معلومة

15: إنتاج البروتين - علم الأحياء

15: إنتاج البروتين - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

  • 15.1: مقدمة
    لتكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف استخدامات عديدة في البحث العلمي الأساسي لفهم طبيعة الكائنات الحية بشكل أفضل. كأداة ، يمكن استخدام تقنية الحمض النووي المؤتلف للتعبير عن البروتينات نحو التطبيقات الطبية. قبل التكنولوجيا الحيوية ، عولج مرض السكري من النوع الأول (المعتمد على الأنسولين) عن طريق حقن الأنسولين المعزول من بنكرياس الخنازير. مع القدرة على التعبير عن البروتينات البشرية داخل البكتيريا والخميرة والخلايا الأخرى ، فإن التضحية بالخنازير من أجل الأنسولين الخنازير لم يعد ضروريًا.
  • 15.2: تنقية البروتين (نشاط)
    يسعى هذا التمرين إلى تنقية البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أو البروتين الفلوري الأزرق (BFP) من المحللة البكتيرية. هذه البروتينات لها حجم محدد من 238 حمض أميني و 40.000 دالتون (40 كيلو دالتون). بناءً على حجمهم المحدد ، سيكون لديهم معدل معين للهجرة من خلال راتنج استبعاد الحجم. تذكر أن المحللة البكتيرية مليئة بالبروتينات الإضافية التي ليست بروتينًا مهمًا نحاول عزله.

إنتاج البروتين

لتكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف استخدامات عديدة في البحث العلمي الأساسي لفهم طبيعة الكائنات الحية بشكل أفضل. كأداة ، يمكن استخدام تقنية الحمض النووي المؤتلف للتعبير عن البروتينات نحو التطبيقات الطبية. قبل التكنولوجيا الحيوية ، عولج مرض السكري من النوع الأول (المعتمد على الأنسولين) عن طريق حقن الأنسولين المعزول من بنكرياس الخنازير. مع القدرة على التعبير عن البروتينات البشرية داخل البكتيريا والخميرة والخلايا الأخرى ، لم يعد التضحية بالخنازير من أجل الأنسولين الخنازير ضروريًا.

ناقل التعبير الجرثومي pGEX-3X يحتوي على جين AmpR ، وأصل النسخ المتماثل ، و MCS في اتجاه مجرى مروج lac / trp الهجين (tac) وتسلسل الترميز لـ glutathione-S-transferase (GST). يعمل GST كعلامة يتم دمجها مباشرة مع البروتين من الجين المعني وتستخدم لتنقية البروتين براتنج الجلوتاثيون.

معايير اختيار نظام التعبير


أنظمة التعبير عن البروتين لها مزايا وعيوب متأصلة. يلخص الجدول أعلاه مقارنة أنظمة الإنتاج الخلوية المختلفة (Fernandez & amp Hoeffler ، 1999).

مفاعل حيوي أو مخمر يستخدم لزراعة كميات كبيرة من البكتيريا لإنتاج البروتين. الائتمان: Miropiro CC-BY-SA 3.0)


منشأة أساسية لتعبير البروتين وتنقيته

لتسريع إنتاج البروتين ، اعتمدنا استراتيجية للتعبير المتوازي عن بروتين من مجموعة متنوعة من النواقل التي تحتوي على علامات مختلفة و / أو شركاء اندماج ، ومجموعة متنوعة من سلالات مضيف الإشريكية القولونية. لا ينبغي أن يمنحنا هذا النهج الكثير من الوقت فحسب ، بل يؤدي أيضًا إلى زيادة عدد البروتينات التي يتم التعبير عنها بنجاح.

تتكون استراتيجية التعبير من مجموعتين من التجارب التالية:

1. التعبير عن بروتين في سلالة أساسية من عائل الإشريكية القولونية من نواقل متنوعة بعلامات و / أو شركاء اندماج مختلفين.

شاشتنا الأولى هي التعبير عن بروتين في BL21 (DE3) من ناقلات الحيوانات الأليفة المعدلة مع مجموعة مختارة من العلامات وشركاء الاندماج:

بطاقة شعار شريك الانصهار
N- محطة صاحب6-بطاقة شعار
N- محطة صاحب6-بطاقة شعار ثيوردوكسين
N- محطة صاحب6-بطاقة شعار الجلوتاثيون- S- ترانسفيراز (ضريبة السلع والخدمات)
N- محطة صاحب6-بطاقة شعار بروتين رابط المالتوز (MBP)
N- محطة صاحب6-بطاقة شعار أوكسيريدوكتاز ثنائي كبريتيد (DsbA)
N- محطة صاحب6-بطاقة شعار نوسا
ج- محطة صاحب6-بطاقة شعار

2. التعبير عن بروتين من ناقل معياري في عدد مختلف بكتريا قولونية سلالات المضيف.

يعتمد اختيار السلالات المضيفة بشكل أكبر على طبيعة البروتين غير المتجانسة. يجب مراعاة الاعتبارات التالية:

  • إذا كان البروتين يحتوي على عدد كبير من نادر بكتريا قولونية الكودونات، من المفيد محاولة التعبير عنها في سلالة تشارك في التعبير عن الحمض النووي الريبي لهذه الكودونات النادرة. هناك العديد من السلالات المتاحة تجاريًا:
  • إذا كان البروتين يحتوي على واحد أو أكثر روابط ثاني كبريتيد، يتم تحفيز الطي المناسب في سلالة المضيف ببيئة حشوية مؤكسدة أكثر. تتوفر سلالتان تجاريًا من Novagen:

  • إذا كان البروتين سامة إلى الخلية ، التعبير في سلالة تحتوي على pLysS أو pLysE ناقلات تشدد تنظيم أنظمة التعبير باستخدام مروج T7. تعبر هذه النواقل عن الليزوزيم ، الذي يرتبط بـ T7 RNA polymerase ويعطله. السلالات متوفرة تجاريا من مختلف الصانعين.

