معلومة

ربط الحمض النووي DNA مع الفورمالديهايد؟

ربط الحمض النووي DNA مع الفورمالديهايد؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تبدأ تقنية 3C (التقاط تشكل الكروموسوم) لدراسة تنظيم الكروماتين ثلاثي الأبعاد بخطوة عبر الارتباط باستخدام الفورمالديهايد للعثور على أجزاء من الحمض النووي تتفاعل. في فهمي يحدث الربط المتبادل فقط بين الحمض النووي والبروتينات التي تشكل معقد الحمض النووي والبروتين والحمض النووي. "الوحيد" هو من موقف الحمض النووي كما يحدث بالطبع الروابط البروتينية البروتينية المتقاطعة.

هل يمكن للفورمالديهايد أن يربط جزيئين مزدوجين من الحمض النووي؟ هل نهج 3C يلتقط أيضًا تفاعلات مباشرة بين الحمض النووي والحمض النووي؟

نظرت في الأدب ، وخاصة Dekker وآخرون. وصف الطريقة ، ولكن تعذر العثور على هذه المعلومات. شكرا.


قد تكون حقيقة عدم وجود ربط متقاطع بين الخيوط المزدوجة المختلفة بسبب عدم قدرة الرابط المتقاطع على سد المسافة بين الأمينات ذات القواعد المختلفة على خيوط مزدوجة مختلفة.

تم وصف الارتباط القائم على الفورمالديهايد بين القواعد النووية بواسطة Chaw et al. (1980) حيث سد الفورمالديهايد فجوة في التطبيق. 3 أنجستروم (2x 1.3 ألف لرابطة N-C).

حتى إذا كنت تأخذ الشكل الأكثر تكثيفًا من الحمض النووي كما هو الحال في النيوكليوسومات (انظر نموذج الأشعة السينية للنيوكليوزوم ذي الحمض النووي المرتبط) ، فلا يزال لديك 20 أنجسترومًا على الأقل بين قواعد الخيوط المزدوجة المختلفة. في الوقت نفسه ، لا يوجد سوى 3 أنجستروم بين القواعد النووية لنفس الشريط المزدوج ، تتفق جيدًا مع طول جسر الميثيل.


النيوكليوتيدات والحمض النووي المعدلة سكوارامات للربط المتقاطع المحدد مع الببتيدات والبروتينات المحتوية على ليسين

2′-deoxycytidine 5′- المرتبط بـ Squaramateا- تم تصنيع ثلاثي الفوسفات ووجد أنه ركيزة جيدة لـ KOD XL DNA polymerase في التمديد التمهيدي أو تخليق PCR للحمض النووي المعدل. يتفاعل الحمض النووي الناتج المرتبط بالتربيع مع الأمينات الأولية لتشكيل رابط ثنائي ثابت. تم استخدام هذا التفاعل للاقتران الحيوي للحمض النووي مع الببتيدات المحتوية على Cy5 و Lys. شكل الحمض النووي المرتبط بـ Squaramate روابط تساهمية مع بروتينات هيستون. هذا النيوكليوتيد التفاعلي لديه القدرة على الاقترانات الحيوية الأخرى للأحماض النووية مع الأمينات أو الببتيدات أو البروتينات دون الحاجة إلى أي كاشف خارجي.

تعتبر تفاعلات البروتين والحمض النووي ذات أهمية حاسمة في تغليف الحمض النووي ، والنسخ المتماثل ، والنسخ ، والتعديلات اللاجينية ، والإصلاح. 1 تعد عوامل النسخ (TFs) بروتينات ربط الحمض النووي مهمة بشكل خاص والتي تنظم التعبير الجيني من خلال الارتباط الخاص بالتسلسل لتسلسل المحفز. من بين ما يقرب من 1600 TFs بشرية معروفة ، فإن الدور البيولوجي المفصل والزخارف الملزمة مفهومة تمامًا لجزء صغير فقط. 2 على الرغم من وجود عدد من الطرق لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي ولتحديد البروتينات المرتبطة بالحمض النووي 3 ، لا تزال هناك حاجة ملحة لطرق بديلة أخرى ، خاصة للبروتينات ضعيفة الارتباط. يعد الارتباط التساهمي أحد أكثر الطرق الواعدة لتحديد البروتينات المرتبطة بالحمض النووي ، ولكن اقتران البروتين التساهمي والحمض النووي المتقارن مفيد أيضًا للتطبيقات الأخرى في البيولوجيا الكيميائية أو الاستشعار البيولوجي. 4

هناك بعض الطرق العامة غير المحددة للربط المتبادل القائمة على التوليد الكيميائي الضوئي للجذور (من 5 هالويوراسيل) 5 أو الكربينات (من القواعد النووية المرتبطة بالديزيرين) 6 في الحمض النووي التي ترتبط بشكل عشوائي بالأحماض الأمينية المجاورة من خلال عمليات تنشيط C H. أكثر صعوبة ولكن من المحتمل أن تكون مفيدة للغاية هي التفاعلات الخاصة بسلاسل جانبية واحدة أو عدة سلاسل جانبية للأحماض الأمينية ، ولكن تم الإبلاغ عن عدد محدود جدًا منها حتى الآن للربط المتبادل بين الحمض النووي والبروتين. يمكن أن يرتبط الحمض النووي المرتبط بالثيول بالبروتينات المحتوية على Cys من خلال تكوين ثاني كبريتيد. 7 تم الإبلاغ عن الحمض النووي المرتبط بالفينيل سلفوناميد للارتباط المتقاطع مع Cys ، 8 بينما يرتبط كلورو أسيتاميد بالبروتينات من خلال Cys أو His. 9 في كلتا الحالتين ، كان تأثير القرب حاسمًا للتكوين الفعال للرابط التساهمي بين الحمض النووي المعدل والبروتين. كانت التقارير الأكثر شيوعًا حول الربط المتبادل للحمض النووي المرتبط بالألدهيد مع Lys إما من خلال تكوين قاعدة شيف غير فعالة وقابلة للانعكاس 10 أو (في كثير من الأحيان) من خلال التصفية المختزلة غير القابلة للعكس ، 11 ، 12 والتي تتطلب اختزالًا إضافيًا متكافئًا (على سبيل المثال ، سام NaBH3CN ، مما يعقد أي استخدام في السليلو أو في الجسم الحي). تفاعلات Lys – DNA متكررة ومهمة للغاية ، لا سيما في الهيستونات. حتى الآن ، لم يتم الإبلاغ عن أي تعديل للقاعدة النووية التفاعلية في الحمض النووي لتشكيل روابط متقاطعة لا رجعة فيها مع Lys بدون كاشف خارجي.

غالبًا ما تستخدم الأميدات الأحادية للحمض التربيعي (سكويرامات) في عمليات الاقتران الحيوي مع Lys والأمينات الأخرى. تم استخدام 13 Diamides (squaramides) كبديل للفوسفات في نظائر النيوكليوتيد 14 أو نظائرها قليلة النوكليوتيد (ON). 15 تم الإبلاغ عن اتحاد متقارن 2′-سكر مرتبط بالسكر- RNA ، تم تحضيره من خلال تفاعل 2′-amino-modified RNA مع ثنائي إيثيل تربيع ، على الارتباط المتقاطع مع aminoacyl-transferase FemXWv، 16 كمثال وحيد لاستخدامه في اقتران الحمض النووي. في إطار برنامجنا الذي يستهدف الأحماض النووية الوظيفية الأساسية للتطبيقات في البيولوجيا الكيميائية ، 17 قمنا بتصميم جديد مرتبط بالسايتوزين 2′-deoxyribonucleoside ثلاثي الفوسفات (dNTP) للتركيب الأنزيمي للحمض النووي المعدل والربط المتبادل مع البروتينات.

بدأ تركيب النيوكليوتيدات المعدلة المرغوبة بتحضير 5- (3-أمينوبروبينيل) -2′-deoxycytidine (1) عن طريق نزع مادة trifluoroacetylamide المعروفة ، 18 انظر المخطط S1 في دعم المعلومات. رد فعل أمين 1 مع 2 معادل من ثنائي إيثيل تربيع أعطى النيوكليوسيد المرتبط بالتربيع تيار مستمر ESQ في عائد 80٪ (مخطط 1). فسفرة يوشيكاوا القياسية 19 مع POCl3 أعطى أحادي الفوسفات تيار مستمر ESQ MP في محصول 37 ٪ ، في حين أن ثلاثي الفسفرة 20 مع POCl3 متبوعًا بالبيروفوسفات وثلاثي إيثيل الأمونوم بيكربونات (TEAB) أعطى ثلاثي الفوسفات تيار مستمر ESQ TP في 7٪ العائد. أحادي الفوسفات تيار مستمر ESQ MP بمثابة مركب نموذجي للتفاعلات مع Lys والببتيدات (مخطط 1). رد فعل تيار مستمر ESQ MP مع Ac-Lys أو ثلاثي الببتيد المحتوي على Lys استمر في درجة حرارة الغرفة في محلول بورات (pH 9) طوال الليل لإعطاء الاتحادات المرغوبة تيار مستمر ESQLys MP أو تيار مستمر ESQ3 بيبت النائب في 54 و 63٪ على التوالي. تم عزل اتحادات النوكليوتيدات - الببتيد بواسطة HPLC في شكل نقي وتميزت بشكل كامل عن طريق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي وقياس الطيف الكتلي (MS) لتأكيد التكوين المتوقع لرابطة الأميد مع Lys.

