Iap2. [7] بعد ذلك ، يرتبط مركب Tak1 / TAB2 بالشكل المنشط من Imd ومن ثم ينشط مجمع IKKγ / Ird5 من خلال الفسفرة. This IKKγ complex activates Relish by phosphorylation, leading to cleavage of Relish and thereby producing both N-terminal and C-terminal Relish fragments. The N-terminal Relish fragments dimerize leading to their translocation into the nucleus where these dimers bind to Relish-family NF-κB binding sites. Binding of Relish promotes the transcription of effectors such as antimicrobial peptides. [6] [7]

While Relish is integral for transcription of Imd pathway effectors, there is additional cooperation with other pathways such as Toll and JNK. The TAK1/TAB2 complex is key to propagating intracellular signalling of not only the Imd pathway, but also the JNK pathway. As a result, mutants for JNK signalling have severely reduced expression of Imd pathway antimicrobial peptides. [10]

The Imd-mediated antimicrobial response Edit

Imd signalling regulates a number of effector peptides and proteins that are produced en masse following immune challenge. [11] This includes many of the major antimicrobial peptide genes of Drosophila, particularly: Diptericin, Attacin, Drosocin, Cecropin, and Defensin. [12] The antimicrobial response following Imd activation greatly relies on the production of antimicrobial peptides, as flies lacking these peptides are severely immune-deficient. [13]

The Imd pathway appears to have evolved in the last common ancestor of centipedes and insects. [1] However certain lineages of insects have since lost core components of Imd signalling. The first-discovered and most famous example is the pea aphid Acyrthosiphon pisum. It is thought that plant-feeding aphids have lost Imd signalling as they bear a number of bacterial endosymbionts, including both nutritional symbionts that would be disrupted by aberrant expression of antimicrobial peptides, and defensive symbionts that cover for some of the immune deficiency caused by loss of Imd signalling. [14] It has also been suggested that antimicrobial peptides, the downstream components of Imd signalling, may be detrimental to fitness and lost by insects with exclusively plant-feeding ecologies. [15]

Crosstalk between the Imd and Toll signalling pathways Edit

While the Toll and Imd signalling pathways of ذبابة الفاكهة are commonly depicted as independent for explanatory purposes, the underlying complexity of Imd signalling involves a number of likely mechanisms wherein Imd signalling interacts with other signalling pathways including Toll and JNK. [6] While the paradigm of Toll and Imd as largely independent provides a useful context for the study of immune signalling, the universality of this paradigm as it applies to other insects has been questioned. في Plautia stali stinkbugs, suppression of either Toll or Imd genes simultaneously leads to reduced activity of classic Toll and Imd effectors from both pathways. [16]


المواد والأساليب

Similarity searching of non-coding sequence between Fugu and human genomes.

GENSCAN [70] (using a suboptimal exon probability cutoff of 0.1) and tRNA-scan-SE (release 1.1) [71] were used to predict coding exons and tRNA genes within the Fugu draft genome assembly (release 3.0 Rosalind Franklin Centre for Genomics Research Comparative Genomics Group http://fugu.rfcgr.mrc.ac.uk/). These predicted sequences were then masked in the Fugu sequence by supplying them as a “repeat library” to Repeatmasker35. The masked sequence was similarity searched against human genomic sequence from the Ensembl [41] database v18.34.1 in 1-Mb sections using MegaBLAST [40] version 2.2.6 (word size 20 and mismatch penalty –2). Human and Fugu sequences with alignments of 100 bp or over were selected to form the initial CNE sequence dataset.

