معلومة

التماثل والتشابه لمحاذاة التسلسل المتعدد (MSA) للبروتينات

التماثل والتشابه لمحاذاة التسلسل المتعدد (MSA) للبروتينات


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

يجب أن أقوم بنمذجة تجانس لبروتين عبر الغشاء (قناة الصوديوم) وأنا الآن بصدد مواءمة تسلسلات القالب مع البروتينات المتماثلة التي وجدتها. أنا أستخدم T-Coffee للقيام بالمحاذاة. أرغب في الحصول على بعض التوصيفات العددية للتسلسلات المختلفة وقد طُلب مني تضمين النسبة المئوية للتشابه والهوية. كيف يمكنني حسابها؟ هل توجد أدوات على الإنترنت للقيام بذلك؟ شكرا لك.


لم أستخدم T-Coffee مطلقًا ولكن يبدو أن إصدار خادم الويب يمنحك مجموع النقاط بالإضافة إلى درجة لكل تسلسل فردي ؛ هل تعلم ما إذا كانت هذه الأرقام مرتبطة بالواصفات العددية التي تحتاجها؟ أفضل مكان للبدء هو قراءة الوثائق. مكان آخر جيد للبحث هو صفحة مجموعات Google لـ T-Coffee.


يمكن استخدام النسب المئوية لتشابه بروتين SARS-CoV-2 والتوافق مع بروتينات SARS-CoV و BatCoV RaTG13 كمؤشرات على أصل الفيروس

توجد ثلاثة أنواع من البروتينات في فيروسات كورونا: البروتينات غير البنيوية والبروتينات التبعية. بروتينات فيروس كورونا ضرورية لتكاثر الفيروس ولربط وغزو العوائل وتنظيم التمثيل الغذائي للخلايا المضيفة والمناعة. حققت هذه الدراسة في تشابه تسلسل الأحماض الأمينية والنسب المئوية للهوية لـ 10 بروتينات في SARS-CoV-2 و SARS-CoV و رينولوفوس أفينيس فيروس كورونا الخفافيش (BatCoV RaTG13). كانت البروتينات التي تم فحصها هي 1ab polyprotein ، و spike protein ، و orf3a ، وبروتين الغلاف ، وبروتين الغشاء ، و orf6 ، و orf7a ، و orf7b ، و orf8 ، وبروتين نوكليوكابسيد. تم استخدام خدمة محاذاة التسلسل عبر الإنترنت لمجموعة البرامج المفتوحة للبيولوجيا الجزيئية الأوروبية (EMBOSS) لتحديد النسب المئوية لتشابه البروتين وهويته في الفيروسات الثلاثة. أظهرت النتائج أن النسب المئوية للتشابه والهوية لبروتينات SARS-CoV-2 و BatCoV RaTG13 كانت أكبر من 95٪ ، في حين كانت نسبة الهوية والتشابه بين SARS-CoV-2 و SARS-CoV أكبر من 38٪. تتمتع بروتينات SARS-CoV-2 و BatCoV RaTG13 بهوية وتشابه عاليين مقارنةً ببروتينات SARS-CoV-2 و SARS-CoV.

تعتبر بروتينات SARS-CoV-2 أكثر تشابهًا وتشابهًا مع بروتينات BatCoV RaTG13 مقارنة ببروتينات SARS-CoV

معلومات تكميلية

تحتوي النسخة الموجودة على الإنترنت على مواد تكميلية متوفرة في 10.1007 / s42485-021-00060-3.


مقدمة

يعد توقع بنية البروتين الحسابي أحد أهم وأصعب المشاكل في المعلوماتية الحيوية والبيولوجيا الهيكلية. يمكن أن يؤدي فهم بنية البروتين إلى الكشف عن معلومات حول وظيفة البروتين ، ويمكن أن يساعد في تصميم وتطوير البروتينات الاصطناعية وجزيئات الأدوية 1،2. في الآونة الأخيرة ، لوحظ تحسن كبير في التنبؤ ببنية البروتين بسبب التحسينات في الاتصال ، ومؤخراً ، تنبؤ خريطة المسافة 3. تُستخدم الاتصالات / المسافات المتوقعة لدفع عملية طي البروتين الحسابي ، حيث يتم التنبؤ ببنية البروتين الذري ثلاثي الأبعاد دون الحاجة إلى هياكل القوالب 4.

يتمثل المبدأ الأساسي وراء التنبؤ الحديث بالاتصال في اكتشاف العلاقات التطورية بين المخلفات من محاذاة التسلسل المتعدد (MSAs) 5. استخدمت مناهج التنبؤ بخريطة الاتصال السابقة تحليل الاقتران المباشر لتحديد هذه العلاقات. تتضمن هذه الطرق CCMPred 6 و PSICOV 7 و Gremlin 8 و EV fold 9 و plmDCA 10. تستخدم الموجة التالية من الأساليب ، التي تمثل الحالة الحالية للفن ، التعلم العميق للتنبؤ بالاتصالات / المسافات. أدت الأساليب القائمة على التعلم العميق إلى تحسين التنبؤ بالاتصال بشكل كبير. يتضح هذا من التقييم الأخير على مستوى المجتمع للتنبؤ بالهيكل ، CASP13 3 (التقييم النقدي للتنبؤ بالهيكل) ، حيث الأساليب الأفضل أداءً في التنبؤ بالهيكل بما في ذلك AlphaFold 11 وطرق التنبؤ بالاتصال بما في ذلك RaptorX 12 و TripletRes 13 و ZHOU Contact 14 كلها قائمة على التعلم العميق. أظهر Raptor-X و Alphafold أيضًا أن التنبؤ بتوزيعات المسافة بدلاً من جهات الاتصال الثنائية يمكن أن يحسن الأداء بشكل أكبر. ومع ذلك ، لا تزال الأساليب الحالية غير دقيقة بما يكفي لتحقيق نمذجة الهيكل باستمرار مع درجات تقييم هيكل GDT-TS عالية 3. وبالتالي ، لا تزال هناك حاجة إلى مزيد من التحسين.