أول شاشة لدينا هي التعبير عن بروتين من ناقل pET معدّل بامتداد N- محطة صاحب6-بطاقة شعار في سلالات المضيف التالية:

سلالة المضيف
BL21 (DE3)
BL21 (DE3) بليس
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL (-RP) أو Rosetta (DE3)
اوريغامي (DE3)

من أجل الفحص السريع لمستويات التعبير وقابلية ذوبان البروتين من النواقل المختلفة وفي السلالات المختلفة ، قمنا بتطوير طريقة على نطاق صغير باستخدام كروماتوجرافيا على الخرزات المغناطيسية.

ستكون نتائج الشاشة الأولى نقطة انطلاق لمزيد من التجارب في حالة عدم العثور على شروط تعبير مرضية. سيتم مناقشة كيفية تحسين مستويات التعبير وتحسين قابلية ذوبان البروتين وتحسين استقرار البروتين وتقليل سمية البروتين في الفصول الأخرى في هذا الموقع.

طريقة التعبير

تتكون تجربة التعبير النموذجي من الخطوة التالية:

  • انتقاء من مستعمرة واحدة من صفيحة مخططة حديثًا لمضيف التعبير تحتوي على ناقل مؤتلف. عندما يكون البروتين غير المتجانسة سامًا للخلايا ، يتم الحصول على مستويات تعبير أعلى باستخدام طريقة "الاقتباس & quot.
  • تزايد أ ثقافة المبتدئين. تلقيح مع المستعمرة المختارة حتى 50 مل من الوسط الغني (مثل رطل أو 2xYT) تحتوي على المضاد الحيوي المناسب. عندما تكون هناك حاجة إلى مزرعة بادئ أكبر ، قم بتلقيح 4 مل من الوسائط الغنية مع المستعمرة المفردة لمدة 4-8 ساعات عند 37 درجة مئوية واستخدم هذا لتلقيح ثقافة البادئ.

لا تدع الثقافات تنمو عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها! من الأفضل أن تنمو الثقافات بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية أو أقل. بدلاً من ذلك ، يمكن تحضين الثقافة عند 37 درجة مئوية حتى OD600 تقريبا. 1. ثم تخزين الثقافة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، اجمع الخلايا عن طريق التسخين المركزي ، وأعد تعليقها في وسط جديد واستخدمها لتلقيح الثقافة الرئيسية.

يتطلب استخدام الأمبيسلين عناية خاصة. يتم إفراز العلامة القابلة للتحديد ، b -lactamase ، في الوسط حيث يتم تحلل كل الأمبيسلين. تم الوصول إلى هذه النقطة بالفعل عندما تكون الثقافة بالكاد عكرة. من الآن فصاعدًا ، لن يتم قتل الخلايا التي تفتقر إلى البلازميد ويمكن أن تتكاثر في الثقافة (والتي يمكن اختبارها باستخدام اختبار ثبات البلازميد). بعض الحلول الممكنة هي:

  • تنمو الثقافات بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية أو أقل.
  • تدور الثقافات بين عشية وضحاها وإعادة تعليق الحبيبات في وسط جديد لإزالة ب-لاكتاماز.
  • استخدام أكثر استقرارا كاربينيسيلين بدلا من الأمبيسلين.
  • تلقيح الثقافة الرئيسية و حضانة حتى التطوير التنظيمي600 يصل إلى 0.4-1. تعتمد قيمة OD المثلى على طريقة الثقافة والوسيط. لمزارع القارورة باستخدام LB-medium an التطوير التنظيمي600من 0.6 موصى به. لزيادة معدل النمو ، نقوم بإجراء الثقافات عند 37 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى OD للتحريض. ثم يتم تبريد المزارع إلى درجة حرارة الحث في الماء المثلج.

ملاحظة: للتهوية الجيدة ، لا تستخدم أكثر من متوسط 20% من الحجم الكلي للقارورة.

  • الحث من التعبير البروتيني. يتم تحفيز تعبير البروتين عن طريق إضافة المحفز المناسب أو عن طريق تغيير ظروف النمو. من هذه النقطة ، ستستخدم الخلايا معظم مواردها لإنتاج البروتين المستهدف ولن تنمو أكثر من ذلك بكثير.

بالنسبة لمعظم المروجين الأكثر استخدامًا ، يتم سرد شروط الاستقراء أدناه.

المروجين الحث حالة نموذجية نطاق
trc (هجين) إضافة IPTG 0.2 ملم 0.05 - 2.0 ملم
اراباد إضافة l- أرابينوز 0.2% 0.002 - 0.4 %
صإل تحويل درجة الحرارة من 37 إلى 42 درجة مئوية
T7-لاك المشغل أو العامل إضافة IPTG 0.2 ملم 0.05 - 2.0 ملم

بعد التحريض ، يتم تحضين الثقافات من 3 ساعات إلى بين عشية وضحاها اعتمادًا على درجة حرارة الاستقراء. يتم إعطاء خطوط الدليل أدناه.