All CNEs with a significant similarity to an expressed transcript in the EMBL database or protein sequence in Swiss-Prot/TrEMBL were removed from the dataset unless located within a UTR. CNEs with significant similarity to non-coding RNAs were also removed. These were located by comparing the CNEs to the microRNA Registry [72] and the Rfam database (version 5.0) [73] using BLASTn [74]. CNEs were also searched against Rfam using the INFERNAL software. This resulted in the detection of 1 microRNA, four U1 snoRNAs, six U2 snoRNAs, three U5 snoRNAs, one U6atac RNA, three 7S RNAs, one 7Sk RNA, and one 5S RNA. The CNEs were also searched against the UTRdb (http://www.ba.itb.cnr.it/BIG/UTRScan/, which is a collection of functional sequence patterns located in 5′ or 3′ UTR sequences, but no significant hits were found. We used the program QRNA [75] to see whether any of the BLAST matches had a pattern of mutation consistent with RNA secondary structure. However, the known RNAs detected above had the most significant hits from this analysis. QRNA uses the mutational pattern in a pairwise alignment to detect non-coding RNAs, but in general the sequence identity of the CNEs is too high for this to be of use.

Analysis of the distribution of CNEs in the human genome.

In order to test whether CNEs were randomly distributed, a new random location was allocated uniformly for each CNE within its chromosome. This process was repeated 1,000 times for each chromosome, and the average cluster sizes were calculated for the different distances given in Figure 1B. These cluster sizes were then compared to the cluster sizes of the CNEs. χ 2 tests were carried out comparing the number of clusters containing five or fewer CNEs with the number of clusters containing six or more CNEs. ال ص-values obtained from the χ 2 test statistics on one degree of freedom are also shown in Figure 1B. They give very strong evidence against the CNEs being randomly distributed.

Identification of genes associated with CNEs.

The closest gene (using the transcription start site as defined in Ensembl) to the start of each CNE was determined from a list of all human genes supported by external evidence (“known” genes) downloaded using EnsMart, available from the Ensembl Web site (release 24.34e.1 http://www.ensembl.org/). The GOstat program was used to find statistically over-represented GOs in this group of genes [44], using the “goa_human” GO gene association database as a comparator. The minimum length of a considered GO path was five. The false discovery rate option was used to adjust for multiple comparisons.

MLAGAN alignments.

More sensitive global alignment of the CNE regions surrounding 25 orthologous genes in human, Fugu, and other vertebrate species was carried out using the MLAGAN alignment tool kit [50]. To locate the orthologous regions in mouse and rat, local similarity searches with BLASTn were carried out using the most outlying CNE associated with each gene. The relevant genomic regions were extracted from Ensembl for human, mouse, and rat. ل Fugu the genomic regions were extracted from the Medical Research Council Rosalind Franklin Centre for Genomics Research Fugu Genomics Project Web site (http://fugu.rfcgr.mrc.ac.uk/) (where there is additional mapping information for scaffolds. All sequences were orientated prior to alignment so that the coding sequence of the gene was in positive orientation in all sequences. The MLAGAN alignment was visualised using the VISTA program [76], enabling the identification of conserved sequences. Because of the larger evolutionary distance between fish and mammals, conservation was measured using a 40-bp window and a cutoff score of 60% identity. Fugu was always used as the baseline sequence.

Similarity searching of human CNEs against other vertebrate and invertebrate genomes.

To look for the presence of CNEs in other available vertebrate genomes, CNEs were similarity searched against Ensembl mouse (v19.32.2), rat (v21.3.2), chicken (v22.1.1), and zebrafish (v21.3.2) genome sequences using BLASTn with default parameters. All invertebrate sequences in the EMBL database were searched in the same way using BLASTn with non-stringent parameters (mismatch penalty –1, gap open penalty 1, word size 9, and soft masking). More sensitive alignment of flanking orthologous sequence around the SOX21 gene (up to the coding sequence of the genes on either side) from Ensembl C. elegans (v21.25), D. melanogaster (v21.3.1), and Anopheles gambiae (v21.2.2) was carried out using MLAGAN as above.

Fish care.

Zebrafish were raised and bred and embryos staged following standard protocols [77,78] stages are described as the approximate number of hours post-fertilisation (hpf) when embryos are raised at 28.5 °C. To prevent pigment formation, some embryos were raised in 0.003% phenylthiocarbamide in embryo medium from tailbud stage.

Functional Assay.