أحد مفاتيح التنبؤ الدقيق بالمسافة / الاتصال هو جودة MSAs 15،16. استخدمت الأعمال الحديثة قطعًا متحفظًا للقيمة الإلكترونية لإنشاء MSA لأن استخدام حد كبير للقيمة الإلكترونية يمكن أن يؤدي إلى مزيد من الضجيج وأحيانًا معلومات غير صحيحة عن التطور المشترك في MSA. من ناحية أخرى ، يمكن أن يؤدي قطع قيمة E أكبر إلى MSA يحتوي على المزيد من التسلسلات ، والتي قد توفر معلومات مفيدة خاصة عندما لا يحتوي بروتين الاستعلام على العديد من المتماثلات القريبة. تكمن الصعوبة في أن المستوى المناسب من تشابه التسلسل يعتمد على عائلة البروتين 17،18.

هنا ، نقترح نهجًا جديدًا قائمًا على التعلم العميق ، AttentiveDist ، حيث يمكن للنموذج استخدام معلومات محاذاة متعددة من خلال آلية الانتباه. يستخدم AttentiveDist مجموعة من MSA التي يتم الحصول عليها من خلال قطع قيمة E مختلفة ، حيث يحدد نموذج التعلم العميق أهمية كل MSA باستخدام آلية الانتباه. تُستخدم آليات الانتباه في نماذج التعلم العميق على نطاق واسع في معالجة اللغة الطبيعية 19،20 ورؤية الكمبيوتر 21،22 لتحديد المناطق في الجملة أو الصورة على التوالي مهمة لمهمة معينة. لتعميم النموذج بشكل أفضل ، استخدمنا نهجًا متعدد المهام ، حيث توقعنا زوايا العمود الفقري وزوايا الاتجاه 23 جنبًا إلى جنب مع المسافة بين المخلفات. نوضح أيضًا أنه يمكن تحسين تنبؤ البنية من خريطة المسافة المتوقعة باستخدام Rosetta 24 باستخدام مسافات مركز سلسلة جانبية متوقعة بين المخلفات وروابط هيدروجين السلسلة الرئيسية. يتم تحويل المسافات والزوايا المتوقعة إلى إمكانات باستخدام توزيعات خلفية الشبكة العصبية المتوقعة.

نظهر أن التنبؤ عن بعد بين المخلفات القائم على التعلم العميق يستفيد من استخدام MSAs المتعددة. قمنا بمقارنة تنبؤات المسافة باستخدام مجموعات من MSA الفردية من قطع القيمة الإلكترونية المختلفة مع النهج القائم على الانتباه ، مما يدل على أن هذا الأخير حقق دقة أفضل. نوضح أيضًا أن الاهتمام الممنوح لمختلف الميزات المستندة إلى MSA في AttentiveDist يرتبط بالمعلومات التطورية المشتركة في MSA. أخيرًا ، نوضح أنه في نمذجة الهيكل ، تعمل القيود الإضافية على مسافات مركز السلسلة الجانبية المتوقعة بين المخلفات والروابط الهيدروجينية ذات السلسلة الرئيسية على تحسين التنبؤ بالهيكل.


تكامل الهيكل الثانوي

القاعدة العامة أن الهيكل محفوظ أكثر من التسلسل هي حقيقة موثقة جيدًا (21-24). نتيجة لذلك ، أظهرت العديد من الدراسات أن استخدامه لتوجيه محاذاة التسلسل يحسن جودة المحاذاة ، خاصة بين التسلسلات البعيدة (6-8 ، 11-15 ، 25). تحقيقًا لهذه الغاية ، ابتكرنا مخططًا ثانويًا لتسجيل درجات البنية لخوارزمية المحاذاة التي تجمع بين أوزان التبادل من أربعة أنواع من المصفوفات: يتم تسجيل مواضع التسلسل أو الملف الشخصي التي لم يتم تعيين نفس فئة الهيكل الثانوي باستخدام مصفوفة عامة (افتراضي: BLOSUM62 ) ، وإلا فإن المواضع التي تتطابق مع تعيينات اللولب أو الشريط أو الملف تستخدم مصفوفات Lüthy (26) اللولبية ، والحبال ، والملف ، على التوالي. يؤدي استخدام معلومات البنية الثانوية إلى تحسين PRALINE بشكل كبير أساسي جودة المحاذاة وتعزز أيضًا PRALINE PSI المحاذاة في حالات المحاذاة الصعبة للغاية وهوية التسلسل بنسبة 20٪ (V. A. Simossis و J. Heringa ، تم تقديمهما للنشر). في الجدول 1 ، يتضح بوضوح أن استخدام الهيكل الثانوي مفيد لـ PRALINE أساسي (& gt 4٪ تحسن في الحالات مع & lt60٪ هوية) ، وإن لم يكن بنفس أهمية التحسينات التي شوهدت مع PRALINE PSI .

تتضمن خيارات تكامل البنية الثانوية لـ PRALINE استخدام أي من طرق التنبؤ السبعة المدرجة [PHDpsi (27) ، PROFsec (B. Rost ، بيانات غير منشورة) ، SSPRO 2.01 (28) ، YASPIN (20) ، PSIPRED ( 19) ، JNET (29) و PREDATOR (30 ، 31)] للتنبؤ بالبنية الثانوية لتسلسلات الإدخال. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمستخدم اختياريا اختيار البحث أيضًا في بنك بيانات البروتين (PDB) للعثور على معلومات بنية ثلاثية الأبعاد لتسلسلات الإدخال واستخدام البنية الثانوية المشتقة من DSSP للمحاذاة. إذا تم تحديد كل من DSSP وطريقة التنبؤ ، فسيتم دمج التنبؤات فقط في المحاذاة لتلك التسلسلات التي لا تحتوي على إدخال PDB. أخيرًا ، في نفس القائمة مثل طرق التنبؤ السبعة ، يمكن استخدام إجماع تصويت الأغلبية على النحو الأمثل (24) أو بالأغلبية بدلاً من ذلك والذي يجمع حاليًا تنبؤات PROFsec و YASPIN و PSIPRED.


قاعدة بيانات للانترنت

يعمل الخادم على بنيتنا التحتية المحلية. وهو يتألف من تطبيق ويب أمامي ومجموعة تنفيذ خلفية. تعتمد الواجهة الأمامية على ملف يلعب! framework ، وهي مجموعة أدوات Java خفيفة الوزن لتطوير تطبيقات الويب (http://www.playframework.org). تم تصميم الخادم بطريقة يمكن اعتبار كل وضع T-Coffee فرديًا بمثابة مكون إضافي مستقل. بهذه الطريقة ، يمكن للمرء نشر إصدارات بديلة من الحزمة والتكوينات البديلة بسهولة بالغة. ترسل الواجهة الأمامية طلبات محاذاة المستخدمين إلى نظام ترتيب الدُفعات استنادًا إلى Oracle Grid Engine (المعروف سابقًا باسم Sun Grid Engine).

