معلومة

4.11.7: فيروسات الحمض النووي المزدوجة - فيروسات الجدري - علم الأحياء

4.11.7: فيروسات الحمض النووي المزدوجة - فيروسات الجدري - علم الأحياء



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

فيروسات الجدري هي عائلة من فيروسات الحمض النووي الكبيرة والمعقدة والمغلفة التي تصيب مجموعة متنوعة من مضيفات الفقاريات واللافقاريات.

أهداف التعلم

  • افحص فيروسات الجدري من حيث صلتها بالأمراض والأبحاث التي تصيب الإنسان

النقاط الرئيسية

  • وأشهر أنواع فيروسات الجدري كان الجدري. يعد الجدري أحد اثنين من الأمراض المعدية التي تم القضاء عليها ، والآخر هو الطاعون البقري ، والذي أعلن القضاء عليه في عام 2011.
  • يتكون الشكل الأكثر وفرة وأبسط عدوى من جسيم فيروس الجدري ، الفيروس الناضج ، من جينوم الحمض النووي الفيروسي المغلف في لب بروتيني وغشاء بروتين شحمي خارجي.
  • تُظهر فيروسات الجدري برنامجًا للتعبير الجيني منظمًا زمنياً: الجينات المبكرة والمتوسطة والمتأخرة تدفع تكاثر الحمض النووي متبوعًا بالتعبير عن البروتينات الهيكلية اللازمة لتجميع الفيروس النسل.

الشروط الاساسية

  • المؤتلف: يشير هذا المصطلح إلى شيء تم تكوينه من خلال دمج العناصر الموجودة في مجموعة جديدة. وبالتالي ، فإن عبارة DNA المؤتلف تشير إلى كائن حي تم إنشاؤه في المختبر عن طريق إضافة DNA من نوع آخر.
  • البروتين الدهني: أي مجموعة كبيرة من معقدات البروتين والدهون مع العديد من الوظائف البيوكيميائية.

فيروسات الجدري هي عائلة من فيروسات الحمض النووي الكبيرة والمعقدة والمغلفة التي تصيب مجموعة متنوعة من مضيفات الفقاريات واللافقاريات. تعتبر فيروسات الجدري ذات أهمية طبية وعلمية على حد سواء بسبب توزيعها الواسع وإمراضية ودورة الحياة التكاثرية السيتوبلازمية. العديد من الأعضاء البارزين ، بما في ذلك فيروس الجدري (العامل المسبب للجدري) ، وفيروس المليساء المعدية (يسبب عدوى جلدية شائعة للأطفال الصغار والبالغين الذين يعانون من كبت المناعة) وفيروس جدري القرود (عامل لمرض يشبه الجدري في أجزاء من أفريقيا) ، هم من قلق كبير على الصحة العامة والدفاع البيولوجي.

وأشهر أنواع فيروسات الجدري كان الجدري. كان الجدري مرضًا معديًا ينفرد به البشر ، وينتج عن أي من متغيرين من الفيروسات ، Variola major و Variola min. يُعرف المرض أيضًا بالأسماء اللاتينية Variola أو Variola vera ، وهي مشتق من اللاتينية varius ، والتي تعني "spotted" أو varus ، وتعني "pimple". استخدم مصطلح "الجدري" لأول مرة في بريطانيا في القرن الخامس عشرذ قرن للتمييز بين الجدري "الجدري الكبير" (الزهري). تم تشخيص آخر حالة طبيعية للجدري (Variola طفيف) في 26 أكتوبر 1977. بعد حملات التطعيم طوال 19ذ و 20ذقرون ، أقرت منظمة الصحة العالمية (WHO) القضاء على الجدري في عام 1979. الجدري هو واحد من اثنين من الأمراض المعدية التي تم القضاء عليها ، والآخر هو الطاعون البقري ، والذي تم الإعلان عن القضاء عليه في عام 2011.

يعتبر فيروس الجدري النموذجي والأكثر دراسة ، فيروس اللقاح (VACV) ، بمثابة لقاح فعال ضد الجدري ، ومنصة للقاحات المؤتلفة ضد مسببات الأمراض الأخرى ، وناقل فعال للتعبير الجيني للبحث الأساسي. على طول جينوم الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل والذي يبلغ 195 كيلو بايت تقريبًا ، يشفر VACV ما يقرب من 200 بروتين ، تتراوح في وظيفتها من الحمض النووي الريبي الفيروسي وتوليف الحمض النووي وتجميع الفيروس إلى تعديل دفاعات المناعة المضيفة.