الدور الناشئ لبيولوجيا الأنظمة في هندسة إنتاج البروتين في خلايا CHO

لتلبية الطلب المتزايد باستمرار على علاجات بروتينية فعالة وآمنة وبأسعار معقولة ، هدفت عقود من الجهود المكثفة إلى تعظيم كمية ونوعية البروتينات المؤتلفة المنتجة في خلايا CHO. أدت ابتكارات المعالجة الحيوية وجهود هندسة الخلايا إلى تحسين عيار المنتج ، ومع ذلك ، لا تزال العمليات الخلوية غير المميزة وآليات تنظيم الجينات تعيق نمو الخلايا ، والإنتاجية المحددة ، وجودة البروتين. هنا ، نلخص التطورات الحديثة في بيولوجيا الأنظمة والنهج القائمة على البيانات التي تهدف إلى الكشف عن كيفية تأثير المسارات الجزيئية والعمليات الخلوية والعوامل الخارجية (مثل مكملات الوسائط) على إنتاج البروتين المؤتلف. على وجه الخصوص ، مع استمرار نمو بيانات omics المتاحة لخلايا CHO ، سيتم استخدام النماذج والشاشات التنبؤية بشكل متزايد لكشف الدوافع البيولوجية لإنتاج البروتين ، والتي يمكن استخدامها مع تقنيات تحرير الجينوم الناشئة لهندسة الخلايا بشكل عقلاني لزيادة التحكم في الكمية والجودة والقدرة على تحمل تكاليف العديد من الأدوية البيولوجية.

حقوق النشر © 2017 Elsevier Ltd. جميع الحقوق محفوظة.

الأرقام

الشكل 1. ثلاث موجات من تقنيات مختلفة ...

الشكل 1. ثلاث موجات من التقنيات المختلفة مكنت من التحسين المستمر لإنتاج البروتين المؤتلف ...

الشكل 2. إنتاجية محددة منشورة ، كثافة الخلية ...

الشكل 2. تحسنت الإنتاجية المحددة المنشورة وكثافة الخلية ومعيار المنتج الإجمالي بشكل مطرد على مدى ...


1 إجابة 1

أطرح هذا السؤال لفهم ما إذا كانت الخلايا التي تُستخدم في تكوين بروتينات سبايكة تتعرض للهجوم من قبل الجهاز المناعي.

نعم ، هذا هو الهدف من لقاحات الحمض النووي الريبي (RNA)!

لكن لا تقلق ، فهذا شيء جيد ، كما يمكن استنتاجه من ورقة المراجعة هذه ، التي تؤكد على ميزة لقاحات الحمض النووي الريبي لاستدعاء الاستجابة المناعية الخلوية:

على الرغم من أن لقاحات الوحدات الفرعية قد تم استخدامها بنجاح لاستنباط مناعة خلطية ضد مجموعة واسعة من مسببات الأمراض ، إلا أنها تفشل في تحفيز المناعة الخلوية المطلوبة للقضاء على خزان الممرض داخل الخلايا للعديد من الأمراض المزمنة ، بما في ذلك العدوى الفيروسية مثل فيروس نقص المناعة البشرية أو التهاب الكبد سي.

الفكرة الأساسية هي أن المستضدات المقدمة من اللقاحات التقليدية تميل إلى تقديمها عبر MHC2 ، بدلاً من التسبب في مناعة خلطية ، بينما بعد تعداء الحمض النووي الريبي ، يمكن أيضًا تقديم الببتيدات المنتجة خلويًا على MHC1 ، مما يتسبب في المناعة الخلوية.