تخليق 2′-deoxycytidine المعدل سكواراماتي و 2′-deoxycytidine أحادي وثلاثي الفوسفات و تيار مستمر ESQ MP مع Ac-Lys و ثلاثي الببتيد المحتوي على ليسين (AcAlaLysAlaNH2).

بعد ذلك ، اختبرنا dNTP المرتبط بـ Squaramate (تيار مستمر ESQ TP) كركيزة لتخليق DNA-polymerase المحفز للحمض النووي المعدل (الشكل 1 أ). أولاً ، أجرينا التمديد التمهيدي (PEX) في وجود بوليميريز DNA KOD XL مع قالب 19 أو 20 أو 31 أو 98 مير وبادئ التمهيدي 13 أو 15 أو 25 مير (لتسلسل قليل النوكليوتيد ، راجع الجدولين S1 و S2 في معلومات الدعم). في جميع الحالات (الشكل 1 ب والمعلومات الداعمة ، الشكل S1) ، لاحظنا تكوين منتجات PEX كاملة الطول تحتوي على واحد أو أربعة أو ثمانية عشر تيار مستمر ESQ التعديلات. تم أيضًا إجراء تضخيم PCR باستخدام قوالب 98-bp أو 235-bp جيدًا ، مما أعطى نطاقًا قويًا يتوافق مع amplicon المعدل (المعلومات الداعمة ، الشكل S2). هذا يدل على أن رد الفعل تيار مستمر ESQ TP لا يتفاعل النيوكليوتيد مع بوليميراز الحمض النووي (لا أثناء التمديد ولا عند استخدام الحمض النووي المعدل كقالب) وهو ركيزة جيدة وكتلة بناء للتوليف الإنزيمي لتحقيقات الحمض النووي المتفاعلة والمعدلة.

أ) توليف الحمض النووي المعدل سكوارامات (DNA_C ESQ ) والارتباط المتبادل مع Sulfo-Cy5-NH2، ليسين ، ثلاثي و ديكاببتيد. ب) تحليل SDS-PAGE لتضمين تيار مستمر ESQ TP في DNA باستخدام KOD XL polymerase ودرجة الحرارة 20 درجة مئوية. P: التمهيدي A (+): dNTPs الطبيعي (-): dNTPs الطبيعي بدون dCTP C ESQ: تيار مستمر ESQ TP، dGTP ، dTTP ، dATP. ج) تحليل SDS-PAGE لاقتران DNA_C ESQ (4.3 ميكرومتر) مع Ac-Lys (11 م م) ، ثلاثي الببتيد (11 م) ، و ديكاببتيد (11 م م). الشروط: محلول بورات (0.5 م ، درجة الحموضة 9) ، 37 درجة مئوية ، 36 ساعة. لتسلسل قليل النوكليوتيد ، انظر الجدول S1 في المعلومات الداعمة.

بعد ذلك ، اختبرنا تفاعلات الارتباط المتبادل لـ تيار مستمر ESQ الحمض النووي المرتبط بالأمينات والببتيدات (الشكل 1 أ ، ج). ردود أفعال 20 نقطة أساس DNA_C ESQ تم إجراؤها في درجة حرارة الغرفة في محلول بورات (درجة الحموضة 9). التفاعل مع Sulfo-Cy5-NH2 (100 equiv) أعطى المسمى الفلورسنت المطلوب DNA_C ESQCy5 (المعلومات الداعمة ، الشكل S3). ردود فعل مماثلة من DNA_C ESQ مع ثلاثي الببتيد المحتوي على Ac-Lys و Lys أو ديكاببتيد مع فائض كبير (حوالي 2500 مكافئ) من الببتيدات ، حيث لم يكن من المتوقع حدوث تأثير تقارب في هذه الببتيدات غير المرتبطة بالحمض النووي. في ظل هذه الظروف ، استمرت التفاعلات بكفاءة معتدلة وأعطت الاتحادات المترابطة المرغوبة DNA_C ESQLys , DNA_C ESQ3pept أو DNA_C ESQ10pept مع تحويلات 50 و 43 و 20٪ على التوالي (الشكل 1 ج). تم تمييز جميع الاتحادات وتأكيدها بواسطة MALDI MS (المعلومات الداعمة ، الجدول S4).

أخيرًا ، مسبار الحمض النووي التفاعلي DNA_C ESQ تم اختباره في التفاعلات مع البروتينات. استخدمنا ألبومين المصل البقري (BSA) كعنصر تحكم سلبي في بروتين يحتوي على 60 ليسينًا لا يتفاعل مع الحمض النووي ، وهو المجال الأساسي لـ p53 21 كبروتين مرتبط بالحمض النووي يحتوي على ليسين ولكن ليس في موقع الربط ، ومجموعة من المؤتلف H2A و H2B و H3.1 و H4 هيستونات ، كأمثلة على البروتينات الغنية بـ Lys التي ترتبط بقوة بالحمض النووي. تم إجراء تفاعلات الارتباط المتبادل مع 2 معادل فقط من البروتينات المقابلة. نظرًا لأنه من المعروف أن الهستونات تشكل ثنائيات وأوليغومرات ، فإننا نفترض أن هذه النسبة ربما تكون قريبة بشكل فعال من التساوي المولي. لكي نكون أقرب إلى الظروف الفسيولوجية ، استخدمنا الفوسفات (أو TRIS أو HEPES ، انظر الشكل S8 في المعلومات الداعمة) المخازن المؤقتة (الرقم الهيدروجيني 7.4).

في البداية ، أجرينا دراسة حركية بسيطة لتفاعل الارتباط المتبادل لـ DNA_C ESQ باستخدام هيستون H3.1 لإظهار أن التفاعل يصل إلى أقصى تحويل في 16-24 ساعة (المعلومات الداعمة ، الشكل S5). لذلك ، استخدمنا ردود فعل 36 ساعة في حالات أخرى لضمان تحويلات كافية. يوضح الشكل 2 نتائج تجارب الارتباط المتبادل مع البروتينات. من دواعي سرورنا ، ردود أفعال DNA_C ESQ مع جميع الهستونات الأربعة المؤتلفة ، أعطت الاتحادات التساهمية المترابطة المتشابكة مع حركة أقل على هلام SDS-PAGE تغيير طبيعة (الشكل 2 ب). كانت تحويلات هذه التفاعلات المحسوبة من SDS-PAGE 31 - 34٪ (المعلومات الداعمة ، الجدول S5). تم أيضًا تأكيد هوية اقتران بروتين DNA التساهمي مع H2B و H3.1 و H4 بواسطة SDS-PAGE مع تلطيخ البروتين (Coomassie Blue ، المعلومات الداعمة ، الشكل S7) ومن خلال تحليل HPLC-MS باستخدام التأين بالرش الكهربائي (دعم) المعلومات ، الأشكال S16 - S18). أيضًا ، منتج PEX أطول بقدرة 98 نقطة أساس يحتوي على 18 مجموعة مربعة تفاعلت مع هيستون H3.1 ، على الرغم من الحصول على خليط من المنتجات المتشابكة (المعلومات الداعمة ، الشكل S10). من ناحية أخرى، DNA_C ESQ لم يتقاطع مع BSA أو p53 (المعلومات الداعمة ، الشكل S9) أو مع بوليميريز الحمض النووي أثناء PEX أو PCR. تظهر هذه النتائج أن تأثير القرب (وجود ليسين (ق) بالقرب من موقع ربط الحمض النووي للبروتين) أمر حاسم للربط المتبادل الفعال في حالة عدم وجود فائض كبير من الببتيد أو البروتين.

أ) الربط المتبادل للحمض النووي المعدل سكوارامات (DNA_C ESQ ) مع بروتينات هيستون المؤتلفة. ب) تحليل SDS-PAGE لتجارب الارتباط المتبادل مع الحمض النووي الطبيعي أو المعدل والبروتينات المؤتلفة المختلفة (2 يكافئ البروتين إلى الحمض النووي): 17.5٪ هلام SDS-PAGE. الشروط: عازلة الفوسفات (4.5 م ، درجة الحموضة 7.4) ، 37 درجة مئوية ، 36 ساعة.