باستخدام خادم الويب T-Coffee

يمكن الوصول إلى خادم الويب إما من http://www.tcoffee.org أو http://tcoffee.crg.cat. وهو متوافق مع جميع متصفحات الويب الرئيسية (Mozilla Firefox 3+ و Google Chrome و Internet Explorer 7+ و Safari 5+ و Opera 10+). لا يحتاج المستخدمون إلى أي تسجيل دخول على الرغم من أنه من المستحسن تقديم بريد إلكتروني عند إرسال مهام كبيرة تزيد عن 100 تسلسل. بدءًا من الفهرس ، يمكن للمستخدمين اختيار الوضع الأنسب لتسلسلاتهم:

T-Coffee: يُنصح باستخدام مجموعات البيانات الكبيرة من البروتين أو الأحماض النووية.

M-Coffee: يُنصح بمجموعات البيانات الكبيرة من البروتين أو الأحماض النووية عندما يريد المرء مقارنة ناتج التقويم البديل.

R-Coffee: لتسلسلات الحمض النووي الريبي مع بنية ثانوية محفوظة.

Expresso: يُنصح به لتسلسلات البروتين ذات الهياكل ثلاثية الأبعاد المعروفة.

PSI-Coffee: يُنصح به لمجموعات بيانات البروتين الصعبة للغاية.

دقيق: هو وضع تجريبي ، لكنه غير مُقيَّم ، يحاول الجمع بين أفضل الأوضاع تلقائيًا.

Combine: يشبه M-Coffee ولكنه يسمح للمستخدمين بدمج محاذاة التسلسل المتعددة المحسوبة مسبقًا.

الأساسية: تجعل من الممكن تقييم اتساق أي محاذاة تسلسل متعدد.

iRMSD: بشرط أن تحتوي مجموعة البيانات على بنيتين على الأقل ، تقوم iRMSD بإرجاع تقييم للمحاذاة المدروسة التي تأخذ في الاعتبار جودة التراكب البنيوي الضمني.

حساب محاذاة تسلسل متعدد

بمجرد تحديد وضع المحاذاة ، سيعرض الخادم صفحة إرسال نموذج المحاذاة. في أبسط الحالات ، يحتاج المستخدم إلى إدخال التسلسلات لمحاذاة مربع النص المعروض. تأخذ جميع أوضاع حساب MSA كتسلسلات إدخال بتنسيق FASTA ، في حين أن أوضاع تقييم المحاذاة الأساسية و iRMSD تأخذ ، كمدخل ، محاذاة تسلسل متعددة بتنسيق ALN (تنسيق إخراج ClustalW). يمكن أيضًا تحميل التسلسلات باستخدام رابط "تحميل ملف" أسفل مربع النص في نموذج الإرسال. يمكن إدخال إجمالي 150 تسلسلًا ويمكن أن يحتوي كل تسلسل على ما يصل إلى 10000 وحدة بنائية لوضع T-Coffee وما يصل إلى 2500 للأوضاع الأخرى.

في جميع الخدمات ، تتوفر إعدادات المحاذاة المتقدمة بالنقر فوق الرابط "إظهار المزيد من الخيارات". من خلال الوصول إلى هذا القسم ، يمكن تغيير الإعدادات الافتراضية لمحاذاة T-Coffee والتحكم في التفاصيل المتقدمة. تختلف هذه وفقًا لوضع T-Coffee المحدد ، ولكنها بشكل عام تسمح بعنصرين مهمين: اختيار الطرق المستخدمة لإنتاج المكتبة الأساسية وبعض عناصر التحكم الإضافية في تنسيقات الإخراج.

بمجرد إدخال التسلسلات بشكل صحيح وتحديد المعلمات المناسبة ، يجب النقر فوق الزر "إرسال" في أسفل الصفحة لإرسال طلب المحاذاة إلى الخادم. يتم تخصيص رقم تعريف لكل طلب واستخدامه كمرجع فريد. يمكن أن تستغرق عملية المحاذاة من بضع ثوانٍ إلى عدة دقائق ، اعتمادًا على مدى تعقيد المحاذاة وتحميل الخادم. إذا تم إغلاق المتصفح أثناء الانتظار ، فسيتمكن المستخدمون مع ذلك من الوصول إلى نتيجة حسابهم عن طريق إعادة فتح صفحة الخادم والنقر على رابط "السجل". يعرض هذا الارتباط المحفوظات كما تم تخزينها في ملف تعريف ارتباط محلي. ستفقد هذه المعلومات إذا تم حذف ملف تعريف الارتباط هذا أو عند الوصول إليه من جهاز آخر. كبديل ، يمكن وضع إشارة مرجعية على الصفحة المعروضة أثناء الانتظار وإعادة زيارتها لاحقًا. يمكن للمستخدمين أيضًا تقديم بريدهم الإلكتروني لإبلاغهم بإكمال الوظيفة.

عند الانتهاء من الحساب ، يعرض الخادم صفحة ملخص (الشكل 1). يتضمن MSA المحسوب (أو ارتباط إلى MSA لمجموعات البيانات الأكبر من 1 ميجابايت). يحتوي مربع "ملفات النتائج" على جميع الملفات التي تم إنتاجها بواسطة T-Coffee أثناء عملية المحاذاة بالإضافة إلى ملف إدخال التسلسلات. يتيح الرابط المقدم "تنزيلهم جميعًا" للمستخدمين تنزيل جميع ملفات الإخراج في أرشيف مضغوط واحد. يتيح مربع "إرسال النتيجة" إمكانية المعالجة اللاحقة للمحاذاة وإرسالها إلى خدمات الجهات الخارجية مثل ProtoGene (21) أو مركز SIB MSA "MyHits". يمكن للمرء أيضًا إعادة تشغيل وظيفة بالنقر فوق الرابط الموجود في مربع "إعادة التشغيل". سيعيد إنشاء صفحة الإرسال حيث يمكن للمستخدمين إما تعديل معلمات المحاذاة أو تغيير تسلسل الاستعلام.