We assayed for enhancer activity in embryos co-injected with candidate enhancer elements or control DNA and a minimal promoter–reporter construct in a method adapted from Muller and colleagues [37] as described below:

For the preparation of DNA and micro-injection, CNEs, rCNEs, and negative controls were PCR-amplified from Fugu genomic DNA (see Figure S1 for PCR primer sequences primers are represented by the first and last 20 bp of each sequence). The reporter construct consisting of EGFP (Clontech, Palo Alto, California, United States) under the control of a minimal promoter from the mouse β-globin gene, was PCR-amplified from a plasmid vector (available upon request). Amplified DNA was purified using the GFX PCR purification kit (#27–9602-01 Amersham Biosciences, Amersham, United Kingdom) or the QIAquick PCR purification kit (#28106 Qiagen, Valencia, California, United States). Element DNA or control DNA (at 150–300 ng/μl), reporter construct DNA (at 25 ng/μl), and phenol red (at 0.1%, used as a tracer) were combined and co-injected into embryos produced from natural matings between the one-cell stage and early cleavage stages, using an Eppendorf (Hamburg, Germany) FemtoJet pressure injection system. Any embryos developing abnormally were discarded before screening.

For screening of embryos and data collection, on the second day of development (approximately 26–33 hpf), injected embryos were anaesthetised in Tricaine [77] and analysed for GFP expression by observation under fluorescence illumination using an Olympus (Tokyo, Japan) IX81 motorised inverted microscope. Images were captured using an FVII CCD monochrome digital camera and analySIS image-processing software.

GFP-expressing cells were classified according to the following tissue categories: forebrain, midbrain, hindbrain, spinal cord, eye, ear, notochord, muscle, blood (circulating)/blood islands, heart/pericardial region (Please note: Some cells classified in this category may be circulating blood cells), epidermis/EVL, or fins. Cells that did not fall into one of these major expression categories (or that were not possible to unequivocally identify from morphology or localisation) were categorised as “other”. The location and tissue category of each GFP-expressing cell for each embryo was recorded schematically using Adobe Photoshop software (Adobe Systems, San Jose, California, United States), by manually drawing colour-coded schematised cells in appropriate positions onto an overlay of a camera lucida drawing of a 31-hpf embryo (from staging series by C. Kimmel, downloaded from “Zebrafish: The Living Laboratory”, courtesy of the Zebrafish CD Exchange Project contact Mark Cooper at E-mail: [email protected] relating to tissue category was also recorded on a spreadsheet.

GFP expression data were collected from between 25 and 55 expressing embryos per element injected. Cumulative overlaid schematised expression data for each element were compressed into a single JPEG file (displayed in Figure 5). Thus, the JPEG image for each element is designed to give an overall impression of the spatial pattern to which the element directs expression. Coupled with the accompanying graphs, the data present an overview of the spatial localisation of GFP expression as well as an idea of the number of cells per tissue in which GFP expression was detected, indicating the strength of the element's enhancing properties or the size of the cell population to which expression is directed.

Anti-GFP immunostaining.

Embryos were fixed in 4% paraformaldehyde and stained with rabbit polyclonal anti-GFP (#TP401 at 1/1,000 dilution AMS Biotechnology, Abingdon Oxon, United Kingdom) using standard protocols [79] and the ABC amplification system (Vectastain Vector Laboratories, Burlingame, California, United States). Stained embryos were cleared in glycerol, flatmounted, and observed/imaged as above.