البحوث الأصلية المادة

Nadide Altincekic 1،2 & # x02020 ، صوفي ماريان كورن 2،3 & # x02020 ، نصرت شاهين قريشي 1،2 & # x02020 ، ماري دوجاردان 4 & # x02020 ، Mart & # x000ed Ninot-Pedrosa 4 & # x02020 ، روبرت أبيل 5 ، ماري جوزيه أبي سعد 6 ، كاترينا ألفانو 7 فابيو سي إل ألميدا 8،9 ، إسلام الشاملة 1،2 ، جيزيل كاردوسو دي أموريم 8،10 ، توماس ك.أندرسون 11 ، كريستيان د.أنوبوم 8،12 ، تشيلسي أنورما 13 ، جاسلين كور باينز 1،2 ، Adriaan Bax 14 ، مارتن بلاكليدج 15 ، يوليوس بليشار 1،2 ، Anja B & # x000f6ckmann 4 & # x0002a & # x02021 ، لويس بريجاندات 4 ، آنا بولا 16 ، ماتياس ب & # x000fctikofer 6 ، ألدو ر. كاماتشو زاركو 15 ، تيريزا كارلوماجنو 17،18 ، إيكارو بوتينهون كاروسو 8،9،19 ، رهان & # x000fcl سيلان 1،2 ، Apirat Chaikuad 20،21 ، فيكسيا تشو 22 ، لورا كول 4 ، ماركيز جي كروسبي 23 ، فانيسا دي جيسوس 1،2 ، Karthikeyan Dhamotharan 2،3 ، إيزابيلا سي فيلي 24،25 ، جان فيرنر 1،2 ، يانيك فليشمان 6 ، ماري لوري فوجيرون 4 ، نيكولاوس ك. فوركيوتيس 26 ، كريستين فوكس 1 ، بوريس F & # x000fcrtig 1،2 ، أنجيلو جالو 26 ، Santosh L. Gande 1،2 ، خوان أتيليو جيريز 6 ، ديمان غوش 6 ، فرانسيسكو جوميز نيتو 8،27 ، أوكسانا جورباتيوك 28 ، سيرافيما جوسيفا 15 ، كارولين هاكر 29 ، سابين H & # x000e4fner 30 ، بنج هاو 28 ، برونو هارجيتاي 1،2 ، K. Henzler-Wildman 11 ، جيفري سي هوش 28 ، كاثرينا ف.هوهمان 1،2 ، ماري ت. هاتشيسون 1،2 ، Kristaps Jaudzems 16 ، كاتارينا جوفي & # x00107 22 ، جانينا قادرلي 6 ، جينتس كالني & # x00146 & # x00161 31 ، إيفيتا كا & # x00146epe 16 ، روبرت إن كيرشدويرفر 11 ، جون كيركباتريك 17،18 ، ستيفان كناب 20،21 ، روبن كريشناتاس 1،2 ، فيليسيتاس كوتز 1،2 ، سوزان زور لاج 18 ، رودريك لامبرتز 3 ، أندراس لانغ 30 ، دوغلاس لورنتس 32 ، لوريان ليكوك 4 ، فيرينا لينهارد 1،2 ، فرانك L & # x000f6hr ​​2،33 ، أنس مالكي 15 ، لويزا ماميغونيان بيسا 15 ، راشيل دبليو مارتن 13،23 ، توبياس ماتزيل 1،2 ، داميان مورين 15 ، سيث دبليو مكنوت 22 ، Nathane Cunha Mebus-Antunes 8،9 ، فاز هـ. ماير 6 ، ناتالي مايزر 1 ، ميغيل مومبي & # x000e1n 32 ، إليسا موناكا 7 ، Roland Montserret 4 ، لورا ماري & # x000f1o بيريز 15 ، سيلين موسر 34 ، كلوديا موهل جول 34 ، تايلاندى كريستينا نيفيس مارتينز 8،9 ، شيامنين ني 20،21 ، برينا نورتون بيكر 13 ، روبرتا بييراتيلي 24،25 ، ليتيزيا بونتورييرو 24،25 ، يوليا بوستوفالوفا 28 ، Oliver Ohlenschl & # x000e4ger 30 ، جوليان أورتس 6 ، أندريا ت.دا بويان 9 ، دينيس ج.بيبر 1،2 ، كريستيان ريختر 1،2 ، رولاند ريك 6 ، تشاد م. رينسترا 35 ، أنجوس روبرتسون 14 ، أندرسون س.بينيرو 8،12 ، رافاييل سابباتيلا 7 ، نيكولا سالفي 15 ، كريشنا ساكسينا 1،2 ، ليندا شولت 1،2 ، ماركو شيافينا 24،25 ، Harald Schwalbe 1،2 & # x0002a & # x02021 ، مارا سيلبر 34 ، مارسيوس دا سيلفا ألميدا 8،9 ، مارك أ.سبراغ بيرسي 23 ، جورجيوس أ.سبيرولياس 26 ، سريدهار سريرامولو 1،2 ، جان نيكلاس تانتس 2،3 ، كاسبارس T & # x00101rs 31 ، فيليكس توريس 6 ، سابرينا T & # x000f6ws 3 ، ميغيل & # x000c1. تريفي & # x000f1o 32 ، شاحنات سفين 1 ، Aikaterini C. Tsika 26 ، كريشتينا فارجا 22 ، ينغ وانغ 17 ، ماركو إي ويبر 6 ، جوليا إي ويغان 36 ، كريستوف فيدمان 37 ، جوليا ويرمر بارتوشيك 1،2 ، ماريا الكسندرا ويرتس مارتن 1،2 ، يوهانس زيندر 6 ، مارتن هينجسباخ 1 & # x0002a & # x02021 و أندرياس شلوندت 2،3 & # x0002a & # x02021
  • 1 معهد الكيمياء العضوية والبيولوجيا الكيميائية ، جامعة جوته ، فرانكفورت ، فرانكفورت ، ألمانيا
  • 2 مركز الرنين المغناطيسي الجزيئي الحيوي (BMRZ) ، جامعة جوته فرانكفورت ، فرانكفورت أم ماين ، ألمانيا
  • 3 معهد العلوم البيولوجية الجزيئية ، جامعة جوته ، فرانكفورت ، فرانكفورت ، ألمانيا
  • 4 علم الأحياء الدقيقة الجزيئي والكيمياء الحيوية الإنشائية ، UMR 5086 ، CNRS / جامعة ليون ، ليون ، فرنسا
  • 5 معهد الكيمياء الحيوية ، جامعة جوته ، فرانكفورت ، فرانكفورت ، ألمانيا
  • 6 المعهد الفيدرالي السويسري للتكنولوجيا ، مختبر الكيمياء الفيزيائية ، ETH زيورخ ، زيورخ ، سويسرا
  • 7 وحدة البيولوجيا الهيكلية والفيزياء الحيوية ، Fondazione Ri.MED ، باليرمو ، إيطاليا
  • 8 المركز الوطني للرنين المغناطيسي النووي (CNRMN ، CENABIO) ، الجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو ، ريو دي جانيرو ، البرازيل
  • 9 معهد الكيمياء الحيوية الطبية ، الجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو ، ريو دي جانيرو ، البرازيل
  • 10 مركز متعدد التخصصات للبحوث في علم الأحياء (NUMPEX) ، الحرم الجامعي Duque de Caxias الجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو ، دوكي دي كاكسياس ، البرازيل
  • 11 معهد علم الفيروسات الجزيئية ، جامعة ويسكونسن ماديسون ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة
  • 12 معهد الكيمياء ، جامعة ريو دي جانيرو الفيدرالية ، ريو دي جانيرو ، البرازيل
  • 13 قسم الكيمياء ، جامعة كاليفورنيا ، إيرفين ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة
  • 14 LCP، NIDDK، NIH، Bethesda، MD، الولايات المتحدة
  • 15 جامعة. غرونوبل ألب ، CNRS ، CEA ، IBS ، غرونوبل ، فرنسا
  • 16 معهد لاتفيا للتركيب العضوي ، ريغا ، لاتفيا
  • 17 BMWZ ومعهد الكيمياء العضوية ، جامعة لايبنيز ، هانوفر ، هانوفر ، ألمانيا
  • 18 مجموعة الكيمياء الهيكلية القائمة على الرنين المغناطيسي النووي ، مركز هيلمهولتز لأبحاث العدوى ، براونشفايغ ، ألمانيا
  • 19 مركز متعدد المستخدمين للابتكار الجزيئي الحيوي (CMIB) ، قسم الفيزياء ، جامعة ولاية باولو S & # x000e3o (UNESP) ، S & # x000e3o Jos & # x000e9 do Rio Preto ، البرازيل
  • 20 معهد الكيمياء الصيدلية ، جامعة جوته ، فرانكفورت ، فرانكفورت ، ألمانيا
  • 21 اتحاد الجينوم الإنشائي ، معهد بوخمان لعلوم الحياة الجزيئية ، فرانكفورت أم ماين ، ألمانيا
  • 22 قسم العلوم الجزيئية والخلوية والطبية الحيوية ، جامعة نيو هامبشاير ، دورهام ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة
  • 23 قسم البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية ، جامعة كاليفورنيا ، إيرفين ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة
  • 24 مركز الرنين المغناطيسي (CERM) ، جامعة فلورنسا ، سيستو فيورنتينو ، إيطاليا
  • 25 قسم الكيمياء & # x0201cUgo Schiff & # x0201d ، جامعة فلورنسا ، سيستو فيورنتينو ، إيطاليا
  • 26 قسم الصيدلة ، جامعة باتراس ، باتراس ، اليونان
  • 27 مختبر السموم ، مؤسسة أوزوالدو كروز (FIOCRUZ) ، ريو دي جانيرو ، البرازيل
  • 28 قسم البيولوجيا الجزيئية والفيزياء الحيوية ، UConn Health ، فارمنجتون ، CT ، الولايات المتحدة
  • 29 Signals GmbH & # x00026 Co. KG ، فرانكفورت أم ماين ، ألمانيا
  • 30 معهد لايبنيز للشيخوخة & # x02014 معهد فريتز ليبمان (FLI) ، جينا ، ألمانيا
  • 31 مركز لاتفيا للبحوث الطبية الحيوية والدراسات ، ريغا ، لاتفيا
  • 32 & # x0201cRocasolano & # x0201d معهد الكيمياء الفيزيائية (IQFR) ، المجلس الوطني الإسباني للبحوث (CSIC) ، مدريد ، إسبانيا
  • 33 معهد الكيمياء الفيزيائية الحيوية ، جامعة جوته ، فرانكفورت ، فرانكفورت ، ألمانيا
  • 34 IBG-4 ، معهد كارلسروه للتكنولوجيا ، كارلسروه ، ألمانيا
  • 35 قسم الكيمياء الحيوية والمرفق الوطني للرنين المغناطيسي في ماديسون ، جامعة ويسكونسن ماديسون ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة
  • 36 قسم علم الأحياء ، جامعة دارمشتات التقنية ، دارمشتات ، ألمانيا
  • 37 معهد الكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية ، مركز البروتين تشارلز تانفورد ، جامعة مارتن لوثر هالي-فيتنبرغ ، هاله / سال ، ألمانيا