يتكون الشكل الأكثر وفرة وأبسط عدوى من جسيم فيروس الجدري ، الفيروس الناضج (MV) ، من جينوم الحمض النووي الفيروسي المغلف في لب بروتيني وغشاء بروتين شحمي خارجي مع ما يقرب من 60 و 25 بروتينًا فيروسيًا مرتبطًا ، على التوالي. بعد التعلق بأسطح الخلايا والاندماج مع البلازما أو الغشاء الداخلي ، يبدأ تكاثر فيروس الجدري عن طريق دخول النواة الفيروسية إلى السيتوبلازم ، حيث تحدث جميع الخطوات اللاحقة لدورة الحياة. تحتوي نوى فيروس الجدري على بوليميريز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي وعوامل النسخ اللازمة للتعبير عن الجينات المبكرة ، والتي تشكل ما يقرب من نصف الجينوم الفيروسي وتشفر البروتينات اللازمة لتكرار الحمض النووي ونسخ الجينات الوسيطة ، بالإضافة إلى عدد كبير من أجهزة المناعة.

تُظهر فيروسات الجدري برنامجًا للتعبير الجيني منظمًا مؤقتًا ، أي التعبير عن الجينات المبكرة التي تشفر تكرار الحمض النووي وعوامل النسخ الوسيطة تؤدي إلى التعبير عن الجينات الوسيطة التي تشفر عوامل النسخ المحددة للجينات المتأخرة. تتكون منتجات الجينات المتأخرة بشكل أساسي من البروتينات الهيكلية اللازمة لتجميع ذرية الفيروس ، بالإضافة إلى تلك الإنزيمات الموجهة للاندماج في فيريونات النسل ، وتستخدم للتعبير الجيني المبكر خلال الجولة التالية من العدوى. يتضمن تجميع MV أكثر من 80 منتجًا جينيًا فيروسيًا. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء العبور عبر السيتوبلازم ، تكتسب مجموعة فرعية من MVs ذرية اثنين من طبقات الغشاء الإضافية ، أحدهما يضيع أثناء طرد الجسيم ، لإنتاج الفيريون المغلف الأقل وفرة (EV). وبالتالي ، فإن EV هي في الأساس MV مع غشاء إضافي ترتبط فيه ستة بروتينات فريدة على الأقل. تختلف المركبات الكهربائية من الناحية المستضدية عن MVs وهي مهمة لنشر الفيروس بكفاءة في المضيف المصاب والحماية من الدفاعات المناعية. في المقابل ، يتم إطلاق MVs عند تحلل الخلية وقد تكون مهمة للانتقال من حيوان إلى حيوان.


اكتشف الباحثون كيف تتطور فيروسات الجدري مثل الجدري بسرعة - على الرغم من معدلات الطفرات المنخفضة

سياتل - 16 أغسطس 2012 - فيروسات الجدري ، وهي مجموعة من الفيروسات المحتوية على الحمض النووي والتي تشمل الجدري ، مسؤولة عن مجموعة واسعة من الأمراض في البشر والحيوانات. إنها شديدة الضراوة وقادرة على عبور حواجز الأنواع ، ومع ذلك فإن كيفية قيامها بذلك كانت إلى حد كبير لغزا بسبب معدلات طفراتها المنخفضة.

في حين اعتبرت منظمة الصحة العالمية أن الجدري قد تم القضاء عليه رسميًا في عام 1980 ، فإن المخاوف بشأن استخدامه كعامل إرهاب بيولوجي - واكتشاف أن فيروسات الجدري الأخرى ، مثل جدري القرود ، يمكن أن تنتقل من الحيوانات إلى البشر - حفزت اهتمامًا متجددًا بفهم كيفية استخدامها. استنساخ. قد يؤدي وجود هذه المعلومات في متناول اليد إلى تطوير استراتيجيات أفضل لمكافحة الفيروسات.

كشف بحث جديد أجراه علماء في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان والمؤسسات المتعاونة عن كيفية تطور فيروسات الجدري للتكيف السريع ضد دفاعات المضيف - على الرغم من معدلات الطفرات المنخفضة.