في الختام ، قمنا بتصميم وتصنيع dNTP جديد مرتبط بـ Squaramate (تيار مستمر ESQ TP) وأثبت أنه كان ركيزة جيدة جدًا لـ KOD XL DNA polymerase في تخليق PEX أو PCR لتحقيقات DNA التفاعلية. تتفاعل مجموعة التربيعات مع الأمينات لتشكيل رابطة تساهمية ثنائية التساهمية (سكواراميد). لقد أظهرنا أن تيار مستمر ESQ تفاعلت تحقيقات الحمض النووي المعدلة مع Cy5 المرتبط بالأمينو لتشكيل DNA المسمى الفلوريسنت. استمرت تفاعلاته مع الببتيدات المحتوية على Lys فقط عند وجود فائض كبير من الببتيد. من ناحية أخرى ، في التفاعلات مع بروتينات ربط الحمض النووي المحتوية على Lys ، حيث يساعد تأثير التقارب ، تستمر التفاعلات بتحويلات جيدة حتى في نسبة متساوية تقريبًا. مقارنةً باقتران DNA-Lys الذي تم الإبلاغ عنه سابقًا استنادًا إلى التحسين الاختزالي ، 11 ، 12 ، يستمر تعديل التربيع وتحويله إلى أميد مستقر في ظل الظروف الفسيولوجية (عند درجة الحموضة 7.4-9) ولا يتطلب أي كاشف خارجي (أي NaBH السام)3يستخدم النفثالينات المكلورة في التعيينات الاختزالية 11 ، 12). لذلك ، فإن هذا التعديل التفاعلي والمنهجية المقدمة لهما إمكانات جيدة في وضع العلامات بعد التخليق للحمض النووي ، و 22 اقترانًا حيويًا للحمض النووي مع الببتيدات أو البروتينات أو الجزيئات الحيوية الأخرى ، وكذلك في تجارب الربط المتقاطع لتحديد ودراسة البروتينات المرتبطة بالحمض النووي . مزيد من البحث على هذا المنوال جار في مختبرنا.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل الأكاديمية التشيكية للعلوم (جائزة Praemium Academiae لـ M. Ho.) ومؤسسة العلوم التشيكية (18-03305S إلى I. و M. Ho.). يشكر المؤلفون J. Konč (جامعة كامبريدج) للحصول على المشورة بشأن توصيف MS للاتحادات.

تضارب المصالح

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

كخدمة لمؤلفينا وقرائنا ، توفر هذه المجلة المعلومات الداعمة المقدمة من المؤلفين. تتم مراجعة هذه المواد من قبل الأقران ويمكن إعادة تنظيمها للتسليم عبر الإنترنت ، ولكن لا يتم تحريرها أو طباعتها. يجب توجيه مشكلات الدعم الفني الناشئة عن المعلومات الداعمة (بخلاف الملفات المفقودة) إلى المؤلفين.

اسم الملف وصف
anie201906737-sup-0001-misc_information.pdf2.7 ميغابايت تكميلي

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


الملخص

يعد الارتباط المتقاطع للفورمالديهايد مكونًا مهمًا في العديد من التقنيات ، بما في ذلك الترسيب المناعي للكروماتين والتقاط التشكل الصبغي. لا يزال الإجراء تجريبيًا وسيئ الميزات ، على الرغم من التاريخ الطويل لاستخدامه في البحث. لا يعرف الكثير عن خصوصية في الجسم الحي الترابط المتقاطع ، وكفاءته ، والعوامل الكيميائية الناتجة عن الإجراء. حان الوقت للبحث في هذا الصندوق الأسود.

نعتقد أنه من الضروري لفت الانتباه إلى عدم اليقين الذي تم تقديمه في النتائج التي تم الحصول عليها بواسطة ChIP والنهج الأخرى القائمة على تثبيت الفورمالديهايد من خلال حقيقة أن كفاءة الربط المتبادل للبروتينات المختلفة مع الحمض النووي وبعضها البعض تختلف اختلافًا جذريًا ، وفي حالة في الجسم الحي الارتباط المتقاطع ، قد يعتمد على الظروف المحلية داخل الأجزاء الخلوية المختلفة.

تتميز أبحاث الكروماتين الحالية بالتراكم السريع للبيانات على مستوى الجينوم حول توزيع البروتينات التنظيمية المختلفة على طول الكروموسومات. يمكن الوصول إلى هذه البيانات بسهولة من خلال قواعد البيانات المختلفة ، وقد تم بذل الكثير من الجهد لصب المزيد والمزيد من البيانات في الوعاء. ومع ذلك ، من المدهش أن العديد من العلماء لا يهتمون بصحة نهج الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP). تم تطوير إجراء ChIP & gt منذ 15 عامًا [1] ، وبشكل أساسي ، لا يزال البروتوكول الأصلي مستخدمًا دون إيلاء الكثير من الاهتمام لمشاكله الكامنة ، على الرغم من أنه كان هناك شعور منذ فترة طويلة بأن "الشيطان موجود في تفاصيل ChIP". الخطوة الأكثر إشكالية هي تثبيت الفورمالديهايد. من الشائع أن الفورمالديهايد يمكنه إصلاح أي مركب بروتيني DNA. ومع ذلك ، فإن هذا الافتراض بعيد كل البعد عن التحقق منه عالميا. على سبيل المثال ، لا يمكن تثبيت مثبط lac على DNA بواسطة الفورمالديهايد ، على الرغم من أن مجال ربط الحمض النووي الخاص به يحتوي على عدد من بقايا الأحماض الأمينية الأساسية [2]. تم الإبلاغ عن نفس الشيء لـ NF-B [3]. بالنسبة للمتخصصين في هذا المجال ، هناك مكونات الكروماتين التي يصعب ربطها بالمثل ، وقد تم تطوير بروتوكولات محددة لحل هذه المشكلة في بعض الحالات الفردية ، بشكل أساسي بطريقة تجريبية (انظر على سبيل المثال [4]). لقد ثبت أن هناك حدًا زمنيًا لتفاعلات الارتباط المتبادل بحيث أنه بمجرد أن ينخفض ​​وقت بقاء البروتين إلى & lt5 s ، يصبح "غير مرئي" للربط المتبادل للفورمالديهايد [5]. لا يزال إجراء تثبيت الفورمالديهايد تجريبيًا في الواقع ، ولا يُعرف الكثير عن خصوصية في الجسم الحي الارتباط المتبادل وكفاءته والمادة الكيميائية الناتجة عن هذا الإجراء. لذلك ، فإن العلماء الذين يجرون تجارب الارتباط المتبادل هم في الواقع عمياء ، وهذا يمكن أن يسبب مشاكل كبيرة في تفسير البيانات [6 ، 7].

في السنوات الأخيرة ، تم استخدام طرق (3C ، 4C ، Hi-C ، ChIA-PET ، إلخ) بناءً على إجراء التقاط التشكل الكروموسوم (3C) [8] على نطاق واسع لدراسة تفاعلات المحفز والمُحسِّن والأسئلة الأخرى المتعلقة بـ الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد للجينوم [9]. يعتمد بروتوكول 3C على افتراض أن مجمعات الحمض النووي والبروتينات المجمعة في الخلايا الحية يمكن إصلاحها عن طريق الفورمالديهايد ، وبعد ذلك ، بعد انقسام الحمض النووي بواسطة إنزيمات التقييد ، يمكن إذابة المجمعات التي تحتوي على تسلسلات تنظيمية عن بُعد مرتبطة بجسور بروتينية وتعريضها لعوامل مختلفة. العلاجات في المحلول. أظهرت الدراسات الحديثة من مجموعاتنا أن الأمر ليس كذلك. بدلاً من ذلك ، ينتج عن تثبيت الفورمالديهايد شبكة صلبة من ألياف الكروماتين التي تنجو من العلاج بكبريتات دوديسيل الصوديوم والإنزيمات التقييدية. على الرغم من أن شبكة الكروماتين المتشابكة هذه يمكن أن تتعطل عن طريق الصوتنة ، يبدو أن العديد من الاتصالات التي يمكن اكتشافها بين العناصر التنظيمية للحمض النووي ، مثل محفزات ومحفزات جينات بيتا غلوبين ، قد فقدت بعد هذا العلاج [10-12]. تجادل هذه النتائج في أنه في الخلايا الحية ، قد يكون الربط المتقاطع للعناصر الجينومية عبر الجسور التي تصنعها البروتينات التنظيمية حدثًا نادرًا نسبيًا مقارنة بالربط المتبادل لألياف الكروماتين عبر الهيستونات. قد يعكس هذا كلاً من التجاور غير المتكرر للمُحسِّنات والمُروِّجات وعدم كفاءة الربط المتبادل للفورمالديهايد. في الواقع ، هناك أمثلة معروفة تدل على أن تفاعلات المُحسِّن والمُعزِّز التي تم التقاطها بواسطة طرق 3C لا ترتبط بتجميع هذه العناصر في الجسم الحي يعاير بالمجهر [13]. من ناحية أخرى ، تم الإبلاغ عن أن الفورمالديهايد غير فعال للربط المتبادل للبروتينات غير المرتبطة مباشرة بالحمض النووي ، مثل المُنشّطات النسخية وعوامل الضغط [14 ، 15].