يعتبر المرض شديد العدوى COVID-19 الناجم عن فيروس بيتاكورون يشكل SARS-CoV-2 تهديدًا خطيرًا للبشرية ويتطلب إعادة توجيه الجهود والمعايير العلمية لمشاريع البحث المنظمة. الدولية COVID19-NMR يسعى الاتحاد إلى توفير مثل هذه الأساليب الجديدة من خلال جمع الخبرات العلمية في جميع أنحاء العالم. على وجه الخصوص ، فإن إتاحة البروتينات الفيروسية والـ RNAs سيمهد الطريق لفهم المكونات الجزيئية لـ SARS-CoV-2 بالتفصيل. البحث في COVID19-NMR ويتم الكشف عن الموارد المقدمة من خلال الكونسورتيوم بالكامل لتسريع الوصول والاستغلال. تم تعيين تحقيقات الرنين المغناطيسي النووي للمكونات الجزيئية الفيروسية لتوفير الأساس الأساسي لمزيد من العمل ، بما في ذلك دراسات التفاعل الجزيئي وفحص الأدوية عالي الإنتاجية. هنا ، نقدم كتالوجًا شاملاً لنهج شامل لإعداد بروتين SARS-CoV-2 استنادًا إلى الجهود الجماعية التي يبذلها الاتحاد. نحن نقدم بروتوكولات للإنتاج على نطاق واسع لأكثر من 80٪ من جميع بروتينات SARS-CoV-2 أو الأجزاء الأساسية منها. تم إنتاج العديد من البروتينات في أكثر من مختبر واحد ، مما يدل على قابلية التشغيل البيني العالية بين مجموعات الرنين المغناطيسي النووي في جميع أنحاء العالم. بالنسبة لغالبية البروتينات ، يمكننا إنتاج عينات ذات علامات نظيرية من فئة HSQC. جنبا إلى جنب مع العديد من مهام التحول الكيميائي NMR المتاحة للجمهور على covid19-nmr.com، نحن نقدم هنا موارد ذات قيمة عالية لإنتاج بروتينات SARS-CoV-2 في شكل مسمى بالنظائر.