مراجعة المادة

Adenoviral vectors are a safe and potently immunogenic vaccine delivery platform. Non-replicating Ad vectors possess several attributes which make them attractive vaccines for infectious disease, including their capacity for high titer growth, ease of manipulation, safety, and immunogenicity in clinical studies, as well as their compatibility with clinical manufacturing and thermo-stabilization procedures. In general, Ad vectors are immunogenic vaccines, which elicit robust transgene antigen-specific cellular (namely CD8 + T cells) and/or humoral immune responses. A large number of adenoviruses isolated from humans and non-human primates, which have low seroprevalence in humans, have been vectorized and tested as vaccines in animal models and humans. However, a distinct hierarchy of immunological potency has been identified between diverse Ad vectors, which unfortunately limits the potential use of many vectors which have otherwise desirable manufacturing characteristics. The precise mechanistic factors which underlie the profound disparities in immunogenicity are not clearly defined and are the subject of ongoing, detailed investigation. It has been suggested that a combination of factors contribute to the potent immunogenicity of particular Ad vectors, including the magnitude and duration of vaccine antigen expression following immunization. Furthermore, the excessive induction of Type I interferons by some Ad vectors has been suggested to impair transgene expression levels, dampening subsequent immune responses. Therefore, the induction of balanced, but not excessive stimulation of innate signaling is optimal. Entry factor binding or receptor usage of distinct Ad vectors can also affect their في الجسم الحي tropism following administration by different routes. The abundance and accessibility of innate immune cells and/or antigen-presenting cells at the site of injection contributes to early innate immune responses to Ad vaccination, affecting the outcome of the adaptive immune response. Although a significant amount of information exists regarding the tropism determinants of the common human adenovirus type-5 vector, very little is known about the receptor usage and tropism of rare species or non-human Ad vectors. Increased understanding of how different facets of the host response to Ad vectors contribute to their immunological potency will be essential for the development of optimized and customized Ad vaccine platforms for specific diseases.


في المختبر Methods for Assessing Immunogenicity Risk

Extensive validation في المختبر assays may be cost-prohibitive, thus current practice is to initiate the analysis with advanced in silico tools (127). التالية في السيليكو analysis, HLA binding and T cell assays can be performed or outsourced to commercial research organizations. These assays can be applied (i) at the very early stages of drug development to design من جديد therapeutics with low predicted immunogenicity, (ii) at a later stage to de-immunize a clinical asset exhibiting high immunogenicity in First in Human studies, (iii) retrospectively after program termination, to decipher the mechanisms and immunogenicity risk factors underlying the high observed clinical immunogenicity. Clearly, for new (and generic versions of older) biologic drugs to be successful, immunogenicity risk assessment is most cost-effective if performed in the pre-clinical phase of development.

في المختبر المقاييس

HLA Binding Assay

The first step in generating a T cell response is recognition of a peptide antigen presented on a HLA class II / MHC class II molecule to a T cell by an APC. Once a potential epitope is identified by في السيليكو analysis, the prediction can be first validated through HLA binding assays, such as the assay described by Steere et al. (131), to assess the ability of a peptide to bind one or more HLA supertype alleles. Supertype alleles refers to families of HLA-DR alleles that share epitope binding motifs. By taking advantage of these supertype families, it is possible to perform binding assays on a relatively small number of alleles while covering 㺕% of the human population worldwide. A standard binding assay is described in Figure 3.

الشكل 3. HLA binding assays and optimal peptide design. In brief, the peptide of interest is incubated with an allele-specific labeled tracer peptide and a soluble HLA supertype monomer are incubated to equilibrium. The following day the binding reaction is halted and the mixture is transferred to assay plates precoated with a pan anti-HLA-DR antibody and incubated overnight. Following this incubation, the plates are developed and peptide binding is indirectly measured by time resolved fluorescence spectroscopy. By using a fixed concentration of the labeled tracer peptide and a range of concentrations for the test peptide, one can generate a multi-point dose ranging curve that enables the calculation of an IC50 value which provides information not only about the ability of the peptide to bind HLA (yes/no) but also about the relative affinity of the peptide to a given HLA-DR supertype. Once can utilize the IC50 values to divide peptides into categories based on their affinity for a given HLA allele, such as high, moderate, low, and non-binding. As new technology becomes available and accessible, it will be useful to look at the kinetics of the binding reaction as well.

A key factor in generation of meaningful binding assay data is the design of the peptide sequence to be tested, and source of the test peptide. The core binding region of a class II peptide contains nine amino acids that sit within the peptide binding groove of an HLA molecule. This interaction is stabilized by flanking residues on either side of the core binding region and extend outside of the binding groove. When designing peptides for binding assays, it is important to properly center the binding motif within the peptide. Failing to do so can lead to the absence of binding despite the presence of an HLA binding motif. This is often seen in data generated by making use of overlapping peptides (83, 132).

The negative impact of improper centering of the T cell epitope in the peptide sequence (centered, with flanking residues on either side) is shown in Figure 4.