تثير هذه الملاحظات المزيد من الأسئلة: "هل هناك اختلافات بين كفاءة الربط المتبادل في euchromatin و heterochromatin ، وإذا كان الأمر كذلك ، فكيف ترتبط ببيانات 3C على مستوى الجينوم؟" على سبيل المثال ، Sanyal وآخرون. أبلغت عن تردد اتصال 5C أعلى في مناطق الكروماتين المفتوحة [16] ، ولكن من غير الواضح ما إذا كانت هذه النتيجة قد تكون جزئيًا بسبب القيود التقنية لتقنية 3C التي تفضل الربط المتبادل للكروماتين المفتوح. في دراسة أخرى من نفس المختبر ، تبين أنه في الكروموسومات الانقسامية فقد كل من الفصل المكاني واسع النطاق والمجالات المرتبطة طوبولوجيًا [17] ، ولكن حتى اليوم ، لا يمكن استبعاد احتمال أن يكون هذا النمط جزئيًا بسبب الارتباط العرضي غير الفعال للفورمالديهايد للكروماتين شديد التكثيف للكروموسومات الانقسامية. من ناحية أخرى ، يبدو أن القدرة على اكتشاف جهات الاتصال 3C تعتمد على الحفاظ على بنية النوى غير المحببة [10]. نظرًا لعدم وجود نواة في الانقسام الفتيلي ، فقد يكون غياب هذه البنية / المقصورات النووية التي قد تكمن وراء عدم وجود جهات اتصال 3C في الانقسام. تم الحصول على نتائج أكثر إثارة للقلق من تحليل ChIP-seq لتوزيع مجمع منظم المعلومات الصامت (Sir) في خميرة الخميرة. اكتشف مؤلفو هذه الدراسة الإثراء الاصطناعي للعديد من البروتينات غير ذات الصلة ، بما في ذلك مجمع الإسكات بأكمله ، في الجينات المعبر عنها بشكل كبير ، مما يدعو إلى التشكيك في نتائج بعض دراسات ChIP المنشورة سابقًا [6]. ترتبط الظاهرة المرصودة على الأرجح بوجود ما يسمى بالمناطق المستهدفة ذات الإشغال العالي أو "النقاط الساخنة" حيث تعرض العديد من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي إشارة التخصيب على الرغم من عدم وجود في المختبر موقع الربط في تسلسل الحمض النووي الأساسي [18].

إن كيمياء الترابط المتقاطع للفورمالديهايد معروفة جيدًا [1 ، 19] ، لكنها في الجسم الحي جوانب التقنية التي تظل غامضة. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن تثبيت الفورمالديهايد لتحفيز استجابة تلف الحمض النووي والبولي (ADP-ribosyl) الضخم للبروتينات النووية ، وبالتالي تغيير تركيبة الكروماتين وإدخال التحيز في تحليل ChIP [7]. يمكن عكس الروابط المتقاطعة الناتجة عن معالجة الفورمالديهايد بشكل كامل وسهل عن طريق التسخين وانخفاض درجة الحموضة ، مما يسمح بإجراء مزيد من التحليلات لكل من البروتينات والحمض النووي. في الوقت نفسه ، تثير درجة الحرارة والاعتماد على الأس الهيدروجيني لتفاعل الارتباط المتبادل سؤالًا عن ثبات مجمعات الدنا والبروتين التي تم الحصول عليها في ظل ظروف مختلفة في تطبيقات مختلفة. من الممكن أن تؤثر الاختلافات الطفيفة في الظروف التي يتم بموجبها إجراء الربط المتبادل بشكل كبير على كفاءة الربط المتبادل و / أو استقرار المنتجات المترابطة. قد لا ينطبق هذا فقط على الخلايا الكاملة ولكن أيضًا على الأجزاء المحلية داخل الخلايا التي قد تكون مدمجة في بيئات دقيقة فيزيائية كيميائية مختلفة في النطاق النانوي لمجالات الكروموسوم. وبالتالي ليس من الواضح إلى أي مدى تعكس ملامح ChIP توزيع البروتين قيد الدراسة ، وإلى أي مدى ظروف الارتباط المتقاطعة المحلية. يُظهر تاريخ البحث أمثلة رائعة لاستنتاجات معاكسة تم إجراؤها بناءً على نتائج الربط المتبادل الذي تم إجراؤه بطرق مختلفة قليلاً [20].

لذلك نود أن نلفت انتباه الباحثين إلى ضرورة إعادة النظر في الخطوات الأساسية للبروتوكولات التجريبية الشائعة الاستخدام. بقدر ما أو إلى هذا الحد في الجسم الحي فيما يتعلق بالربط المتبادل للفورمالديهايد ، فقد حان الوقت بالتأكيد لقلب بعض الافتراضات المقبولة على نطاق واسع. تشير جميع الأدلة إلى أنه لم يعد من الممكن استخدام الربط المتقاطع للفورمالديهايد كما لو كان الدواء الشافي للبيولوجيا الجزيئية. حان الوقت للبحث في هذا الصندوق الأسود: تحقق من ملف في الجسم الحي علم الأحياء الجزيئي ، ونتائجه على جمع البيانات في تقنيات ChIP-seq و "C" ، وحدوده ، وكذلك لاستكشاف التحسينات والبدائل الممكنة.

يشيع استخدام الربط المتقاطع للفورمالديهايد لفحص بنية الكروماتين ولكنه يظل تقنية "الصندوق الأسود" غير مفهومة جيدًا.


التشابك المتشابك للحمض النووي من خلال "نقرة" محسن الإقحام

تشكل عوامل الارتباط المتصالب بين الدنا والحمض النووي عائلة مهمة من العلاجات الكيميائية التي لا تتفاعل بشكل خاص مع محبي النواة الذاتية وبالتالي تظهر آثارًا جانبية غير مرغوب فيها. نُبلغ هنا عن مشتق ديمو كاتيوني من Sondheimer "DiMOC" الذي يُظهر إقحامًا ضعيفًا وقابلًا للانعكاس في DNA مزدوج (كد= 15 ميكرومتر) حيث يخضع للربط المتقاطع الذي يشجعه إجهاد ترادفي للحمض النووي المحتوي على أزيد لإعطاء روابط متشابكة بين الحمض النووي والحمض النووي (ICLs) مع ثابت معدل ظاهر مرتفع بشكل استثنائي كتطبيق= 2.1 × 10 5 م -1 ث -1. يمثل هذا زيادة بمعدل 21000 ضعف مقارنة بالتفاعل بين DIMOC و 5- (azidomethyl) -2′-deoxyuridine (AmdU) nucleoside. كعوامل مفردة ، أظهر 5′-bispivaloyloxymethyl (POM) -AmdU و DiMOC سمية خلوية منخفضة ، ولكن تم إنشاء ICLs DNA-DNA شديدة السمية عن طريق الدمج الأيضي لمجموعات AmdU في الحمض النووي الخلوي ، متبوعًا بمعالجة الخلايا باستخدام DiMOC. توفر هذه النتائج الأمثلة الأولى للتفاعلات الكيميائية المتعامدة الحيوية المعززة بالاقحام على الحمض النووي ، علاوة على ذلك ، أول تفاعلات النقر المزدوج (SPDC) المعززة بالسلالة داخل الخلايا الحية.

كخدمة لمؤلفينا وقرائنا ، توفر هذه المجلة المعلومات الداعمة المقدمة من المؤلفين. تتم مراجعة هذه المواد من قبل الأقران ويمكن إعادة تنظيمها للتسليم عبر الإنترنت ، ولكن لا يتم تحريرها أو طباعتها. يجب توجيه مشكلات الدعم الفني الناشئة عن المعلومات الداعمة (بخلاف الملفات المفقودة) إلى المؤلفين.