يوفر هذا الاكتشاف نظرة ثاقبة جديدة حول كيفية تهرب فيروسات الحمض النووي الكبيرة مزدوجة الشريطة من مناعة المضيف وتصبح مقاومة للأدوية ، وله آثار خاصة لفهم آليات انتقال الأمراض المعدية بين الحيوانات والبشر.

يصف المؤلف الرئيسي هارميت س.مالك ، حاصل على دكتوراه ، وعضو في قسم العلوم الأساسية في مركز هاتشينسون ، والمؤلف الأول نيلز سي إلدي ، دكتوراه ، وباحث سابق لما بعد الدكتوراه في مختبر مالك ، النتائج التي توصلوا إليها عبر الإنترنت قبل الدراسة. 17 أغسطس ، نسخة مطبوعة من زنزانة.

قال إلد ، وهو الآن أستاذ مساعد في علم الوراثة البشرية في كلية الطب بجامعة يوتا: "تقوم فيروسات الجدري بتشفير مجموعة متنوعة من الجينات التي تساعدها على مواجهة الدفاعات المناعية للمضيف وتعزيز العدوى". "على الرغم من الأدلة الوافرة على أن جينوم فيروس الجدري يمكن أن يخضع لتغييرات تكيفية للتغلب على دفاعات المضيف المتطورة ، ما زلنا لا نعرف الكثير عن الآليات التي ينطوي عليها هذا التكيف."

لتحديد آليات التكيف ، أجرى إلد ومالك وزملاؤه تجربة في زراعة الخلايا باستخدام فيروس اللقاح ، وهو نوع فيروس الجدري المستخدم في لقاح الجدري ، لتقليد التكيف والتطور الفيروسي كما يحدث في الطبيعة.

أظهرت الأبحاث السابقة أن بروتين دفاع المضيف المسمى بروتين كيناز R (PKR) يمثل عقبة رئيسية أمام الإصابة بفيروس الجدري. رداً على ذلك ، تطورت فيروسات الجدري للتغلب على PKR عن طريق ترميز جينين ، K3L و E3L ، اللذين يحبطان آليات دفاع المضيف التي تمنع عادةً العدوى الفيروسية.

درس الفريق كيف أن فيروس اللقاح ، عند تعديله لحذف جين E3L ، تطور ليتكاثر بنجاح في وجود PKR البشري.

قال مالك ، وهو أيضًا عالم مهني مبكر في معهد هوارد هيوز الطبي: "بشكل كبير ، أدى الانتشار المتسلسل لهذا الفيروس" الأضعف "بسرعة إلى سلالات أصبحت أكثر نجاحًا في التكاثر في الخلايا البشرية.

كشف الفحص الدقيق لطريقة تكيفهم أن الفيروس تمكن بسرعة من هزيمة PKR من خلال زيادة عدد نسخ جين K3L في جينومه بشكل انتقائي.

شبه مالك هذا التكيف السريع بتوسع منفاخ الأكورديون الموسيقي. وقال: "مع زيادة عدد نسخ K3L في جولات لاحقة من النسخ المتماثل ، زاد التعبير عن بروتين K3L وما تلاه من تثبيط للاستجابة المناعية". أظهر هذا أن الفيروسات التي يمكن أن توسع جينومها بسرعة لها ميزة تطورية فورية على تلك التي لا تستطيع ذلك.

في امتداد إضافي لتشبيه الأكورديون ، بالإضافة إلى ملاحظة التوسع الجيني السريع في سلالة اللقاح التي تعاني من نقص E3L ، لاحظ الباحثون أيضًا أن الفيروس قد تعاقد بعد اكتساب طفرة تكيفية ، مبادلة طفرة مفيدة ببصمة جينومية أصغر.

قال مالك: "تشير دراساتنا إلى أنه على الرغم من طبيعتها العابرة ، فإن التوسعات الجينية قد توفر وسيلة فعالة للتكيف في فيروسات الجدري ، مما يسمح لها بالبقاء على قيد الحياة إما في التحديات المناعية أو الدوائية". "إن التعرف على الوسائل التي يخضعون بها لهذا التوسع قد يوفر استراتيجيات أكثر فاعلية لمكافحة الفيروسات ضد هذه العوامل الممرضة الهامة المرتبطة بها."