إنتاج البروتين وتنقيته

يمكن تعظيم إنتاجية البروتين ونشاطه عن طريق اختيار الكواشف المناسبة وراتنج التنقية المناسب. يتم التعبير عن معظم البروتينات المؤتلفة كبروتينات اندماجية ذات علامات تقارب قصيرة ، مثل متعدد الهيستيدين أو الجلوتاثيون S-ترانسفيراز ، والتي تسمح بالتنقية الانتقائية للبروتين محل الاهتمام.

يعد إنتاج البروتين نظامًا معقدًا من التقانات الحيوية التي تؤثر كل خطوة فيها مع بعضها البعض. تعتمد طريقة تنقية البروتين المؤتلف في الغالب على خصائص البروتين المؤتلف ونظام التعبير المطبق. تقدم Sino Biological خدمة شاملة من الجينات إلى البروتين المنقى مع خبرة سنوات عديدة في التعبير عن البروتين وتقنيات تنقية البروتين وإعادة تشكيله المتعددة. لدينا العديد من أنظمة التعبير عن البروتين مثل البكتيريا والخميرة والفيروس البكتيري ونظام التعبير عن الثدييات وأنظمة تنقية أكثر من 30 للتعامل مع من 2 إلى 1000 لتر لتلبية الإنتاجية العالية والتعبير عن البروتين على نطاق واسع وإنتاجه.

منصة إنتاج البروتين

إنتاج البروتين هو عملية التكنولوجيا الحيوية لتوليد بروتين معين. تشتمل أنظمة إنتاج البروتين المستخدمة بشكل شائع على تلك المشتقة من البكتيريا وخلايا الفيروس البكتيري / خلايا الحشرات وخلايا الثدييات والخميرة.

يعد استخدام نظام التعبير الصحيح لتطبيقك المحدد هو مفتاح النجاح. غالبًا ما تكون قابلية ذوبان البروتين والوظيفة وسرعة التنقية والعائد من العوامل الحاسمة التي يجب مراعاتها عند اختيار نظام التعبير. بالإضافة إلى ذلك ، لكل نظام نقاط القوة والتحديات الخاصة به ، والتي تعتبر مهمة عند اختيار نظام التعبير.

طرق تنقية البروتين

تنقية البروتين تعني تجزئة البروتين والتي تسمى أيضًا المعالجة النهائية. تتضمن تنقية البروتين عددًا من العمليات ، بما في ذلك الضخ والترشيح الفائق ، والتي تنطوي على بيئات قص كبيرة. والأهم من ذلك ، أن علامات البروتين هي أداة مفيدة وملائمة لتحسين قابلية ذوبان البروتينات المؤتلفة ، وتبسيط تنقية البروتين ، والسماح بطريقة سهلة لتتبع البروتينات أثناء تعبير البروتين وتنقيته.

تتوفر مجموعة متنوعة من طرق تنقية البروتين التي يمكن دمجها لتوليد مخطط تنقية مناسب. عادة ، ينفذ المرء سلسلة من خطوات التنقية ، ونادرًا ما يمكن تنقية البروتينات في خطوة واحدة.

تجمع الخطوات المبكرة بين الأساليب منخفضة الدقة وذات السعة العالية في مراحل لاحقة من مخطط التنقية. لتنقية البروتين منخفضة الدقة ، عادةً ما يتم استخدام طرق مثل الترسيب الجزئي وأنظمة التقسيم ثنائية الطور. للتطبيقات التي تتطلب أعلى درجة نقاء وصغيرة نسبيًا تنقية البروتين كميات من البروتين ، يمكن اختيار الكروماتوغرافيا لتنقية البروتين المستهدف بشكل انتقائي.

الطرق الكروماتوجرافية الرئيسية المستخدمة في تنقية البروتين


مشاريعنا

مشاريع البحث والتطوير التكنولوجي (TR & ampD)

من خلال الشراكات القائمة مع مختبرات مشروع القيادة الحيوية الطبية (DBP) ، سيقوم مركز إنتاج البروتين الغشائي وتحليله (COMPPÅ) بتطوير منهجيات جديدة في مجالات البحث والتطوير التكنولوجي (TR & ampD) الموضحة أدناه. بمجرد أن يتم إنشاء هذه التقنيات بشكل كافٍ ، سيتم إتاحتها لمجتمع أبحاث بروتين الغشاء بشكل عام.

تعمل TR & ampD 1 في تطوير التكنولوجيا من أجل الإنتاج الفعال لبروتينات الغشاء المؤتلف.