عينة من صفحة نتائج T-Coffee. الجزء العلوي عبارة عن محاذاة مرمزة بالألوان حيث تتوافق التسلسلات باللون الأحمر مع أجزاء المحاذاة مع دعم قوي في المكتبة الأساسية. لأغراض المعالجة اللاحقة ، يُنصح المستخدمون بتنزيل النسخة النصية للمحاذاة المتوفرة في قسم ملفات النتائج.

عينة من صفحة نتائج T-Coffee. الجزء العلوي عبارة عن محاذاة مرمزة بالألوان حيث تتوافق التسلسلات باللون الأحمر مع أجزاء المحاذاة مع دعم قوي في المكتبة الأساسية. لأغراض المعالجة اللاحقة ، يُنصح المستخدمون بتنزيل النسخة النصية للمحاذاة المتوفرة في قسم ملفات النتائج.

تفسير المخرجات

يشير الإخراج الملون الرسومي إلى مستوى التناسق بين المحاذاة النهائية والمكتبة المستخدمة بواسطة T-Coffee. النتيجة الرئيسية هي إجمالي قيمة الاتساق. تعني القيمة 100 اتفاق كامل بين المحاذاة المدروسة والمكتبة الأساسية المرتبطة بها. هذا يعني أيضًا أن المكتبة متسقة ذاتيًا. تم إظهار القيم العالية لتعكس دقة أعلى (22 ، 23). ومع ذلك ، يُنصح المستخدمون بعدم مقارنة هذه القيم بين محاذاة نفس التسلسلات المحسوبة باستراتيجيات مختلفة لإنشاء المكتبة الأساسية. على سبيل المثال ، عادةً ما تُرجع M-Coffee قيمًا أعلى من T-Coffee ولكن لا يمكن تفسير هذه الاختلافات من حيث الدقة النسبية. تعتبر درجة التسلسل الفردي أكثر إفادة لأنها تسمح بتقدير الملاءمة النسبية للتسلسلات داخل MSA. على سبيل المثال ، يجب اعتبار أي تسلسل له درجة تناسق أقل من التسلسلات الأخرى مريبًا. وبالمثل ، يعكس نظام الألوان المتبقية دعم المكتبة الأساسي لمحاذاة البقايا المدروسة على مقياس بين 0 (أزرق ، دعم ضعيف) و 9 (أحمر داكن ، مدعوم بقوة). بينما اقترحت الدراستان المذكورتان أعلاه أن البقايا التي لها درجة اتساق أعلى من 5 (أي أصفر / برتقالي / أحمر) من المحتمل جدًا أن تكون محاذاة بشكل صحيح ، فمن المحتمل أن يكون مخطط التسجيل هذا أكثر فائدة لتحديد الامتدادات غير الموثوقة للغاية (الأزرق) التي هي نادرا ما تتماشى بطريقة ذات مغزى بيولوجي.

تقييم المحاذاة

يوفر خادم الويب أيضًا وضعين لتقييم المحاذاة يتم تنفيذهما بواسطة T-Coffee: Core و iRMSD-APDB. عند تشغيل Core ، يحتاج المستخدمون ببساطة إلى إدخال محاذاة محسوبة مسبقًا بتنسيق ALN. يقوم T-Coffee تلقائيًا بحساب المكتبة المقابلة وإخراج نسخة ملونة من المحاذاة. عند استخدام iRMSD ، يحتاج المستخدمون إلى توفير محاذاة تسلسل متعدد بتنسيق ALN يحتوي على معرفات PDB. يكون وضع iRMSD-APDB مشابهًا للخادم الموصوف في الأصل (24).


Match-Box_server: أداة محاذاة متعددة التسلسل تركز على الموثوقية

التحفيز: يشتمل برنامج Match-Box على أدوات محاذاة تسلسل البروتين بناءً على عتبات إحصائية صارمة للتشابه بين مقاطع البروتين. تتحايل الطريقة على متطلبات عقوبة الفجوة: الثغرات هي نتيجة المحاذاة وليست المعلمة الحاكمة للإجراء. تعتبر المناطق المحفوظة الموثوقة التي حددها Match-Box ذات صلة بشكل خاص بنمذجة التماثل لهياكل البروتين ، والتنبؤ بالمخلفات الأساسية للطفرات الموجهة بالموقع وتصميم قليل النوكليوتيد لاستنساخ الجينات المتجانسة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

نتائج: تنتج الطريقة نتائج موثوقة ، وفقًا لتقييم الاختبارات التي أجريت على عائلات البروتين ذات الهياكل المعروفة والتشابه المنخفض في التسلسل. يتم حساب درجة الموثوقية فيما يتعلق بعتبة التشابه التي يتم رفعها تدريجيًا لتمديد المناطق المحاذاة إلى أقصى طول لها ، حتى حد الأهمية لقطاعات المطابقة. تتم طباعة النتيجة التي تم الحصول عليها في كل موضع أسفل التسلسلات وتسمح بقراءة مميزة لكل منطقة محاذاة.


محاذاة تسلسل متعدد MSA محاذاة العديد من التسلسلات هي

MSA- محاذاة التسلسل المتعدد • غالبًا ما تكون محاذاة العديد من المتواليات أفضل من المقارنات الزوجية. • مشكلة - التعقيد الحسابي للمحاذاة المتعددة ينمو بسرعة مع عدد التسلسلات التي تتم محاذاتها.

"حتى باستخدام أجهزة الكمبيوتر العملاقة أو شبكات محطات العمل ، تعد محاذاة التسلسل المتعدد مشكلة مستعصية لأكثر من 20 تسلسلًا متوسط ​​الطول والتعقيد. "

نتيجة لذلك ، تم تطوير طرق المحاذاة باستخدام الاستدلال. لا يمكن لهذه الطرق (بما في ذلك Clustal. W) ضمان المحاذاة المثلى ، ولكن يمكنها العثور على محاذاة شبه مثالية لعدد أكبر من التسلسلات.

CLUSTALW • تم تطويره في عام 1988 • يبدأ بمحاذاة التسلسلات وثيقة الصلة ثم يضيف متواليات متباينة بشكل متزايد لإنتاج رسالة نصية كاملة.

• http: // www. ncbi. nlm. نيه. gov / • http: // www. ebi. أ. المملكة المتحدة / clustalw /

مقدمة في علم الوراثة الجزيئي * * علم الوراثة- التاريخ التطوري للمجموعة

الطفرات تحدث! 3 أنواع ممكنة: • ضار • مفيد •؟ ؟ ؟

نقطة مهمة: • الكثير من التباين الملاحظ بين الأفراد يجب أن يكون له تأثير قليل مفيد أو ضار وأن يكون محايدًا بشكل انتقائي. • يتم فحص الطفرات الضارة. الطفرات المفيدة نادرة.