الشكل 4. Optimizing test peptides for the HLA peptide binding assay. HLA binding data for Infliximab peptides, published by (83) are shown as described in the publication and compared to في السيليكو تنبؤات. The peptides were re-synthesized with centered HLA binding motifs and the assays were performed using a seven-point concentration curve in a competition assay. في السيليكو predicted core residues are shown in dark blue and flanking residues predicted to stabilize binding but not to interact with the binding groove are shown in gray. Residue positions in source protein are indicated next to the results for HLA binding assays to four HLA DR alleles (Columns). (اليسار) Shows the results for HLA binding of original (15mer, overlapping by 5) peptides tested في المختبر and published data, as compared to في السيليكو تنبؤات. The agreement between predicted and published is only 65%. (حق) Shows repeat data with optimized peptides (MOD) with centered HLA-binding motifs, and repeat assays using a more sensitive assay (competition assays, see Figure 2) as compared to في السيليكو تنبؤات. Centering the HLA binding motif and using a more sensitive assay improved the agreement between في السيليكو و في المختبر assays to 84%. Assay performed by BJR, peptides synthesized at Twenty-first Century Peptides, Waltham, MA).

Peptide purity can also affect the outcome of a binding assay. Purity from some manufacturers can be as low as 60% due to the manufacturing process and the purity of the raw materials. Impurities within the peptides can lead to false positives and lead to faulty conclusions. Peptides for binding assays should be at a minimum 85% pure and should be ordered as net peptide. Spurious results can also be attributed to faulty synthesis. For example, non-binding peptides may have been synthesized on the same machine as earlier runs used to synthesize HLA binding peptides. This type of contamination can derail a drug development program, see for example, reference (133).

السابق فيفو المقاييس

PBMC Assays

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from whole blood are the most prevalent source of responder cells for في المختبر cell based assays for immunogenicity prediction (19, 29). The PBMCs used in experiments can be freshly isolated from healthy volunteer or diseased individuals or thawed from a cryopreserved bank of material potentially covering an appropriate representation of disease relevant or common well-documented HLA alleles. Due to the high throughput and ease of execution, PBMC assays using whole PBMCs, or CD8+ T cell depleted PBMCs remain the most commonly performed في المختبر cell based assay for measuring the potential of immunogenicity (83, 119, 134�).

In addition to typical biological products like protein, antibodies etc., product co-impurities including such as host cell proteins components, protein aggregates, synthesized peptide fragments, and others can also be evaluated in these assays. Multiple rounds of stimulation can be performed by replacing cell supernatants with fresh media spiked with the desired stimulant during extended culturing in order to expand populations of antigen specific T cells for further characterization (29, 119, 137). Schultz et al. recently reported success with a variation of the PBMC cell based assay that allows the enrichment of the number of CD4+ T cells prior to co-culture with irradiated syngeneic PBMCs in an effort to increase throughput and sensitivity (138).

The biological outcomes for T cell activation can be measured in these في المختبر assays (both PBMC based and DC-T cell (see below) using a number of readouts. T-cell proliferation as assessed by thymidine incorporation and CFSE dye dilution are used frequently (7, 139, 140). Activation induced cytokine secretion may be measured using a focused (IL-2, IL-4, IFN-γ) or large multiplexed cytokine immunoassay panels and ELISPOT and are used as markers for T-cell activation and immunogenicity potential (136, 141, 142). Flow cytometry based detection of T cell responders allows a further characterization of the response in terms of intracellular cytokines, regulation of cell surface markers of activation, signal transduction events, and proliferation of specific T cell types (143, 144).

DC-T Cell Assays

في المختبر co-cultures of monocyte derived dendritic cells (moDCs) and autologous CD4+ T cells are being increasingly used to evaluate immunogenicity potential of drug candidates and product CQAs. The DC-T cell or DC-PBMC methods pare the system down to the basic components of cell mediated immunity: CD4+ T cells interacting with an APC at relevant cell ratios, enhancing sensitivity as the total number of potential responder cells in the experimental system is much greater than the whole PBMC method. However, this method is time consuming and requires isolation and differentiation of monocytes into dendritic cells followed by an antigen loading/pulsing step which may be reagent, operator and material dependent.