اسم الملف وصف
anie201808054-sup-0001-misc_information.pdf3.2 ميغابايت تكميلي

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


التشابك المتشابك للحمض النووي من خلال "النقر" المعزز الإقحام

تشكل عوامل الربط المتصالب بين الدنا والحمض النووي عائلة مهمة من العلاجات الكيميائية التي لا تتفاعل بشكل خاص مع محبي النوكليوفيلات الداخلية وبالتالي تظهر آثارًا جانبية غير مرغوب فيها. هنا نُبلغ عن مشتق ديمو كاتيوني من Sondheimer "DiMOC" الذي يُظهر إقحامًا ضعيفًا وقابلًا للانعكاس في DNA مزدوج (كد= 15 ميكرومتر) حيث يخضع للربط المتقاطع الذي يشجعه إجهاد ترادفي للحمض النووي المحتوي على أزيد لإعطاء روابط متشابكة بين الحمض النووي والحمض النووي (ICLs) مع ثابت معدل ظاهر مرتفع بشكل استثنائي كتطبيق= 2.1 × 10 5 م -1 ث -1. يمثل هذا زيادة بمعدل 21000 ضعف مقارنة بالتفاعل بين DIMOC و 5- (azidomethyl) -2′-deoxyuridine (AmdU) nucleoside. كعوامل مفردة ، أظهر 5′-bispivaloyloxymethyl (POM) -AmdU و DiMOC سمية خلوية منخفضة ، ولكن تم إنشاء ICLs DNA-DNA شديدة السمية عن طريق الدمج الأيضي لمجموعات AmdU في الحمض النووي الخلوي ، متبوعًا بمعالجة الخلايا باستخدام DiMOC. توفر هذه النتائج الأمثلة الأولى للتفاعلات الكيميائية المتعامدة الحيوية المعززة بالاقحام على الحمض النووي ، علاوة على ذلك ، أول تفاعلات النقر المزدوج (SPDC) المعززة بالسلالة داخل الخلايا الحية.

كخدمة لمؤلفينا وقرائنا ، توفر هذه المجلة المعلومات الداعمة المقدمة من المؤلفين. تتم مراجعة هذه المواد من قبل الأقران ويمكن إعادة تنظيمها للتسليم عبر الإنترنت ، ولكن لا يتم تحريرها أو طباعتها. يجب توجيه مشكلات الدعم الفني الناشئة عن المعلومات الداعمة (بخلاف الملفات المفقودة) إلى المؤلفين.

اسم الملف وصف
anie201808054-sup-0001-misc_information.pdf3.2 ميغابايت تكميلي

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


أساليب

البروتينات المؤتلفة وقوالب الحمض النووي

المؤتلف هيستونات الأساسية من Xenopus laevis تم التعبير عن الرابط البشري هيستون H1.4 وتنقيته كما هو موصوف من قبل 7،29 انظر الطرق التكميلية للحصول على التفاصيل). تم شراء رابط الدجاج هيستون H5 من Abcam (ab81966).

تم الإفراط في التعبير عن SCML2 البشري كامل الطول (Q9UQR0) و SCML2 delta preSAM في BL21 CodonPlus (DE3) -RIL (ستراتاجين ، لا جولا ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع محطة C له6- العلامة وتنقيتها بواسطة كروماتوغرافيا Ni 2+ -NTA (انظر الطرق التكميلية للحصول على التفاصيل).

تم إنشاء dsDNA-oligonucleotide (21 نقطة أساس) عن طريق صلب اثنين من قليل النيوكليوتيدات التكميلية (الشكل التكميلي 1i 21bp-fwd ، 21bp-rev) 29 و 5'- المسمى بـ T4 polynucleotide kinase و γ- [32 P] -ATP (6000 Ci / mmol) باتباع الإجراءات القياسية.

تم إنشاء شظايا الحمض النووي لإعادة تكوين أحادي النواة عن طريق هضم البلازميدات التالية: pUC18_52 × 187 70 لشظايا 187 نقطة أساس (AvaI) و 171 نقطة أساس (هضم مع AvaI و NotI) و pUC18_16 × 145 (هدية من Song Tan 71) (هضم مع EcoRV) للجزء 145 نقطة أساس. تم عزل قوالب إعادة التكوين كما هو موصوف 72. تم إنشاء 13 C / 15 N-المسمى 187 نقطة أساس DNA بواسطة PCR في ظل ظروف قياسية باستخدام الحمض النووي غير المسمى 187 نقطة أساس كقالب و 13 C / 15 N-dNTPs (Sigma Aldrich Silantes GmbH). تم سرد تسلسل التمهيدي في الشكل التكميلي. 1i (187-fwd ، 187-rev). تم إنشاء الحمض النووي Biotinylated 187 bp بواسطة PCR باستخدام نفس التمهيدي العكسي ولكن يحتوي على علامة بيوتين 5 بوصة في التمهيدي 187 fwd. أعيد تكوين قليل النوكليوسومات على قالب DNA 12 × 200 × 601 الذي تم تحضيره كما هو موصوف من قبل 29،30،73.

إعادة تشكيل الكروماتين

أعيد تشكيل صفائف قليل النواة وجزيئات النواة النواة عن طريق غسيل الكلى المتدرج الملحي 74 باستخدام أوكتامر بروتين هيستون المؤتلف و 12 × 200 × 601 أو قوالب الحمض النووي 187 × 601. تمت إضافة هيستونات رابط إلى خليط إعادة التكوين بكميات متكافئة في بداية غسيل الكلى 29. تم تحديد تركيز oligonucleosomes المعاد تكوينه والجزيئات الأساسية nucleosomal عن طريق قياس A260. وبالتالي تعكس جميع التركيزات الكتلية والمولية محتوى الحمض النووي.

ربط عبر الأشعة فوق البنفسجية

تم إجراء الربط المتبادل للمجمعات المعاد تشكيلها في المختبر عن طريق اكتشاف 50 ميكرولتر من معقدات البروتين والحمض النووي على كتلة معدنية مغلفة بالبارافيلم على الجليد. تم إجراء التشعيع عند 254 نانومتر باستخدام جهاز ربط متقاطع مبني داخليًا كما هو موصوف 8.

تم تحضين جميع مجمعات هيستون رابط DNA في محلول XL (20 ملي مولار Tris-HCl pH 7.5 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم) لمدة 30 دقيقة على الجليد قبل التشعيع عند 254 نانومتر. للربط المتبادل مع شظايا الحمض النووي 187 bp biotinylated تم تحضين 0.25 nmol nmol biotinylated-DNA و 0.225 nmol linker هيستونات في 40 ميكرولتر عازلة XL وتم تعريضها للإشعاع لمدة 0 أو 2 أو 3 أو 5 أو 10 دقيقة عند 254 نانومتر. تمت إضافة خليط التفاعل إلى 40 ميكرولتر من الخرز المغنطيسي المطلي بالستربتافيدين (MagneSphere ، Promega) في 1 مل PD300 (20 ملي مولار HEPES-KOH pH 7.8 ، 0.3 M KCl ، 0.2 ملي مول EDTA ، 10٪ [حجم / حجم] جلسرين ، 0.2٪ [v / v] Triton X-100) وحضنت لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية تحت التناوب. تم غسل الحبيبات 4 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام 1 مل PD800 (PD300 ولكن 0.8 M KCl) من أجل رابط هيستون H5 أو PD1000 (1 M KCl) عند استخدام H1.4. تمت إزالة البروتينات المرتبطة عن طريق احتضان الخرزات المغناطيسية في المخزن المؤقت لعينة SDS لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية. تم فصل العينات بواسطة SDS-PAGE وتحليلها بواسطة النشاف الغربي ضد هيستون H1 (anti-H1 ، 1: 1000 ، Active Motif 61201 للحصول على التفاصيل ، انظر الطرق التكميلية).

تحتوي التجارب التي تستخدم أليغنوكليوتيد dsDNA على 100 pmol H5 أو H1.4 و 1 pmol [32 P] أوليغنوكليوتيد dsDNA المسمى ، والتي تم ربطها بشكل متقاطع لمدة دقيقتين (H5) أو 2 ، 5 ، أو 10 دقائق (H1.4). تم فصل العينات المتشابكة بواسطة SDS-PAGE و Coomassie-stained and autoradiographed. يتم عرض عمليات المسح الهلامية والصور الشعاعية التلقائية غير المعالجة في الشكل التكميلي .18.

احتوت تجارب الارتباط المتبادل مع 187 نقطة أساس من الحمض النووي وهستونات الوصلة لتحليل MS على 50 ميكروغرام من الحمض النووي (0.43 نانومول) و 33.5 ميكروغرام من H5 (1.6 نانومول) أو 30 ميكروغرام من H1.4 (1.4 نانومول) في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت XL. تم تشعيع العينات لمدة 5 أو 10 دقائق عند 254 نانومتر. قليل النوكليوسومات ، وكذلك X. laevis تم ربط أحاديات النواة (كل 60 ميكروغرام) لمدة 10 دقائق عند 254 نانومتر في أي من المخزن المؤقت لإعادة التكوين (10 ملي مولار Tris-HCl الأس الهيدروجيني 7.5 ، 25 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ، 2 ملي مولار DTT) أو كلوريد الصوديوم و MgCl2 إلى تركيز نهائي قدره 150 ملي مولار و 1 ملي مولار ، على التوالي. كان حجم التفاعل بين 150 و 250 ميكرولتر اعتمادًا على تركيز النوكليوسوم.

بالنسبة للربط المتقاطع لـ SCML2-nucleosome ، تم تحضين 50 ميكروغرام من النيوكليوسومات أو 50 ميكروغرام من النيوكليوسومات + H1.4 مع 23.5 ميكروغرام SCML2 (يساوي SCML2 المولي: نسبة الحمض النووي النووي 0.75) في المخزن المؤقت لإعادة تكوين الملح المنخفض لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الحجم النهائي 400 ميكرولتر.