تقوم TR & ampD 2 بتطوير تقنية لتحسين عينات البروتين الغشائي للتحليل الهيكلي.

تعمل TR & ampD 3 في تطوير فحوصات وظيفية عامة - تنطبق على مجموعة واسعة من بروتينات الغشاء.

تقوم TR & ampD 4 بتطوير تقنية لتحديد الهيكل.

مكون الخدمة والتعاون

يطور COMPPÅ الكواشف وطرق إنتاج العينات وإعدادها والتحليلات الوظيفية وتحديد بنية بروتينات الغشاء. تطبيقات هذه الأساليب لمشاريع المستخدم متاحة كخدمات لمجموعات البحث المتعاونة. على وجه التحديد ، يقبل COMPPÅ التطبيقات الجديدة في سياق مشاريعها الطبية الحيوية الدافعة (DBPs) والمشاريع التعاونية والخدمية (C & ampS).

COMPPÅ مفتوح لمجتمع البحث بشكل عام ، بما في ذلك المتعاونين الحاليين.

مكون التدريب والنشر

يتم توزيع التقنيات التي طورتها COMPPÅ على مجتمع البروتين الغشائي ، وسنوفر أيضًا التدريب على هذه التقنيات.


إنتاج وتنقية GFP

يمكن تطبيق طرق مختلفة للعزل اعتمادًا على خصائص البروتين. كروماتوغرافيا التبادل الأيوني يكون مفيدًا إذا كان للبروتين المعني شحنة محددة تتفاعل مع راتنج معبأ بالشحنة المعاكسة.

الترسيب المناعي

التهيج المناعي: العمود مليء بالبروتين A agarose الذي يرتبط بالأجسام المضادة. ثم يتم تحميل محللات الخلية على الأعمدة حيث تتدفق من خلالها ويسمح لها بالتفاعل مع الجسم المضاد. يتم إجراء عمليات الغسيل لإزالة البروتينات غير المرتبطة على وجه التحديد. يتم استخدام محلول شطف لعرقلة تفاعل الجسم المضاد مع هدف البروتين.

تنقية التقارب

تنقية التقارب يوظف استخدام الأجسام المضادة المحددة التي ترتبط بالبروتين المعني بإحكام شديد للاحتفاظ به في عمود. باستخدام هذه التقنيات ، يتم غسل البروتين المحتفظ به على الراتينج عدة مرات لإزالة البروتينات الأخرى غير اللاصقة على وجه التحديد. ثم يتم استخدام تغيير في درجة الحموضة أو الظروف الأيونية لتعطيل التفاعل مع الراتينج و أزل البروتينات من العمود. يمكن تنقية البروتينات التي تم تصميمها بحيث تحتوي على علامات بواسطة الأجسام المضادة الخاصة بتلك العلامات. إضافةً إلى ذلك ، فإن إضافة 6 أو أكثر من بقايا الهيستيدين المتتالية إلى نهاية البروتين يجعلها عرضة للتنقية باستخدام راتينج Nickel-NTA أو تنقية الكوبالت. في هذه الحالات ، ترتبط علامة 6XHis بهذه الأيونات المعدنية على الراتنج ويتم لصقها بشكل انتقائي.

راتنج النيكل NTA ينسق التقاط بروتين 6His الموسوم

استبعاد حجم

الائتمان: Takometer (CC-BY 2.5)
معظمكم على دراية بمرشحات تنقية المياه. قبل استخدام هذه المرشحات ، يتم نقعها في الماء وتتسرب البقايا الداكنة منها. هذه البقايا الداكنة هي الفحم النشط. يحتوي الفحم المنشط على مسام مجهرية صغيرة تحبس الأشياء الصغيرة مثل الأيونات والجزيئات الأخرى. الهدف الأساسي من هذه المرشحات هو إزالة المعادن والكلور الموجودة في مياه الصنبور. تجعل الطبيعة المسامية للفحم المنشط مفيدًا في حبس الجزيئات في أنظمة تنقية المياه.

تسمى العملية المستخدمة لاحتجاز هذه الجسيمات الصغيرة استبعاد حجم . على عكس الاغاروز الكهربائي للهلام حيث تنتقل الجسيمات الصغيرة عبر المصفوفة بشكل أسرع ، تحبس راتنجات استبعاد الحجم الجزيئات الأصغر.

كلما كان الجزيء أصغر ، كلما طالت مدة بقائه داخل المسام أثناء عبوره عبر المصفوفة.


تقنيات إنتاج البروتين: طرق جديدة لإطعام سكان العالم

الائتمان: CC0 المجال العام

تشكل البروتينات جزءًا أساسيًا من تغذية الإنسان. المصادر الأكثر شيوعًا هي اللحوم والمنتجات الحيوانية مثل الحليب والبيض وحتى النباتات. يتطلب الإنتاج ، وخاصة عن طريق تربية الحيوانات ، موارد هائلة ويسبب مشاكل بيئية خطيرة. أجرى الآن فريق بحثي في ​​جامعة توبنغن بقيادة عالم التكنولوجيا الحيوية البيئية ، البروفيسور لارس أنجينينت من مركز علوم الأرض التطبيقية ، تحقيقًا نظريًا حول كيفية تزويد سكان العالم المتزايدين بالبروتينات دون زراعة تقليدية. باستخدام نهج "القدرة على البروتين" الذي يتم فيه إنتاج البروتينات مباشرةً من المكونات الأساسية المستعادة ، مثل ثاني أكسيد الكربون والأمونيا ، عبر التكنولوجيا الحيوية ، يناقش الفريق الاعتبارات النظرية ، وطرق إنتاج البروتين الصناعي الحالية ، والتقديرات لتحقيق هذا الهدف . في مقالها المنشور في المجلة العلمية جول، خلص الفريق إلى أن النظام الكهروكيميائي والبيوتكنولوجي المشترك قد يكون قادرًا على توفير كميات كبيرة من البروتين للاستهلاك البشري مع استهلاك طاقة منخفض نسبيًا.