القيود الوظيفية؟ • يقال إن أجزاء الجينات التي لها أهمية خاصة تخضع لقيود وظيفية وتميل إلى تراكم التغييرات ببطء شديد. • السابق. = بروتينات هيستون- عمليا كل حمض أميني مهم. يمكن أن يحل هيستون الخميرة محل هيستون الإنسان.

المعدل النسبي للتغيير داخل جين غلوبين (4 ثدييات)

أساس علم الوراثة الجزيئي • يمكن نمذجة تطور الأنواع على أنها عملية متفرعة - يبدأ الانتواع عندما تصبح مجموعتان من المجموعات السكانية معزولة تكاثريًا.

أساس علم الوراثة الجزيئي • بمجرد توقف هذين المجموعتين عن التزاوج ، من المحتم أن يتباعدا بسبب عمليات الطفرات العشوائية.

أساس علم الوراثة الجزيئي • بمرور الوقت ، قد تكرر عملية التفرع نفسها نفسها. • يقال إن الأنواع مرتبطة ببعض الأنواع الأخرى التي تشترك معها في سلف مشترك مباشر.

أساس علم الوراثة الجزيئي • يجب أن يشير مقدار اختلاف تسلسل الحمض النووي بين زوج من الكائنات الحية إلى مدى مشاركة هذين الكائنين في سلف مشترك.

أساس علم الوراثة الجزيئي • كلما طالت فترة بقاء مجموعتين معزولين تناسليًا ، كلما زاد تباين الحمض النووي. • كلما طالت فترة بقاء مجموعتين معزولين تناسليًا ، كلما زاد تباعد البروتين.

علم السلالات الجزيئي جديد نسبيًا. • التطور عن طريق الانتقاء الطبيعي - داروين / والاس 1858 • التطور الجزيئي 1960 ق؟ ؟

كيف بدأت. . • في عام 1959 ، حدد العلماء الهياكل ثلاثية الأبعاد لبروتينين موجودان في كل حيوان تقريبًا: الهيموجلوبين والميوغلوبين. • خلال العقدين التاليين ، تم تحديد تسلسل الميوغلوبين والهيموغلوبين لعشرات الثدييات والطيور والزواحف والبرمائيات والأسماك ، إلخ.

ما وجدوه. . . • "تتفق هذه الشجرة تمامًا مع الملاحظات المستمدة من علم الأحافير والتشريح حول الأصل المشترك للكائنات الحية المقابلة. ”* • * من العلوم والإبداع: منظر من الأكاديمية الوطنية للعلوم ، الطبعة الثانية. ، 1999.

من المتوقع أن تكون الكائنات الحية ذات الدرجات العالية من التشابه الجزيئي أكثر ارتباطًا من تلك غير المتشابهة.

مزايا السلالة الجزيئية • يمكن استخدامها لفك رموز العلاقات بين جميع الكائنات الحية • الاعتماد على علم التشريح يمكن أن يكون مضللاً - يمكن أن تتطور سمات مماثلة في الكائنات الحية غير المرتبطة ارتباطًا وثيقًا (على سبيل المثال ، التطور المتقارب يؤدي إلى عيون في الفقاريات والحشرات والرخويات).

كلمة تحذير تحليل النشوء والتطور مثير للجدل. هناك مجموعة متنوعة من الطرق المختلفة لتحليل البيانات ، وحتى الخبراء غالبًا ما يختلفون حول أفضل طريقة لتحليل البيانات.

لماذا هذا مثير للجدل؟ ؟ 2 أسباب:

# 1 - الجزيئية مقابل الكلاسيكية • ما مقدار الوزن المعطى لبيانات النشوء والتطور الجزيئي ، عندما تتناقض مع النتائج التي توصل إليها عالم التصنيف التقليدي؟ ؟

كم عدد السيارات التي غيرت مساحاتها خلال فترة الساعتين هذه؟ • موقف "أ" الساعة 2:00 • موقف "أ" الساعة 4:00

# 2 - يتطلب علم التطور الجزيئي تقديرات إحصائية. • موقف "أ" الساعة 2:00 • موقف "أ" الساعة 4:00

يتطلب تحليل البيانات الوراثية 4 خطوات • 1) محاذاة • 2) تحديد نموذج الاستبدال • 3) بناء شجرة • 4) تقييم شجرة

الخطوة 1 - المحاذاة • يعتمد تحليل النشوء والتطور الجزيئي على المحاذاة الجيدة. الشجرة التطورية القائمة على محاذاة غير صحيحة هي شجرة خاطئة.

التنادد من الأهمية بمكان لتحليل النشوء والتطور أن تتم مقارنة الصفات المتماثلة عبر الأنواع. Webster's New Collegiate- تشابه أساسي في البنية بسبب النسب من شكل سلف مشترك.

قارن بين الجينات المتجانسة والصفات المتماثلة: • بالنسبة للحمض النووي والبروتينات ، هذا يعني أنه يجب وضع الفجوات بشكل صحيح في محاذاة متعددة لضمان مقارنة نفس الموضع لكل نوع.

الجينات المتماثلة؟ متى يمكنك مقارنة الجينات غير المتجانسة عن طريق الخطأ؟ • كن حذرًا إذا قارنت الجينات التي تنتمي إلى عائلة جينية. • مقارنة توبولين -3 من نوع مع توبولين -6 من نوع آخر لن ينتج عنه نتائج دقيقة.

ما لمحاذاة؟ • يتم إنشاء أشجار النشوء والتطور من خلال مقارنة الحمض النووي أو البروتين. يعتمد الجزيء المختار على السؤال الذي تحاول الإجابة عليه.

DNA • يحتوي على معلومات تطورية أكثر من البروتين: • ATT GCG AAA CAC • * * • ATA GCC AAG CTC

البروتين (نفس المنطقة تم تحليل اختلاف واحد فقط) • إيل-ألا-ليس- صاحبها • إيل-ألا-ليس- ليو

الحمض النووي • معدل الاستبدال المرتفع للقاعدة يجعل الحمض النووي أفضل للدراسات قصيرة المدى ، هـ. ز. الأنواع وثيقة الصلة

* Homoplasy • عودة الشخصية إلى حالتها الأصلية ، وبالتالي إخفاء الأحداث الطفرية المتداخلة. يجب أن تؤدي كل طفرة رابعة إلى حدوث تجانس.