تضمنت كل تجربة ربط متبادلة تتضمن عينات هيستون المؤتلف عينة غير مترابطة كعنصر تحكم لم يتم تشعيعه ولكن تم علاجه بطريقة مماثلة أثناء تحضير العينة.

تم عزل النوى من خلايا HeLa S3 عن طريق تحلل ناقص التوتر والاضطراب الميكانيكي 76 أو عن طريق تحلل الخلايا NP-40 77. للربط المتبادل ، تم تعليق نوى 5 × 10 7 في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع مثبطات الأنزيم البروتيني (روش ، خالي من EDTA).

تم تعريض نوى HeLa و mononucleosomes الأصلية المنقاة من خلايا HeLa البشرية (52039 BPS Bioscience) للإشعاع (254 نانومتر) في طبق بتري زجاجي لمدة 10 دقائق على الجليد 8).

إثراء الروابط المتقاطعة المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية لتحليل التصلب المتعدد

تم إجراء تخصيب الروابط المتقاطعة المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية وفقًا للبروتوكولات المعمول بها للربط المتبادل لبروتين الحمض النووي الريبي 8،27،75 مع التعديلات. تم تكميل العينات المشعة بالأشعة فوق البنفسجية وعينات التحكم بـ 1 ملي مولار MgCl2 و 250 نوكلياز عالمي بيرس ™ (88700 ، Thermo Fisher Scientific) وحضنت لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. تم ترسيب البروتينات والبروتينات المترابطة مع الأسيتون وتم إذابة الكريات أولاً في 4 ميكرولتر من اليوريا ، و 50 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك Tris-HCl 7.9 ثم تم تخفيفها إلى 1 ميكرومتر من اليوريا عن طريق إضافة ثلاثة أحجام من 50 ملي مولار Tris-HCl pH 7.9. تم تحلل الحمض النووي بشكل إضافي عن طريق إضافة 250 يو بنزوناز وحضنت لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية. تم إجراء التحلل المائي للبروتين بإضافة التربسين (درجة التسلسل ، بروميغا) بنسبة كتلة 1:20. بعد الحضانة طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، تمت إضافة 12.5 وحدة إضافية من benzonase HC لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية متبوعة بإضافة التربسين بنسبة 1:20 لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. Samples were desalted using C18 columns (ReproSil-Pur 120 Å, 5 μm, C18-AQ, Dr. Maisch, Germany) packed in-house as described for RNA-protein cross-links 8 . Desalted samples were enriched for cross-links by using in-house packed TiO2 columns (Titansphere 5 μm GL Sciences, Japan). Samples were dissolved in buffer A (5% [v/v] glycerol, 80% [v/v] acetonitrile, 5% [v/v] trifluoroacetic acid (TFA)) and applied to TiO2 columns pre-washed with buffer B (80% [v/v] acetonitrile, 5% [v/v] TFA) followed by equilibration with buffer A. After sample application, the columns were washed three times with buffer A, four times with buffer B and once with buffer B2 (60% [v/v] acetonitrile, 0.1% [v/v] TFA). Samples were eluted with buffer C (0.3 M NH4OH, pH 10.5). The elution step was repeated twice. The eluate was dried in a speed vac.

Enrichment of cross-links from native mononucleosomes

Nucleosomes were ethanol-precipitated and the pellet was dissolved in 4 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 7.9. Then, the sample was diluted to 1 M urea by adding three volumes of 50 mM Tris-HCl pH 7.9. 500 U Quick CIP (M0525S, NEB) were added and the sample was incubated for 2 h at 37 °C. 1 mM MgCl2, 1 kU of Pierce ™ universal nuclease, 20 U of DNase I (M0303S, NEB) and 1 kU of nuclease P1 (M0660S, NEB) were added for 2 h at 37 °C. Lys-C (mass-spec grade, Promega) was then added in a 1: 50 enzyme-to-protein ratio and the sample was incubated at 37 °C for 2 h. Trypsin digestion (1: 20 enzyme-to-protein ratio) was performed overnight at 37 °C. Finally, 1 kU of Pierce ™ universal nuclease were added to the sample following incubation at 37 °C for 2 h. The sample was desalted and enriched as described for recombinant histone samples. The resulting eluate was dried in a speed vac and dissolved in 10 mM NH4OH pH10, 5% [v/v] acetonitrile (ACN). One-twentieth of the material was directly subjected to LC-MS/MS measurement as input sample. Residual peptides were loaded onto an Xbridge C18 column (186003128, Waters) using an Agilent 1100 series chromatography system. The column was operated at a flow rate of 60 μl/min with a buffer system consisting of 10 mM NH4OH pH10 (buffer A) and 10 mM NH4OH pH10, 80% [v/v] ACN (buffer B). The column was equilibrated with 5% buffer B and developed over 64 min using the following gradient: 5% buffer B (0–7 min), 8–30% buffer B (8–42 min), 30–50% buffer B (43–50 min), 90–95% buffer B (51–56 min), 5% buffer B (57–64 min). The first 6 min were collected as one flow-through fraction, followed by 48 ×1 min fractions, which were reduced to 12 fractions by concatenated pooling. The fractions were dried in a speed vac.

Chromatin precipitation-based enrichment of UV-induced cross-links from HeLa nuclei for MS analysis

Nuclei were collected and pelleted at 1200×ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. Chromatin isolation from cross-linked nuclei was performed as described 57 . 2.5–5 × 10 7 nuclei were digested with RNaseA (Thermo Fisher Scientific), followed by SDS and urea wash steps. After the final SDS wash step, the pellet was covered with 0.5 ml storage buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, 10% glycerol, 1× protease inhibitors) and sonicated in a cooled water bath for 15 min, in alternating 30 s ‘on’ and 30 s ‘off’ cycles at the highest intensity setting (Bioruptor, Diagenode). Protein concentration was determined by a Bradford assay. The sonicated chromatin was adjusted to 0.05% SDS/1 mM MgCl2 and 250 U of Pierce universal nuclease were added. DNA digest was performed for 1 h at 37 °C and the reaction was stopped by adding five volumes of 100% acetone. After acetone precipitation the pellet was covered with 50 μl urea buffer (4 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2) and sonicated in a cooled water bath for 10 min, in alternating 30 s ‘on’ and 30 s ‘off’ cycles at the highest intensity setting. The urea concentration was adjusted to 1 M with 50 mM Tris-HCl pH 7.5/1 mM MgCl2 and 250 U universal nuclease (Pierce) were added for 2 h at 37 °C. Trypsin digest was performed overnight at 37 °C with a 1:20 ratio of trypsin to protein. Peptides were desalted using a Sep-Pak tC18 1 cc Vac cartridge (Waters), followed by TiO2 affinity chromatography as described for histone proteins.

SEC-based Enrichment of UV-induced cross-links from HeLa nuclei for MS analysis

2.5–5 × 10 7 HeLa nuclei were collected and pelleted at 600×ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. Genomic DNA was isolated using DNAzol ™ reagent (Invitrogen ™ ) according to manufacturer’s instructions. Isolated DNA was dissolved in 8 mM NaOH and sonicated at 30% for 30 s (SFX150, tip diameter 3/32” (2.4 mm)). DNA was then ethanol-precipitated and dissolved in 1% SDS. The SDS concentration was diluted 1:10 and trypsin was added in a 1:60 enzyme-to-protein ratio. After overnight incubation at 37 °C, DNA was ethanol-precipitated and then dissolved in 4 M urea. Urea concentration was adjusted to 1 M and 40 μg of RNaseA and 4000 U of RNase T1 (Thermo Fisher Scientific) were added following incubation for 2 h at 37 °C. After ethanol-precipitation, the pellet was dissolved in 4 M urea following centrifugation at 17,000×ز لمدة دقيقتين. The supernatant was loaded onto a Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare) operated at a flow rate of 500 μl/min in 50 mM Tris/HCL pH 7.5, 2 mM EDTA. Fractions of 500 μl were collected and those containing both DNA and peptides were pooled and ethanol-precipitated. The pellet was dissolved in 4 M urea and then diluted 1:4. 1 mM MgCl2, 1000 kU of Pierce ™ universal nuclease and 1 kU of nuclease P1 were added following incubation for 3 h at 37 °C. Another trypsin digest was performed overnight at 37 °C. The sample was desalted using a Sep-Pak tC18 1 cc Vac cartridge, following TiO2 affinity chromatography as described before.

SDS-PAGE and in-gel digest of proteins from native mononucleosomes for proteomics

Ten microgram of native mononucleosomes were loaded onto a 4–12% NuPAGE Bis-Tris Gel (Invitrogen) and separated by SDS-PAGE. The entire lane was cut from the gel and into 23 slices that were treated according to 78 (See Supplementary Methods for details). Peptides were dried in a speed vac followed by ESI-MS/MS analysis. A scan of the coomassie stained gel is displayed unprocessed in Supplementary Fig. 18.