قامت المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة الوطنية للعلوم ومعهد هوارد هيوز الطبي ومؤسسة أبحاث علوم الحياة بتمويل البحث. بالإضافة إلى الباحثين في مركز هاتشينسون وكلية الطب بجامعة يوتا ، تضمنت الدراسة أيضًا متعاونين في كلية الطب بجامعة واشنطن.


يكشف الباحثون عن آلية العمل الداخلية لمحرك تعبئة الحمض النووي الفيروسي

صورة: كشفت ثلاث دراسات عن كيفية عمل محرك تعبئة الحمض النووي الفيروسي ، مما قد يوفر رؤى حول العلاجات الجديدة أو الآلات الجزيئية الاصطناعية. يتم تجميع كل بروتين من خمسة بروتينات في. عرض المزيد

الائتمان: جوشوا باجاك ، جامعة ديوك

دورهام ، نورث كارولاينا - اكتشفت مجموعة من الباحثين الإجراءات الداخلية التفصيلية للمحرك الجزيئي الذي يحزم المواد الجينية في فيروسات DNA مزدوجة الشريطة. يقدم هذا التقدم نظرة ثاقبة لخطوة حاسمة في دورة تكاثر الفيروسات مثل الجدري والهربس والفيروسات الغدية. يمكن أن يكون مصدر إلهام للباحثين الذين يصنعون آلات مجهرية تعتمد على المحركات الحيوية التي تحدث بشكل طبيعي.

أجرى البحث علماء من جامعة ديوك وجامعة مينيسوتا وجامعة ماساتشوستس والفرع الطبي بجامعة تكساس (UTMB). تظهر النتائج على الإنترنت في ثلاثية من الأوراق المنشورة في تقدم العلم, وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم و بحوث الأحماض النووية.

قال غوراف أريا ، أستاذ الهندسة الميكانيكية وعلوم المواد والهندسة الطبية الحيوية ، "كان هناك العديد من المعلومات المفقودة التي حالت دون فهم كيفية عمل هذه الأنواع من محركات تغليف الحمض النووي ، والتي أعاقت قدرتنا على تصميم العلاجات أو تطوير تقنيات جديدة". والكيمياء في ديوك. "ولكن مع الرؤى والمحاكاة الجديدة ، تمكنا من تجميع نموذج لهذه الآلية الرائعة ، وهو الأكثر تفصيلاً الذي تم إنشاؤه على الإطلاق لهذا النوع من الأنظمة."

تأتي الفيروسات في العديد من الأصناف ، لكن تصنيفها يعتمد عمومًا على ما إذا كانت ترمز مخططاتها الجينية إلى الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أحادي أو مزدوج الشريطة. الاختلاف مهم من نواح كثيرة ويؤثر على كيفية تعبئة المادة الجينية في فيروسات جديدة. بينما تقوم بعض الفيروسات ببناء حاوية بروتين تسمى قفيصة حول الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي المنتج حديثًا ، يقوم البعض الآخر بإنشاء القفيصة أولاً ثم تملأها بالمواد الجينية.

تأخذ معظم فيروسات الحمض النووي مزدوجة الشريطة المسار الأخير ، والذي يمثل العديد من التحديات. الحمض النووي مشحون سالبًا ولا يريد أن يتكدس معًا في مساحة صغيرة. ويتم تعبئتها في هيكل كثيف للغاية ، شبه بلوري ، والذي يتطلب أيضًا الكثير من القوة.

قال جوشوا باجاك ، طالب دكتوراه يعمل في مختبر آريا: "الفائدة من ذلك أنه عندما يكون الفيروس جاهزًا لإصابة خلية جديدة ، فإن الضغط يساعد على حقن الحمض النووي في الخلية بمجرد ثقبها". "تشير التقديرات إلى أن الضغط يتجاوز 800 رطل لكل بوصة مربعة ، وهو ما يقرب من عشرة أضعاف الضغط في زجاجة شمبانيا مغطاة بالفلين."

يتطلب دفع الحمض النووي إلى قفيصة صغيرة عند هذا القدر من الضغط محركًا قويًا للغاية. حتى وقت قريب ، كان لدى الباحثين فقط إحساس غامض بكيفية عمل هذا المحرك بسبب صعوبة تخيله. يتجمع المحرك فقط على جسيم الفيروس ، وهو ضخم مقارنة بالمحرك.