البروتين • محاذاة أكثر موثوقية من الحمض النووي: عدد أقل من الخلايا المتجانسة من الحمض النووي • معدل استبدال أقل من الحمض النووي أفضل لمقارنات الأنواع الواسعة

ص. RNA = RNA ribosomal • الأفضل للدراسات التطورية طويلة المدى التي تغطي الممالك البيولوجية • العمليات الانتقائية التي تقيد تطور التسلسل يجب أن تكون متماثلة تقريبًا عبر حدود الأنواع

الخطوة 2 - تحديد نموذج الاستبدال.

مصفوفة معدل إحلال النيوكليوتيدات: A T C G A 5 -4 -4 -4 T -4 5 -4 -4 C -4 -4 5 -4 G -4 -4 -4 5

الخطوة 3 - مصطلحات شجرة بناء الشجرة: العقد: نقاط التفرع الطوبولوجيا: النمط المتفرّع الفروع: الخطوط

يمكن تدوير الفروع عند عقدة ، دون تغيير العلاقات.

تشرح الأشجار غير المتجذرة علاقات النشوء والتطور ولا تقول شيئًا عن اتجاهات التطور - ترتيب النسب

هناك طريقتان رئيسيتان لرسم الشجرة. • - طرق الحرف • - طرق المسافة يتم استخدام كلا الأسلوبين على نطاق واسع ويعملان بشكل جيد مع معظم مجموعات البيانات.

طرق المسافة المسافة- مقياس الاختلاف الكلي في الازدواج بين مجموعتين من البيانات. المواد الخام لإعادة بناء الشجرة هي ملخصات جدولة للاختلافات الزوجية بين جميع مجموعات البيانات المراد تحليلها

في طرق المسافة ، تتمثل الخطوة الأولى في حساب مصفوفة لجميع الاختلافات الزوجية بين مجموعة من المتواليات. النوع A s B C D B 9 ----- C 8 11 ----- D 12 15 10 ----- E 15 18 13 5

طرق المسافة • تحديد أزواج التسلسل التي لديها أقل عدد من التغييرات في التسلسل فيما بينها ويتم تحديدها على أنها "جيران". على الشجرة ، تشترك هذه التسلسلات في سلف مشترك وينضم إليها فرع قصير.

تعد UPGMA والمسافة الزوجية وربط الجار طرقًا للمسافة. • يقومون بتجميع التسلسلات بشكل تدريجي ، بدءًا من تلك الأكثر تشابهًا. • UPGMA = طريقة المجموعة الزوجية غير الموزونة بمتوسط ​​حسابي

أشجار النشوء والتطور على أساس طرق المسافة. 1) التسلسلان الأقرب من بعضهما متصلان في عقدة. 2) تتكرر العملية حتى يتم ضم كل التسلسلات. 3) إضافة التسلسل الأخير يحدد جذر الشجرة.

قد تعكس أطوال الفروع درجة التشابه (وتعكس نظريًا الوقت التطوري). • الأشجار المتدرجة - عندما يكون طول الفرع متناسبًا مع الفروق بين أزواج القاعدة. • في أفضل الحالات ، تكون الأشجار المقاسة مضافة (الطول المادي للفروع التي تربط أي عقدتين هو تمثيل دقيق لاختلافاتهما المتراكمة).

أشجار النشوء والتطور على أساس طرق المسافة. • بسيط نسبيًا. • المشكلة: –قد لا تكون دقيقة !!

أساليب الأحرف "ليس هناك من ينكر أن الأساليب القائمة على المسافة" تنظر إلى الصورة الكبيرة "وتتجاهل بشكل واضح الكثير من المعلومات ذات القيمة المحتملة. "

طرق تحليل الشخصيات الفردية تترجم إلى أشجار تطورية. شخصية- ميزة محددة جيدًا يمكن أن توجد في عدد محدود من الحالات المختلفة. (مثل تسلسل الحمض النووي والبروتين)

يقع مفهوم البخل في قلب جميع الأساليب القائمة على الشخصية لإعادة بناء النشوء والتطور. • عملية ربط التفضيل بمسار تطوري على مسار آخر يتطلب على أساسه استدعاء أقل عدد من الأحداث الطفرية.

الأساليب القائمة على الشخصية لإعادة بناء النشوء والتطور. • "العلاقة التي تتطلب أقل عدد من الطفرات لشرح الوضع الحالي من المرجح أن تكون صحيحة"

الخطوة الأولى في أساليب الشخصيات: حدد جميع المواقع الإعلامية:

الخطوة الثانية: احسب الحد الأدنى لعدد البدائل في كل موقع إعلامي:

الخطوة الأخيرة: بعد محاذاة التسلسلات ، تقوم الخوارزميات بنمذجة كل شجرة.

الحد الأقصى من البخل هو أسلوب الحرف • تتطلب أساليب الأحرف محاذاة تسلسل متعدد. يستخدم تحليل "الشخصيات" المعلوماتية لبناء شجرة تطورية.

الحد الأقصى من البخل: ينص المعيار العلمي العام للاختيار من بين الفرضيات المتنافسة على أنه يجب علينا قبول الفرضية التي تشرح البيانات بأكبر قدر من البساطة والفعالية. • يتم اختيار الشجرة التي تتطلب _______ عدد بدائل الأحماض النووية أو الأحماض الأمينية.

الحد الأقصى من البخل: • تبحث الخوارزمية عن شجرة تتطلب أقل عدد من التغييرات لشرح الاختلافات الملاحظة بين المجموعات قيد الدراسة.

الأساليب الشخصية هي الأنسب ل. . . • متواليات متشابهة تمامًا. • عدد قليل من المتتاليات الطريقة مستهلكة حسابيًا للوقت حيث يتم فحص جميع الأشجار الممكنة.

الأشجار الوراثية على أساس الاحتمال الأقصى: الهدف هو العثور على الشجرة (من بين جميع الأشجار الممكنة) التي لديها أعلى احتمالية لإنتاج البيانات المرصودة (الطرق الإحصائية).

الأشجار النشوء والتطور على أساس الاحتمالية القصوى مماثلة لأساليب البخل القصوى ولكنها أيضًا تأخذ في الاعتبار احتمالية حدوث طفرات معينة (على سبيل المثال. A G).