LC-MS/MS analysis

Sample pellets from TiO2 enrichment, high-pH reversed-phase chromatography or in-gel digestion were dissolved in 2% [v/v] acetonitrile, 0.05% [v/v] TFA. LC-MS/MS analyses were performed on Q Exactive mass spectrometers Plus, HF, HF-X or Exploris (Thermo Fisher Scientific) coupled to a nanoflow liquid chromatography system (1100 series, Agilent Technologies). Analytes were loaded on either an in-house-packed trapping column (2 cm ReproSil-Pur 120 Å, 5 μm, C18-AQ inner diameter, 150 μm) or a Pepmap 300 C18 column (Thermo Fisher Scientific) at a flow rate of 10–15 μl/min in buffer A (0.1% [v/v] formic acid) and washed for 3 min with buffer A. The sample was separated on an in-house-packed C18 column (30 cm ReproSil-Pur 120 Å, 3 μm, C18-AQ inner diameter, 75 μm) at a flow rate of 300 nl/min. Sample separation was performed using a linear gradient and a buffer system consisting of 0.1% [v/v] formic acid (buffer A) and 80% [v/v] acetonitrile, 0.08% [v/v] formic acid (buffer B). Linker histone-DNA cross-links were analyzed with a 38-min LC run, cross-linked X. laevis mononucleosomes, oligonucleosomal arrays, SCML2-nucleosome samples and native HeLa mononucleosomes were separated over 58 min and HeLa nuclei over 90 min. For histone-DNA and (oligo)nucleosome samples the column was equilibrated with 1% buffer B for 5 min and elution was performed with a linear gradient (2–48% B) over 19 or 44 min, followed by a wash step at 90% B and 95% B for 5 min each. For HeLa nuclei samples the column was equilibrated with 3% buffer B for 5 min and elution was performed with a linear gradient from 8 to 48% B over 75 min, followed by a wash step at 90% B and 95% B for 5 min each. Eluting peptides and heteroconjugates were analyzed online in positive mode using a data-dependent top 10, 15, 20, or 30 acquisition methods. MS1 and MS2 resolution were set to 120,000 and 30,000 FWHM, respectively for cross-link samples and to 60,000 and 15,000 FWHM for proteomics samples from in-gel digest. AGC targets were set to 10 6 and 10 5 . Precursors selected during MS1 scans (scan range م / ض 350-1600) were fragmented using higher-energy collision-induced dissociation (HCD) fragmentation. All MS/MS experiments with chromatin, SCML2, native mononucleosomes and HeLa nuclei employed 28% or 30% normalized collision energy (NCE). Linker histone-DNA samples were initially analyzed at 20%, 25%, and 30% NCE to test fragmentation behavior of heteroconjugates. Other MS/MS parameters were set as follows: isolation width, 1.4–1.6 م / ض dynamic exclusion, 9 s for cross-link samples, 30 s for proteomics samples max. injection time (MS1/MS2), 50 ms/120 ms or 50 ms/60 ms. The lock mass option (م / ض 445.120025) was used for internal calibration.

Data analysis with MaxQuant

Proteomic analysis of MS-data from in-gel-digested native mononucleosomes and from cross-linked and non-cross-linked SCML2 samples was performed using MaxQuant software (version 1.6.0.1, 79 . For database search, a reviewed human database from Uniprot (downloaded 25.01.2019, 20,413 proteins) or a database containing all core histone sequences plus the SCML2 sequence was used for native mononucleosomes and SCML2 samples, respectively. Carbamidomethylation of cysteines was set as fixed and oxidation of methionines, as well as N-terminal acetylation were set as variable modifications. The maximum number of missed cleavages was set to two. The proteins from the output data were filtered for >2 unique peptides. For native mononucleosomes, the resulting list of proteins was used to create a sequence database for RNP xl cross-link search.

Data analysis with RNP xl

Data analysis and spectra validation were performed as described in 8 with the RNP xl tool 20 in the OpenMS software network (https://www.openms.de/, Version 2.5.0). Briefly: Raw files were converted to the.mzML format, centroided and spectra matching to linear peptides and phosphopeptides were filtered out. If a control sample was present, it was aligned with the cross-link sample based on retention time and spectra corresponding to features also present in the control sample were removed. The filtered.mzML files were subjected to RNP xl analysis (for DNA settings see Supplementary Fig. 1c, d, e). For linker-histone experiments, as well as for the initial analysis of chromatin-precipitation based in nucleo dataset (Supplementary Data 7, Chrtnprec_RNPxl_settings#1), we searched for C and T adducts only. The data obtained from reconstituted nucleosomes, native mononucleosomes and SEC-enriched in nucleo sample were searched including A, C, G and T adducts. In a second analysis of the chromatin-precipitation based in nucleo sample (Supplementary Data 7, Chrtnprec_RNPxl_settings#2) we also set up a search including A, C, G, and T. Other RNP xl search parameters were set as follows: max. DNA adduct length, 4 م / ض mass tolerance (MS1/MS2), 6 ppm/20 ppm max. missed cleavages (HeLa nuclei/histones, chromatin, SCML2), 2/3. For a detailed documentation of OpenMS based cross-link data analysis, please refer to s.

Quantification of cross-links

Skyline software (https://skyline.ms) was used to measure quantitative differences in identified SCML2-DNA cross-link precursors using the MS1 scans from nucleosome and nucleosome+H1 samples. A library was generated containing all transitions (ن = 74) derived from cross-link data with SCML2 to extract precursor ion chromatograms (XIC). Picked precursors were examined manually for the presence of at least two isotope peaks and, when present, in a ± 2 min time window of measured retention times and an م / ض match tolerance of ±5 ppm. For each transition the ratio of XIC[nucleosome]:XIC[nucleosome+H1] was calculated and XIC ratios were compared for cross-links to deoxyribose and thymine.

For spectral counting based cross-link quantification, we counted manually validated cross-link spectra from RNP xl searches (CSMs, see Supplementary Note 1 for quality criteria) and divided this number by the total number of manually validated CSMs identified in the respective sample. In case of SCML2 data, the CSM count of individual cross-link sites was divided by the total number of SCML2 peptide spectrum matches (PSMs) that were identified by MaxQuant database search of the same sample.

Modeling of nucleosome structures

In order to generate a tetranucleosome model in which protein-DNA cross-links were satisfied, the cryo-EM structure of the 12 × 177bp chromatin fiber (EMD-2600 46 was adjusted. The fitted cryo-EM models were kindly provided by Prof. Ping Zhu (Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences). The relative position of each nucleosome within an adjacent pair, were adjusted by sliding each nucleosome past one another by approximately 10 Å which brought H2A, H2B, and H4 of each nucleosome unit together with the DNA of the adjacent unit. Cross-links between H2A Lys-95, H2B Lys-105, H2B Lys-113, and H4 Val-60 to any DNA backbone were monitored during translation to identify a position which brought each cross-link distance to within 10 Å distance. The overall model of the cross-link-satisfied tetranucleosome, differs through only relative positioning of the nucleosome stacks.

Gel-shift assays

Five picomole mononucleosomes were incubated with 0.5, 1.0, or 2.0 molar equivalents of recombinant SCML2. In the gel shift assays testing SCML2’s binding to linker DNA, unmodified nucleosomes reconstituted on 145, 171, or 187 bp template DNA were incubated with FL SCML2. In the assays testing the effect of the H1.4 linker histone, unmodied and H1.4-containing nucleosomes were incubated with FL SCML2. In the assays testing the effect of the preSAM region, unmodified and H1.4-containing nucleosomes were incubated with recombinant FL and delta preSAM SCML2. The reactions were performed in 10 mM Tris.HCl pH 7.9, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA and 1 mM DTT for 1 h, at 300 rpm and 16 °C. The protein-nucleosome complexes were resolved on 1% agarose in 18 mM Tris and 18 mM boric acid at 100 V for 1 h at 4 °C and stained after the run with EtBr. All gel-shift assays are displayed unprocessed in Supplementary Fig. 18.

ملخص التقارير

يتوفر مزيد من المعلومات حول تصميم البحث في Nature Research Reporting Summary المرتبط بهذه المقالة.