وقال باجاك: "إن محاولة رؤية المحرك المرتبط بالفيروس يشبه محاولة رؤية التفاصيل في شعلة تمثال الحرية من خلال التقاط صورة للتمثال بأكمله".

ولكن في مؤتمر عقد مؤخرًا ، علم باجاك أن مارك مورايس ، أستاذ الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية في جامعة UTMB ، وبول جاردين ، أستاذ العلوم التشخيصية والبيولوجية في جامعة مينيسوتا ، كانا يعملان على هذا المحرك لسنوات ولديهما المعدات و المهارات اللازمة لمعرفة التفاصيل. يبدو أن بعض نتائجهم الأولية تتطابق مع النماذج التي كان باجاك يبنيها مع القليل من المعلومات المتوفرة بالفعل. ازداد حماس المجموعة لأن نتائجهم المنفصلة كانت تتقارب نحو آلية مشتركة وشرعوا بسرعة في حل لغز المحرك الفيروسي معًا.

في ورقة نشرت في تقدم العلمقام Morais وزملاؤه بحل تفاصيل المحرك بالكامل في أحد تكويناته. ووجدوا أن المحرك يتكون من خمسة بروتينات مرتبطة ببعضها البعض في شكل يشبه الحلقة. كل من هذه البروتينات يشبه كوبين ماصين مع زنبرك بينهما ، مما يسمح للجزء السفلي بالتحرك عموديًا في تشكيل حلزوني حتى يتمكن من الإمساك بالعمود الفقري الحلزوني للحمض النووي.

قال مورايس: "نظرًا لأنه كان بإمكانك وضع حوالي 100000 من هذه المحركات على رأس دبوس وكلها تهتز حولها ، فقد كان من الصعب إلقاء نظرة فاحصة عليها". "ولكن بعد أن ساعدنا زملائي في جامعة UTMB مايكل وودسون ومارك وايت في تصويرهم باستخدام مجهر إلكتروني بالتبريد ، تم وضع إطار عام للآلية في مكانه الصحيح."

في ورقة ثانية ، نشرت في بحوث الأحماض النووية، استولت مجموعة Morais على المحرك في تكوين ثان باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية. هذه المرة تم تجميع أكواب الشفط السفلية للمحرك معًا في حلقة مستوية ، مما دفع الباحثين إلى تخيل أن المحرك قد ينقل الحمض النووي إلى الفيروس عن طريق التصعيد بين التكوينين.

لاختبار هذه الفرضية ، أجرى باجاك وآريا عمليات محاكاة للخدمة الشاقة على Anton 2 ، أسرع كمبيوتر عملاق متاح حاليًا لتشغيل عمليات محاكاة الديناميكيات الجزيئية. لم تدعم نتائجهم الآلية المقترحة فحسب ، بل قدمت أيضًا معلومات حول كيفية الالتواء الدقيق لتروس المحرك بين التكوينين.

بينما تظل قمم البروتينات مرتبطة بشكل ثابت بجسيم الفيروس ، يتحرك نصفيها السفليين لأعلى ولأسفل في نمط دوري مدعوم بجزيء يحمل الطاقة يسمى ATP. بمجرد أن ترتفع جميع البروتينات - تسحب الحمض النووي معها - تطلق البروتينات المنتج الثانوي للتفاعل الكيميائي ATP. يؤدي هذا إلى إطلاق الحلقة السفلية للحمض النووي والعودة إلى حالتها الحلزونية الأصلية ، حيث تمسك مرة أخرى بالمزيد من ATP والحمض النووي لتكرار العملية.

قال آريا: "جمع جوشوا الكثير من القرائن والمعلومات لإنشاء هذا النموذج". "لكن النموذج يكون مفيدًا فقط إذا كان بإمكانه التنبؤ برؤى جديدة لم نكن نعرفها بالفعل."

النموذج في جوهره عبارة عن سلسلة من الإجراءات الميكانيكية التي يجب أن تتلاءم معًا وتحدث بترتيب تسلسلي حتى يعمل كل شيء بشكل صحيح. تنبأت محاكاة باجاك بسلسلة محددة من الإشارات الميكانيكية التي تخبر قيعان البروتينات ما إذا كان ينبغي لها أن تمسك بالحمض النووي أم لا. مثل سقوط خط من قطع الدومينو ، فإن إزالة أحد مسارات الإشارات من الوسط يجب أن يوقف التفاعل المتسلسل ويمنع الإشارة.