تختلف معدلات الطفرات: • تحدث التحولات (البيورين إلى البيورين أو بيريميدين إلى بيريميدين) بشكل متكرر أكثر من التحولات (البيورين إلى بيريميدين أو بيريميدين إلى البيورين).

تتطلب العديد من الطرق الموصوفة قدرًا كبيرًا من وقت الكمبيوتر. لماذا ا؟

عدد الأشجار الممكنة المتجذرة وغير المتجذرة عدد مجموعات البيانات عدد الأشجار المجذرة عدد الأشجار غير المتجذرة 2 1 1 3 3 1 4 15 3 5 105 15 10 34، 459، 425 15213، 458، 046، 767، 875 20 8، 200 ، 794 ، 532 ، 637 ، 891 ، 559 ، 375 2 ، 027 ، 025 7 ، 905 ، 853 ، 580 ، 625221 ، 643 ، 095 ، 476 ، 699 ، 771 ، 875

تأخذ البرامج اختصارات. • عند مقارنة عدد كبير من الأشجار ، من المستحيل تسجيل كل شجرة. تحدد خوارزمية الاختصار حدًا أعلى. أثناء قيامه بتقييم الأشجار الأخرى ، فإنه يرمي أي شجرة تتجاوز الحد الأعلى قبل اكتمال الحساب.

فيما يلي حوالي 194 من حزم التطور النسبي و 16 خادمًا مجانيًا أعرفها. يتم إجراء تحديثات على هذه الصفحات مرتين في السنة تقريبًا. •

تقييم الشجرة كل "برنامج رسم شجرة" سيولد شجرة. السؤال المهم هو ما إذا كانت الشجرة المرسومة هي الشجرة الصحيحة أم لا. • في بعض الحالات ، هناك العديد من الأشجار ذات الاحتمالات المتشابهة.

طريقة Bootstrap لتقييم موثوقية الشجرة: يتم إنشاء الشجرة المستنبطة من مجموعة البيانات. أعد تشغيل الحساب على مجموعات فرعية من البيانات (إعادة التشكيل). يتم تكرار إعادة التشكيل عدة مرات (100-1000).

أسلوب Bootstrap يتم إنشاء أشجار Bootstrap من مجموعات البيانات المعاد تشكيلها. تتم مقارنة شجرة Bootstrap بالشجرة الأصلية المستنتجة. يتم تحديد٪ من أشجار التمهيد التي تدعم عقدة لكل عقدة في الشجرة.

الساعة الجزيئية إضافة الوقت إلى شجرة النشوء والتطور. الوحدات الزمنية غالبًا ما تكون بملايين السنين. الافتراض - معدلات الاستبدال ثابتة على مدى ملايين السنين.

يمكن أن تكون معدلات التطور الجزيئي للجينات ذات القيود الوظيفية المماثلة موحدة تمامًا. (قد تعمل الساعة بمعدلات مختلفة في بروتينات مختلفة.)

• استفاد علم الأحياء التطوري أيضًا بشكل كبير من مشاريع تسلسل الجينوم. تساعد ثروة بيانات الجينوم الجديدة في حل أفضل لشجرة الحياة ، ولا سيما فروعها الرئيسية. كان هذا صحيحًا بشكل خاص بالنسبة إلى بدائيات النوى ، حيث تم حتى الآن تسلسل أكثر من 80 جينومًا ، وقد حسنت النتائج بشكل كبير نظرتنا إلى التاريخ المبكر للحياة.

مشكلة- كلما زاد عدد التسلسلات ، زاد عدد الأشجار الممكنة زيادة كبيرة عدد التسلسلات عدد الأشجار 3 4 5 6 7 8 9 10 50 1 3 15105945 10 ، 395 135 ، 135 1 ، 027 ، 025 2. 8 × ١٠٧٤

أشجار النشوء والتطور على أساس انضمام الجيران. • يستخدم أيضًا "مصفوفة المسافة" • يبحث خوارزمية ربط الجوار عن مجموعات من الجيران لتقليل الطول الإجمالي للشجرة. • يمكن أن تنتج أشجاراً معقولة ، خاصة عندما تكون المسافات التطورية قصيرة.

• For vertebrates, many thorny issues remain to be resolved, such as the phylogeny of families and other major groups in the tree of life. For example, it is not yet known whether humans are closer to mice or to cattle because different results have been obtained with different gene analyses. On the other hand, there is no guarantee that complete genome sequences will immediately solve all phylogenetic questions, as evidenced by the continuing debate over the relationships among humans, flies, and nematodes. We will need to develop new statistical methods and bioinformatics tools to handle the greater volume of data and to unravel the complexities of molecular evolution.

• Choice of individual genes or proteins.

Distance matrices: • Scoring matrices include values for all possible substitutions. Each mismatch between two sequences adds to the distance, and each identity subtracts from the distance.


Motif finding

Motif finding, also known as profile analysis, is a method of locating sequence motifs in global MSAs that is both a means of producing a better MSA and a means of producing a scoring matrix for use in searching other sequences for similar motifs. A variety of methods for isolating the motifs have been developed, but all are based on identifying short highly conserved patterns within the larger alignment and constructing a matrix similar to a substitution matrix that reflects the amino acid or nucleotide composition of each position in the putative motif. The alignment can then be refined using these matrices. In standard profile analysis, the matrix includes entries for each possible character as well as entries for gaps. [ 8 ] Alternatively, statistical pattern-finding algorithms can identify motifs as a precursor to an MSA rather than as a derivation. In many cases when the query set contains only a small number of sequences or contains only highly related sequences, pseudocounts are added to normalize the distribution reflected in the scoring matrix. In particular, this corrects zero-probability entries in the matrix to values that are small but nonzero.

Blocks analysis is a method of motif finding that restricts motifs to ungapped regions in the alignment. Blocks can be generated from an MSA or they can be extracted from unaligned sequences using a precalculated set of common motifs previously generated from known gene families. [ 25 ] Block scoring generally relies on the spacing of high-frequency characters rather than on the calculation of an explicit substitution matrix. The BLOCKS server provides an interactive method to locate such motifs in unaligned sequences.