يقول لارس أنجينينت: "نحن في أزمة معقدة بسبب الإنتاج الغذائي الحالي". "تربية الماشية لإنتاج البروتين الحيواني على وجه الخصوص تستهلك الكثير من الأراضي والوقود الأحفوري والفوسفور والمياه. كما أنها تولد كميات هائلة من الانبعاثات الضارة بالمناخ." إن إنتاج البروتينات الحيوانية مكلف وغير ميسور التكلفة لكثير من الناس ، خاصة في البلدان شديدة الفقر. لذلك ، فإن هدف Angenent هو جعل إنتاج البروتين رخيصًا ، ودمجه في اقتصاد إعادة التدوير المستدام الذي لا يتطلب الوقود الأحفوري.

كائنات حية متعددة الاستخدامات

تتكون البروتينات بشكل أساسي من العناصر الكيميائية مثل الكربون والأكسجين والهيدروجين والنيتروجين. ومع ذلك ، فإن جسم الإنسان نفسه غير قادر على تكوين جميع مكونات البروتين من مركبات بسيطة ، لذلك علينا تناولها مع طعامنا. سيكون التركيب الكيميائي معقدًا جدًا. ومع ذلك ، هناك ميكروبات وحيدة الخلية تنتج بشكل طبيعي كميات كبيرة من البروتين بتركيبة مغذية للإنسان ، وخاصة الخميرة والفطريات. يشير Angenent إلى أن الباحثين بما في ذلك هو وقائد مجموعة Tübingen البحثية الدكتور Bastian Molitor قد ربطوا العمليات الكهروكيميائية والبيولوجية بطرق مختلفة في عمليات الطاقة إلى البروتين. لكنه يقول إن التركيز في توبنغن هو على مدى كفاءة العمليات الفردية وما إذا كانت مناسبة لأغراضنا. يركز فريق توبنغن على العمليات التي لا تتطلب طاقة ضوئية أو ميكروبات معدلة وراثيًا. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الطاقة من الكهرباء كهربيًا لتقسيم الماء إلى هيدروجين وأكسجين. يمكن لبعض البكتيريا بعد ذلك أكسدة الهيدروجين وتحويله إلى ماء واستخدام الطاقة المنبعثة لتحويل ثاني أكسيد الكربون والأمونيا إلى مواد عضوية أخرى تشكل اللبنات الأساسية للبروتين. يمكن لبعض منتجي البروتين ، مثل الخميرة وبعض الفطريات ، أن يستهلكها الإنسان مباشرة.

جمع الأفكار والنهج

في الستينيات ، بدأ الباحثون في التفكير في كيفية إنتاج البروتينات في شكل ثاني أكسيد الكربون والأمونيا من إفرازات الإنسان. يقول أنجينينت: "هناك ، كانت الفكرة هي إنشاء اقتصاد إعادة التدوير ذي الحلقة المغلقة على نطاق صغير من أجل إرسال الأشخاص في مهمة فضائية طويلة". جاءت أول تجربة صناعية لإنتاج البروتين من مواد بسيطة وطاقة من إنتاج بدائل اللحوم. "لقد اختبرنا الأفكار والأساليب للتطوير العملي السريع ونرى إمكانات كبيرة فيها. ووفقًا لإحدى الدراسات ، هناك حاجة إلى حوالي 2.5 بالمائة فقط من إجمالي الطاقة المولدة لإطعام الناس في جميع أنحاء العالم ببروتينات يتم إنتاجها باستخدام طرق الطاقة إلى البروتين" ، يقول.

ومع ذلك ، فإن مثل هذه الاستراتيجية تتطلب إعادة تفكير جذري في عمليات الإنتاج. في الطريق إلى اقتصاد إعادة التدوير المستدام ، يقول العالم إن البشرية بحاجة إلى المزيد من الفرص لتوليد طاقة متجددة وبنية تحتية لالتقاط وتخزين ثاني أكسيد الكربون - الغاز الذي يُعرف الآن بشكل أكثر شيوعًا بمنتج النفايات الضارة. والأهم من ذلك ، يجب تقوية المزارعين اقتصاديًا للتركيز على الإنتاج المستدام للقمح والخضروات والفواكه والمكسرات وغيرها من المنتجات التي تحل محل البروتين ، مع رعاية الطبيعة.


شاهد الفيديو: تصنيع البروتين (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Harlen

    أعتقد أنك كنت مخطئا. أنا متأكد. نحن بحاجة إلى مناقشة. اكتب لي في PM.

  2. Amoll

    أعتقد أنك لست على حق.

  3. Mahkah

    انا موافق تماما!

  4. Dzigbode

    ماذا فعلت في مكاني؟

  5. Reade

    إنه رائع ، المعلومات المفيدة

  6. Arnott

    هذا مشروط فقط ، لا أكثر



اكتب رسالة