Evaluation of inhaled low-dose formaldehyde-induced DNA adducts and DNA–protein cross-links by liquid chromatography–tandem mass spectrometry

As a widespread industrial chemical, formaldehyde carcinogenicity has been highly controversial. Meanwhile, formaldehyde is an essential metabolite in all living cells. Previously, we have demonstrated exogenous formaldehyde causes DNA adducts in a nonlinear manner between 0.7 and 15.2 ppm using [ 13 CD2]-formaldehyde for exposure coupled with the use of sensitive mass spectrometry. However, the responses from exposure to low doses of formaldehyde are still unknown. In this study, rats were exposed to 1, 30, and 300 ppb [ 13 CD2]-formaldehyde for 28 days (6 h/day) by nose-only inhalation, followed by measuring DNA mono-adduct (N 2 -HOMe-dG) and DNA–protein crosslinks (dG-Me-Cys) as formaldehyde specific biomarkers. Both exogenous and endogenous DNA mono-adducts and dG-Me-Cys were examined with ultrasensitive nano-liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Our data clearly show that endogenous adducts are present in all tissues analyzed, but exogenous adducts were not detectable in any tissue samples, including the most susceptible nasal epithelium. Moreover, formaldehyde exposure at 1, 30 and 300 ppb did not alter the levels of endogenous formaldehyde-induced DNA adducts or DNA–protein crosslinks. The novel findings from this study provide new data for risk assessment of exposure to low doses of formaldehyde.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


Cross-linking and cross-link reversal for ChIP - (Mar/07/2006 )

Right - a few months ago I started 'ChIPing' using the Upstate kit. I have optomised the sonication (thanks to helpful suggestions from this site regarding time and volume) and I have DNA in my input controls. However, there is an ominous lack of DNA in my 'ChIPed' samples. If any of you can answer these questions I'd be REALLY grateful,

(i) is the cross-linking with formadehyde very time or temperature sensitive? At the moment I follow the protocol, 1% formaldehyde (molecular grade) in total 1ml volume at 37C for 10 minutes. I add the formaldehyde at 2x concentration in 500ul to 500ul of cell suspension so that it mixes efficiently and quickly (one of you suggested that and it works very well, thanks!). As I get no product at the end of the protocol I wonder if the cross-linking is not good enough?

(ii) is the reversal of cross-linking with NaCl very time or temperature sensitive? Again, following protocol, 65C for 4hrs (what a pain!!) with NaCl

(iii) protease inhibitors - I don't trust mine! They are clearly very important as I need intake histones for the immunoprecipitation. I follow the protocol with final conc 1mM PMSF, 1ug/ml aprotinin and 1ug/mlpepstatin A). Please can someone tell me what they use and where the get it from??!!

Thank you - I really want this to work as it will make my PhD!!!

I suspect your problem is with your antibody. Are you sure that your antibody is working well under fix conditions? Many antibodies will work perfectly for normal IP but not for ChIP because of the fixation step. I don't think the reverse cross-link is your problem since the DNA in your "input control" is OK. As for the protease inhibitor, I suggests the Roche Complete Protease inhibitor Cocktail Tablet.

Are you working with suspension culture or adherent culture? If it is adherent culture, according to the protocol formaldehyde should be added to the cells before they are harvested.


Cross-linking Chromatin immunoprecipitation (ChIP) Protocol

ChIP is a technique for studying the interactions between proteins with DNA as it is in nature. It depends on the specific antibody reactions with antigen, so which can truly reflect the combination of protein factors and genomic DNA in vivo. The target protein was cross-linked together with DNA. Then DNA is broken into small fragments by sonication or enzymatic hydrolysis. So we can pull down the predicted DNA fractions by the specific reactions between antibody and antigen. This process specifically enriched DNA fragments bound by target proteins. Finally, we can purify the DNA from the complex and validate the DNA following PCR or qPCR protocol.

ChIP lysis buffer: 1% TritonX-100, 0.1% NaDOC, 0.1% SDS, 1mM EDTA (pH8.0), 140mM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH 8.0)
RIPA buffer: 1% NP-40, 0.5%NaDOC, 0.1% SDS, 2mM EDTA (pH8.0), 150mM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH 8.0)
Low salt wash buffer: 1% TritonX-100, 0.1% SDS, 2mM EDTA (pH8.0), 150mM NaCl, 20mM Tris-HCl (pH 8.0)
High salt wash buffer: 1% TritonX-100, 0.1% SDS, 2mM EDTA (pH8.0), 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl (pH 8.0)
LiCl buffer: 0.25M LiCl, 1% NP-40, 1% NaDOC, 1mM EDTA, 10mM Tris-HCl (pH 8.0)
TE buffer: 1mM EDTA, 10mM Tris-HCl (pH 8.0)
Elution buffer: 1% SDS, 100mM NaHCO3

Cross-linking and lysis - for transcription factor and cofactors

Cells culture in 10cm culture dishes with 20mL culture medium. When the density of cells reaches to 80%-90%, it can be used to a ChIP assay. The number of cells differs from the target protein which you are research on. You can refer to the form as follow:

بروتين Number of cells(for a ChIP reaction) Protein target abundance
Histone protein
RNA polymerase II
10 4 عالي
Transcription factor 10 5 -10 6 واسطة
العامل المساعد 10 7 or more قليل

To ensure a better result, we recommend more than 4×10 6 cells for histone protein and RNA polymerase II, while transcription factor or cofactor need more cells.1% formaldehyde is used as crosslinking agent to crosslink proteins and DNA. This process is time dependence. So we need to optimize the process for different cells. Crosslinking deficiency result a false negative result, while excessive crosslinking may cover epitope and result a false positive result. We recommend crosslink the sample foe 10min. The Crosslinking reaction can be reversed by glycine.

Take out the culture dishes and add 550μl 37% formaldehyde into 20ml culture medium. Mix the medium up to 1% final concentration of formaldehyde.

Place the culture dishes at RT for 10min. The process is the cross-link between protein and DNA and the time shouldn't too long, which will result in a false positive result.

Add 125mM glycine solution to terminate the cross-link reaction. Gently mix the solution up.

Place the culture dishes at RT for 5min.

Remove culture medium and wash the cells with ice PBS for 3 times.

Add 1ml ice PBS, Which contains protein inhibitors, into the dishes and scrap the cells from the dishes quickly.

Wash the bottom of dishes by PBS for twice with proper volume. Aspirate the PBS into the tube in step 6.

Centrifuge for 3min, 4℃ at 2500rmp to collect the pellets.

Add proper volume ChIP lysis buffer (1ml for 2×10 7 cells) to suspend the cells and lysate the cells on ice for 15min.

Sonicate the cells to broken the DNA and the ideal fractions of DNA is 200-1000bp. The condition of sonicate is differ from type of cells and the instrument you used. For each kind of cells, you have to explore the corresponding sonication conditions.

Centrifuge for 10min, 4℃ at 12000rmp

The sonicate process is also time dependence. The ideal fragment of DNA is 200-1000bp, and it need to optimize for different cell lines.

Sonicate the cells to broken the DNA and the ideal fractions of DNA is 200-1000bp. The condition of sonicate is differ from type of cells and the instrument you used. For each kind of cells, you have to explore the corresponding sonication conditions.

Centrifuge for 10min, 4℃ at 12000rmp. And separate the supernatant into a new tube.

Get 50μl supernatant for an agarose gel analysis to validate the effect of sonication.

Determination of DNA fragment

Add 70μl elution buffer to the 50ul chromatin.

Add 4.8μl 5M NaCl and 2μl 10mg/ml RNase A to incubate at 65℃ overnight. The purpose is to remove the interference of RNA.

Add 2μl 20mg/ml proteinase K to incubate at 60℃ for 1h. The aim is to break the reactions between protein and DNA and may be helpful to DNA purification.

Use a DNA purification kit to enrich the DNA or preform phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation method.

2% agarose gel is used to detect the sonication efficiency.

Take 500μl chromatin (dilute by RIPA buffer) which contains DNA from 1×10 7 cells into a tube and take 50μl chromatin as a input group.

Before the immunoprecipitation, you have to design four groups of experiments:


Contact-site cross-linking agents comprise a heterogeneous grouping of cross-linkers which share the common property of being able to cross-link only very closely juxtaposed residues in macromolecular complexes. We have defined contact-site cross-linking arbitrarily as the covalent joining of residues such that they are constrained to a distance which is equivalent to or less than their closest possible steric approach prior to becoming linked (1). We recognize two classes of contact-site cross-linkers, bridge type and zero-length type. The former, such as formaldehyde, become incorporated during cross-linking as one-atom bridges. The latter, such as the carbodiimides, operate as condensing agents with the result that the cross-linked residues become interjoined directly.

Contact-site cross-linkers have been used in several ways as specific probes of both the static and dynamic aspects of macromolecular structure. They can yield precise structural information about macromolecular contacts when actual sites of cross-linking are determined by peptide or nucleotide mapping techniques. In this way exact contacs between histones in the nucleosome, between protein and RNA in the ribosome, and between RNA polymerase and DNA have been determined. Contact-site cross-linkers have also been used to probe the perturbation of contacts following macromolecular conformational changes. Certain histonehistone ‘cross-linkable’ sites are rendered unreactive after induction of chromatin conformational changes thus serving to localize sites of perturbation.


شاهد الفيديو: تركيب DNA الجزء الأول. البيولوجيا الجزيئية. الصف الثالث الثانوي 2020 (أغسطس 2022).