Monocytes may be isolated from PBMC starting material using plastic adherence or isolation steps using magnetic bead separation methods. Differentiation and maturation of moDCs using cytokines or other factors is then performed (7, 57, 144�), concurrently with the addition of the desired biotherapeutic, peptide fragments, or aggregates. The matured, pulsed moDCs are then typically combined in a co-culture with autologous, purified CD4+ T cells to allow for antigen presentation and T cell activation depending on immunogenicity potential. The responses are measured as is performed for PBMC assays as described above. An advanced variation of the moDC-T cell system is the Modular Immune في المختبر Construct (MIMIC ® ) model which is capable of reproducibly generating both antigen-specific innate and adaptive immune responses against biologic such as proteins, peptides, mAbs as well as novel modalities including nucleic acids (147, 148) has also been described for these purposes.

Flow Cytometry Analysis of T Cell Phenotype

Flow cytometry has become a valuable tool in the assessment of immunogenicity that allows for the characterization of an immune response down to the single cell level (149). As the instruments become more sophisticated by adding more laser and filter combinations as well as advances in staining and detection methods, a wealth of information can be obtained from a sample of patient's blood.

T cell epitopes have the capacity to be either immunogenic or tolerogenic. While it may be difficult to measure the expansion of Tregs in cell culture, the presence of Treg epitopes can be confirmed by co-incubation with effector T cells in the presence of immunogenic peptides. In this 𠇋ystander assay,” activated Tregs inhibit the antigen-specific T effector response to the immunogenic peptides (150).

A standard bystander assay makes use of the immunologic memory toward antigens such as tetanus toxin, to which the majority of the population has had previous exposure through vaccination or natural exposure. PBMCs are cultured for 10 days in the presence of inactivated tetanus toxoid and the Tregitope at varying concentrations. Cells are stained for analysis by flow cytometry (Teff cells are defined as CD3𫳔�ʿoxP3low, Treg cells are defined as CD3𫳔�lowCD25ʿoxP3hi) and proliferation can then be measured by CFSE dilution. In the presence of Tregitope, we have observed a reduced proliferation of effector T cells to tetanus toxoid compared to the tetanus toxoid alone (151).

البروتيوميات

MAPPS Assays

In the early 1990s an additional method called MAPPs was first described (152). This assay has proved valuable in identifying processed peptides presented on the surface of antigen presenting cells by relevant HLA. Additionally this approach attempts to understand the variability in antigen processing contributed by enzyme cleavages in healthy and diseased subjects and sequencing of the peptide associated with HLA can provide confirmation/validation to the sequences identified by algorithms.

Recent advancements in LC/MS sensitivity and proteomics analysis have enabled HLA bound mapping assays to be utilized pre-clinically to map potential antigenic sequence contained within a biological therapeutic. Studies have shown that not all potential HLA binding peptides are processed and presented by APC due to a combination of partial unfolding HLA binding and cathepsin trimming. Additionally, editing functions of HLA DM and HLA DO further enhance selectivity of the peptides selected for presentation (153).

In these assays (presented as a schematic in Figure 5) antigen presenting cells are generated في المختبر and incubated with the therapeutic protein of interest for 24 h followed by a cytokine/mitogen induced maturation step to upregulate HLA expression. After cell lysis HLA receptor peptide complexes are isolated by immune precipitation followed by an acid elution step to dissociate the peptide from the HLA complex and sequenced by LC/MS. Subtraction of endogenous peptides and mapping of the peptides to the therapeutic can be done using proteomics protein database algorithms. These assays are likely to point toward antigenic peptides that can be targeted for deimmunizing protein engineering. Furthermore, whole blood from relevant diseased state can provide insights into altered presentation as well as tolerance for recombinant replacement therapeutics.