للتحقق من صحة هذا التوقع ، لجأ الباحثون إلى جاردين وزملائه شيلي غرايمز ودوايت أندرسون لمعرفة ما إذا كانت إزالة إحدى قطع الدومينو التي تشير بالفعل قد أوقفت المحرك عن تعبئة الحمض النووي. ورقة ثالثة ، نشرت في PNAS، يوضح أن التخريب نجح. بعد تحور قطعة الدومينو في مسار الإشارة بحيث تصبح غير قادرة على العمل ، لا يزال بإمكان المحرك ربط الوقود وحرقه تمامًا كما كان دائمًا ، لكنه كان أسوأ بكثير في تعبئة الحمض النووي.

قال جاردين: "الآلية الجديدة التي تنبأت بها الهياكل عالية الدقة والتنبؤات التفصيلية قدمت مستوى من التفاصيل أكبر مما كان لدينا من قبل". "سمح لنا هذا باختبار دور المكونات الحرجة للمحرك ، وبالتالي تقييم صلاحية هذه الآلية الجديدة كما نفهمها حاليًا."

والنتيجة هي إشارة قوية إلى أن النموذج قريب جدًا من وصف كيفية تصرف المحرك في الطبيعة. تخطط المجموعة لمواصلة نهجها الهيكلي والكيميائي الحيوي والمحاكاة المتكامل للغاية لمزيد من الاختبار والتنقيح للنموذج المقترح. إنهم يأملون في إمكانية استخدام هذا الفهم الأساسي في يوم من الأيام لمحاربة المرض أو إنشاء محرك جزيئي اصطناعي.

قال آريا: "كل التقنيات مستوحاة من الطبيعة بطريقة أو بأخرى". "الآن بعد أن عرفنا حقًا كيف يعمل هذا المحرك الجزيئي ، نأمل أن يلهم باحثين آخرين لابتكار اختراعات جديدة باستخدام هذه الآليات نفسها."

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (GM118817 ، GM122979 ، GM127365) والمؤسسة الوطنية للعلوم (MCB1817338). تم أيضًا جمع بيانات Cryo-EM في مرافق التصوير بالتبريد الإقليمية المدعومة من NIH (1U24 GM116787-01 ، 1U24 GM116792-01). تم إجراء عمليات المحاكاة على الكمبيوتر العملاق Anton 2 الذي أتاحه D.E. شو للأبحاث واستضافتها في مركز بيتسبرغ للحوسبة الفائقة عبر المعاهد الوطنية للصحة (R01GM116961) والكمبيوتر العملاق المذنب المستضاف في مركز سان دييغو للكمبيوتر العملاق عبر NSF (ACI-1053575).

"التغليف الفيروسي ATPases يستخدم مفتاح الجلوتامات إلى نشاط ATPase الزوجي ونقل الحمض النووي." جوشوا باجاك وروكني آتز وبريندان جيه هيلبرت ومارك سي مورايس وبريان إيه كيلش وبول جاردين وجوراف آريا. PNAS، 27 أبريل 2021118 (17) e2024928118. DOI: 10.1073 / pnas.2024928118

"ينتقل محرك تعبئة الجينوم الفيروسي بين التناظر الدوري والحلزوني إلى انتقال dsDNA ،" مايكل وودسون ، جوشوا باجاك ، بريون ب. مورايس. تقدم العلم، 07 مايو 2021: المجلد. 7 ، لا. 19 ، إيبك 1955. DOI: 10.1126 / sciadv.abc1955

"الأساس الذري لتوليد القوة والانتقال والتنسيق في محرك تعبئة الجينوم الفيروسي" ، جوشوا باجاك ، وإريك ديل 2 ، وإميليو رييس ألدريت ، ومارك إيه وايت ، وبريان إيه كيلش ، وبول جيه جاردين ، وجوراف أريا 1 ، ومارك جيم مورايس. بحوث الأحماض النووية، 2021. DOI: 10.1093 / nar / gkab372

تنصل: AAAS و EurekAlert! ليست مسؤولة عن دقة النشرات الإخبارية المرسلة على EurekAlert! من خلال المؤسسات المساهمة أو لاستخدام أي معلومات من خلال نظام EurekAlert.