Statistical pattern-matching has been implemented using both the expectation-maximization algorithm and the Gibbs sampler. One of the most common motif-finding tools, known as MEME, uses expectation maximization and hidden Markov methods to generate motifs that are then used as search tools by its companion MAST in the combined suite MEME/MAST. [ 26 ] [ 27 ]


مناقشة

Although our study was restricted to amino acid data sets with at most 27 sequences, the following trends were consistently observed. The best Modeler and SP-scores were obtained for the high PID conditions, and this held for both types of data (simulated and biological) and for all methods. In addition, SP-scores and Modeler scores decreased as PID decreased. We also saw that the expansion ratios were very close to 1.0 for high PID conditions, but when PID was low the expansion ratios could be far from 1.0. Similarly, our simulation study showed that under the low substitution rate conditions (where PID was moderate at 0.24) then alignment error did not have a noteworthy impact on tree estimation (i.e., maximum likelihood trees estimated on estimated alignments were on average within 1% Robinson–Foulds error of the maximum likelihood trees estimated on the true alignment) however, under the high substitution rate conditions (where PID was low at 0.11) then maximum likelihood trees for some estimated alignments (e.g., Clustal and PRANK) were very far from the maximum likelihood tree computed on the true alignment. Thus, decreases in PID resulted in decreases in the accuracy (for all three alignment criteria we evaluated) of alignment methods and also resulted in increases in the error of trees computed on estimated alignments. This reduction in accuracy under low PID conditions explains why some biological benchmarks were more difficult than others. For example, all alignment methods had lower average Modeler and SP-scores on Mattbench than on the other benchmarks, and the average PID for the Mattbench data sets (0.20) is the lowest of the four biological collections we analyzed. Similarly, the Homstrad data sets have the highest average PID (0.37) of all these benchmarks, and the Modeler and SP-scores were highest on these data sets.

Another consistent trend throughout this study is that the differences between methods in terms of SP-score, Modeler score, and expansion ratio increased as PID decreased. Furthermore, under the high PID data sets, the differences between methods are very small, making distinctions between methods more difficult, but methods were easily distinguished on the low PID conditions. These trends suggest that the choice of alignment method may have little impact when PID is high but can be important when PID is low. The impact of PID on alignment accuracy and downstream analyses have been observed before (e.g., Blackshields et al. 2006 Liu et al. 2009 Sievers et al. 2011), so these observations confirm prior studies.

The best performing methods on the biological data sets were typically T-Coffee and PROMALS (although the relative performance depended on the PID level and the criterion). For example, T-Coffee had the highest average SP-scores for the low PID data sets but not for the high PID data sets where PROMALS and many other methods had higher SP-scores. MAFFT-homologs and CONTRAlign also had good Modeler and SP-scores on the biological data sets, coming in the first four positions for all benchmarks. The good overall performance of MAFFT-homologs, PROMALS, and T-Coffee is noteworthy since these methods share a common strategy of recruiting homologs from an external database to use in the alignment task. Finally, BAli-Phy produced the best Modeler scores but came in at position 11 (out of 14) for its SP-score.

Results on the simulated data sets showed different trends: as they are inherently unsuited for simulated data, T-Coffee and PROMALS were not among the better methods for SP-score or Modeler score, and BAli-Phy had better scores than all the other methods for both criteria. Hence, the relative performance of methods seems to depend on PID, the criterion (i.e., Modeler score or SP-score), and—to some extent—whether the data were biological or simulated. In particular, our study shows that BAli-Phy, a leading statistical method for coestimating alignments and trees, had the best Modeler scores and SP-scores of all the methods we examined on simulated data sets but lower SP-scores than many methods on the biological data sets.

To understand this difference in performance, it is helpful to consider the tendency of methods to either underalign (i.e., produce alignments that are longer than the reference alignment) or overalign (i.e., produce alignments than are shorter than the reference alignment). Our study shows that that many methods tended to overalign (producing expansion ratios substantially less than 1.0) under challenging conditions the major exceptions to this were BAli-Phy (which underaligned the most of all methods), DiAlign, and PRANK (some other methods also underaligned but to lesser degrees). Interestingly, in contrast to the other alignment methods, BAli-Phy never underaligned on the simulated data, even under the most challenging conditions. Underalignment is also demonstrated by higher Modeler scores than SP-scores, a trend consistently produced by BAli-Phy on the biological data (where the overall gap was 0.13), but never on the simulated data (where BAli-Phy had average Modeler and SP-scores that were within 0.01 for every model condition). In other words, our data show that BAli-Phy underaligned on the biological data with respect to the reference alignment, but did not underalign on the simulated data with respect to the true alignment. The fact that BAli-Phy underaligned on biological data but not on simulated data explains the change in performance for BAli-Phy between biological and simulated data.

The performance of PRANK in our study is interesting to consider, since PRANK is designed to be “phylogeny-aware,” and so has some similarities to BAli-Phy in terms of approach. On biological data Prank produced slightly higher Modeler scores than SP-scores (but on average within 0.04 of each other) on the simulated data Prank also produced larger Modeler scores, but the gap was larger (0.15), at least for the most difficult model condition. Prank underaligned on both simulated and biological data, but the degree to which it underaligned was larger on the simulated data. Thus, like BAli-Phy, PRANK tended to underalign on the biological data and responded differently to the biological and simulated data. However, PRANK was not competitive with the better methods in our study on either the biological or simulated data for any criterion, while BAli-Phy generally had the best (or close to the best) Modeler scores under all conditions, and only had reduced SP-scores on the biological data. As we have seen, PRANK had very good accuracy (even if not the best accuracy) under conditions with high PID, but relatively poor accuracy (compared to the better methods) under the low PID conditions, such as occur under high rates of evolution. PRANK’s reduced accuracy on the simulated data sets with lower PID is perhaps surprising, given that PRANK had superior alignment accuracy in prior simulation studies ( Löytynoja and Goldman 2008). However, a careful examination of Löytynoja and Goldman (2008) reveals that the simulation conditions in which PRANK provided outstanding accuracy had substitutions operating under the simplest model (Jukes–Cantor with a strict molecular clock), which may have favored PRANK in some way.



تعليقات:

  1. Christofor

    أحسنت فكرة ممتازة

  2. Ramone

    يشعر المرء أن الموضوع ليس قريبًا تمامًا من المؤلف.

  3. Maryann

    بالضبط على الهدف :)

  4. Mezentius

    لا يوجد شيء رائع هنا

  5. Cecilius

    قرأت الكثير عن هذا الموضوع اليوم.

  6. Matro

    منحت ، هذا الرأي الرائع



اكتب رسالة