الشكل 5. MAPPs assay design. Overview of MAPPS assay. Monocytes are isolated from whole PBMCs and differentiated into Dendritic Cells (DCs) in the presence of IL-4 and GMCSF (أ). Immature DCs are matured by incubating cells with LPS and antigen (ب). Mature DCs (ج), are lysed (د). releasing peptide-loaded HLA molecules from the plasma membrane which are collected by immunoprecipitation (هـ). Next peptides are eluted from the HLA molecules (F) and analyzed by Mass Spec (ز). Peptides are identified by screening them against a database of known antigens (ح).

A case study showing the use of algorithms, innate and adaptive phase outputs as well as MAPPs was applied to anti-IL-21 receptor ATR-107 (144). في السيليكو analysis of the primary sequence predicted two overlapping CD4 T cell epitopes in the heavy chain Complementary Determining Region (CDR) 2, and one single epitope in the light chain CDR2. The MAPPs confirmed the epitope in LC CDR2 as a dominant peptide presented by DCs. ATR-107 induced DC activation as attested by an increased expression of cell surface activation markers and cytokine production, and specific proliferation of autologous CD4 T cells in co-culture conditions. As illustrated in Figure 5, the validation of في السيليكو predictions using MAPPS can be reassuring for developers.

However, elution of a peptide in a MAPPs assays does not confirm whether the peptide drives T-cell dependent immune response (13). T cell responses may differ depending on the phenotype of the T cells that are responding to the sequence. Using MAPPs without additional tools that explore the phenotype of T cells that respond to the eluted peptides, may over predict immunogenicity.

The importance of individual epitopes driving immunogenicity was also reinforced in a recent demonstration by Cassotta et al. who conducted a MAPPS analysis of natalizumab immunogenicity, a humanized antibody directed against alpha4 integrins (82). Taking advantage of a combination of في السيليكو and in cellular في المختبر assays, in particular a MAPPs assay performed with B cells isolated from patient peripheral blood, the authors established that two multiple sclerosis patients treated with Natalizumab who developed neutralizing ADA mounted a T cell response against a CD4 T cell epitope located in the V region of the light chain.


المواد والأساليب

Generation of the pCAG Prdm1β Vector and pCAG CAT 1b8 Transgenic Line

The coding sequence of the murine truncated form of Prdm1 (Prdm1β) ( Gyory et al. 2003) cloned by rapid amplification of cDNA-ends by polymerase chain reaction (RACE PCR) (Vincent SD, unpublished data) linked to an IRES green fluorescent protein (GFP) was cloned into the conditional pCAG CAT vector (kindly provided by Y. Saga, National Institute of Genetics, Japan) ( Watanabe et al. 2006). Efficient conditional expression of the Prdm1β protein was checked by co-transfection in C2C12 cells with a plasmid expressing Cre followed by green fluorescent protein (GFP) expression and western blot analysis. Linearized vector was microinjected by the Centre d'Ingénierie Génétique Murine platform (Institut Pasteur, France) to generate transgenic mouse lines. Three independent lines were established, only one of which showed bright GFP expression after Cre recombination. This line, Tg(pCAG CAT 1b8), was employed in this study, using the Myf5 Cre/+ line.

Mouse Strains and Genotyping

ال Blimp1-mEGFP, Mrf4 − (Myf6 tm1Eno ), Myf5 Cre , Myf5 lox , Myf5 nlacZ , Myod1 − , Pax3 Cre , Prdm1 BEH , Prdm1 CA , صه − , سمو − alleles have been described elsewhere ( Rudnicki et al. 1992 Zhang et al. 1995 Tajbakhsh, Bober, et al. 1996 Tallquist et al. 2000 Zhang et al. 2001 Shapiro-Shelef et al. 2003 Kassar-Duchossoy et al. 2004 Engleka et al. 2005 Ohinata et al. 2005 Vincent et al. 2005). ال Myog − (Myogenin) allele was obtained from the Myog flox allele ( Knapp et al. 2006) by crossing with the PGKCre transgenic line ( Lallemand et al. 1998). Mouse care and procedures were in accordance with institutional and national guidelines. Embryonic day (E) 0.5 was counted from the appearance of a vaginal plug.