يكشف الباحثون عن آلية العمل الداخلية لمحرك تعبئة الحمض النووي الفيروسي

نموذج ثلاثي الأبعاد للحمض النووي. الائتمان: مايكل ستروك / ويكيميديا ​​/ رخصة التوثيق الحرة GNU

اكتشفت مجموعة من الباحثين الإجراءات الداخلية التفصيلية للمحرك الجزيئي الذي يحزم المواد الجينية في فيروسات DNA مزدوجة الشريطة. يقدم هذا التقدم نظرة ثاقبة لخطوة حاسمة في دورة تكاثر الفيروسات مثل فيروسات الجدري والهربس والفيروسات الغدية. يمكن أن يكون مصدر إلهام للباحثين الذين يصنعون آلات مجهرية تعتمد على المحركات الحيوية التي تحدث بشكل طبيعي.

أجرى البحث علماء من جامعة ديوك وجامعة مينيسوتا وجامعة ماساتشوستس والفرع الطبي بجامعة تكساس (UTMB). تظهر النتائج على الإنترنت في ثلاثية من الأوراق المنشورة في تقدم العلم, وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم و بحوث الأحماض النووية.

قال غوراف أريا ، أستاذ الهندسة الميكانيكية وعلوم المواد والهندسة الطبية الحيوية ، "كان هناك العديد من المعلومات المفقودة التي حالت دون فهم كيفية عمل هذه الأنواع من محركات تغليف الحمض النووي ، والتي أعاقت قدرتنا على تصميم العلاجات أو تطوير تقنيات جديدة". والكيمياء في ديوك. "ولكن مع الرؤى والمحاكاة الجديدة ، تمكنا من تجميع نموذج لهذه الآلية الرائعة ، وهو الأكثر تفصيلاً الذي تم إنشاؤه على الإطلاق لهذا النوع من الأنظمة."

تأتي الفيروسات في العديد من الأصناف ، لكن تصنيفها يعتمد عمومًا على ما إذا كانت ترمز مخططاتها الجينية إلى الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أحادي أو مزدوج الشريطة. الاختلاف مهم من نواح كثيرة ويؤثر على كيفية تعبئة المادة الجينية في فيروسات جديدة. بينما تقوم بعض الفيروسات ببناء حاوية بروتين تسمى قفيصة حول الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي المنتج حديثًا ، يقوم البعض الآخر بإنشاء القفيصة أولاً ثم تملأها بالمواد الجينية.

كشفت ثلاث دراسات عن كيفية عمل محرك تعبئة الحمض النووي الفيروسي ، مما قد يوفر رؤى حول العلاجات الجديدة أو الآلات الجزيئية الاصطناعية. يتفكك كل بروتين من البروتينات الخمسة بدوره ، ويسحب الحمض النووي معها ، قبل أن يعود إلى نمطها الحلزوني الأصلي. الائتمان: جوشوا باجاك ، جامعة ديوك

تأخذ معظم فيروسات الحمض النووي مزدوجة الشريطة المسار الأخير ، والذي يمثل العديد من التحديات. الحمض النووي مشحون سالبًا ولا يريد أن يتكدس معًا في مساحة صغيرة. ويتم تعبئتها في هيكل كثيف للغاية ، شبه بلوري ، والذي يتطلب أيضًا الكثير من القوة.

قال جوشوا باجاك ، طالب دكتوراه يعمل في مختبر آريا: "الفائدة من ذلك أنه عندما يكون الفيروس جاهزًا لإصابة خلية جديدة ، فإن الضغط يساعد على حقن الحمض النووي في الخلية بمجرد ثقبها". "تشير التقديرات إلى أن الضغط يتجاوز 800 رطل لكل بوصة مربعة ، وهو ما يقرب من عشرة أضعاف الضغط في زجاجة شمبانيا مغطاة بالفلين."

يتطلب دفع الحمض النووي إلى قفيصة صغيرة عند هذا القدر من الضغط محركًا قويًا للغاية. حتى وقت قريب ، كان لدى الباحثين فقط إحساس غامض بكيفية عمل هذا المحرك بسبب صعوبة تخيله. يتجمع المحرك فقط على جسيم الفيروس ، وهو ضخم مقارنة بالمحرك.