Whole-Mount In Situ Hybridization and Immunolocalization

Whole-mount in situ hybridization was performed according to standard protocols ( Nagy et al. 2003). Prdm1 ( Vincent et al. 2003) and Myog ( Sassoon et al. 1989) probes have been previously described. One of the سوكس 6 probes was produced from a plasmid template kindly given by N. Hagiwara (University of California, Davis): The template was linearized with NotI and the probe was transcribed using SP6 RNA polymerase (Promega). الثاني سوكس 6 probe was transcribed using SP6 RNA polymerase from a template generated by PCR (GCA GCC ACA CGG AGT TGA TG and CAT TTA GGT GAC ACT ATA GTG ATG GTG TGG TCG TTG CC primers). Both probes gave similar results.

Embryos were dissected at E10.5 and then fixed for 2 h in 4% paraformaldehyde at 4 °C. After three rinses, embryos were transferred to 15% sucrose/phosphate buffered saline and embedded in 7% gelatin and 15% sucrose. Embryos were sectioned on a Leica cryostat, to give 20-μm thick slices (or 50-μm thick slices for سوكس 6 و Myog whole-mount in situ hybridized embryos). As primary antibodies, a chick polyclonal for GFP (Invitrogen), rabbit polyclonal antibodies Myogenin (Santa Cruz), and Mrf4 (Invitrogen), mouse monoclonal antibodies MF20 (all MyHC) (DSHB), Pax3 (DSHB), and Ki67 (BD Biosciences), and a rat monoclonal antibody for Prdm1 (6D3 Santa Cruz) were used. As secondary antibodies, conjugated Alexa 488/546 against the different species (Invitrogen) were used. Immunolocalization was performed as described and analyzed with a Zeiss ApoTome system.

Quantitative Reverse Transcription–PCR Analysis

Total RNA was prepared from E10.5 and E11.5 embryos. Briefly, individual embryos were staged by counting the somite number and lysed in TRIzol (Invitrogen). After genotyping, total RNA was prepared according to the manufacturer’s protocol (Applied Biosystem). RNA was purified on PureLink RNA mini kit columns (Invitrogen). RNA was then quantified using a nanodrop spectrophotometer. Five hundred nanograms of RNA were retro-transcribed with random hexamers and Superscript II (Invitrogen). Quantitative PCR was performed using the Power SYBR Green PCR Master Mix on a StepOne Plus Real-Time PCR system (Applied Biosystem), with RNA extracted from embryos with the same number of somites. Three mutant and two control embryos with the same somite number were analyzed as triplicates. Primer sequences have been published elsewhere ( Niro et al. 2009). Results were standardized to جابده و Myog النصوص. Data were analyzed using the Mann–Whitney non parametric test (http://www.anastats.fr/).


Are innate immune signaling pathways in plants and animals conserved?

Although adaptive immunity is unique to vertebrates, the innate immune response seems to have ancient origins. Common features of innate immunity in vertebrates, invertebrate animals and plants include defined receptors for microbe-associated molecules, conserved mitogen-associated protein kinase signaling cascades and the production of antimicrobial peptides. It is commonly reported that these similarities in innate immunity represent a process of divergent evolution from an ancient unicellular eukaryote that pre-dated the divergence of the plant and animal kingdoms. However, at present, data suggest that the seemingly analogous regulatory modules used in plant and animal innate immunity are a consequence of convergent evolution and reflect inherent constraints on how an innate immune system can be constructed.


شاهد الفيديو: 150جرام بروتين لتضخيم العضلات طبيعي بدون دهون في شهر بـ20جنيه مصادر طبيعية للبروتين (قد 2022).


تعليقات:

  1. JoJokazahn

    ليس المقصود

  2. Afework

    إنه ممتع. قل لي أين يمكنني أن أقرأ عن هذا؟

  3. Tokinos

    وأنا أتفق تماما معك. هناك شيء ما في هذا والفكرة جيدة ، أنا أؤيده.

  4. Parlan

    الرسالة التي لا تضاهى ، ترضي كثيرا :)

  5. Vihn

    يحدث ذلك. دعونا نناقش هذه القضية.

  6. Chace

    أنا أفهم ذلك جيدًا. أنا يمكن أن تساعد مع قرار السؤال. معا يمكننا أن نجد القرار.



اكتب رسالة