وقال باجاك: "إن محاولة رؤية المحرك المرتبط بالفيروس يشبه محاولة رؤية التفاصيل في شعلة تمثال الحرية من خلال التقاط صورة للتمثال بأكمله".

ولكن في مؤتمر عقد مؤخرًا ، علم باجاك أن مارك مورايس ، أستاذ الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية في جامعة UTMB ، وبول جاردين ، أستاذ العلوم التشخيصية والبيولوجية في جامعة مينيسوتا ، كانا يعملان على هذا المحرك لسنوات ولديهما المعدات و المهارات اللازمة لمعرفة التفاصيل. يبدو أن بعض نتائجهم الأولية تتطابق مع النماذج التي كان باجاك يبنيها مع القليل من المعلومات المتوفرة بالفعل. ازداد حماس المجموعة لأن نتائجهم المنفصلة كانت تتقارب نحو آلية مشتركة وشرعوا بسرعة في حل لغز المحرك الفيروسي معًا.

في ورقة نشرت في تقدم العلمقام Morais وزملاؤه بحل تفاصيل المحرك بالكامل في أحد تكويناته. ووجدوا أن المحرك يتكون من خمسة بروتينات مرتبطة ببعضها البعض في شكل يشبه الحلقة. كل من هذه البروتينات يشبه كوبين ماصين مع زنبرك بينهما ، مما يسمح للجزء السفلي بالتحرك عموديًا في تشكيل حلزوني حتى يتمكن من الإمساك بالعمود الفقري الحلزوني للحمض النووي.

قال مورايس: "نظرًا لأنه كان بإمكانك وضع حوالي 100000 من هذه المحركات على رأس دبوس وكلها تهتز حولها ، فقد كان من الصعب إلقاء نظرة فاحصة عليها". "ولكن بعد أن ساعدنا زملائي في جامعة UTMB مايكل وودسون ومارك وايت في تصويرهم باستخدام مجهر إلكتروني بالتبريد ، تم وضع إطار عام للآلية في مكانه الصحيح."

في ورقة ثانية ، نشرت في بحوث الأحماض النووية، استولت مجموعة Morais على المحرك في تكوين ثان باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية. هذه المرة تم تجميع أكواب الشفط السفلية للمحرك معًا في حلقة مستوية ، مما دفع الباحثين إلى تخيل أن المحرك قد ينقل الحمض النووي إلى الفيروس عن طريق التصعيد بين التكوينين.

لاختبار هذه الفرضية ، أجرى باجاك وآريا عمليات محاكاة للخدمة الشاقة على Anton 2 ، أسرع كمبيوتر عملاق متاح حاليًا لتشغيل عمليات محاكاة الديناميكيات الجزيئية. لم تدعم نتائجهم الآلية المقترحة فحسب ، بل قدمت أيضًا معلومات حول كيفية الالتواء الدقيق لتروس المحرك بين التكوينين.

بينما تظل قمم البروتينات مرتبطة بشكل ثابت بجسيم الفيروس ، يتحرك نصفيها السفليين لأعلى ولأسفل في نمط دوري مدعوم بجزيء يحمل الطاقة يسمى ATP. بمجرد أن تتحرك جميع البروتينات للأعلى - تسحب الدنا معها - تطلق البروتينات المنتج الثانوي للتفاعل الكيميائي ATP. يؤدي هذا إلى إطلاق الحلقة السفلية للحمض النووي والعودة إلى حالتها الحلزونية الأصلية ، حيث تمسك مرة أخرى بالمزيد من ATP والحمض النووي لتكرار العملية.

قال آريا: "جمع جوشوا الكثير من القرائن والمعلومات لإنشاء هذا النموذج". "لكن النموذج يكون مفيدًا فقط إذا كان بإمكانه التنبؤ برؤى جديدة لم نكن نعرفها بالفعل."

النموذج في جوهره عبارة عن سلسلة من الإجراءات الميكانيكية التي يجب أن تتلاءم معًا وتحدث بترتيب تسلسلي حتى يعمل كل شيء بشكل صحيح. تنبأت محاكاة باجاك بسلسلة محددة من الإشارات الميكانيكية التي تخبر قيعان البروتينات ما إذا كان ينبغي لها أن تمسك بالحمض النووي أم لا. مثل سقوط خط من قطع الدومينو ، فإن إزالة أحد مسارات الإشارات من الوسط يجب أن يوقف التفاعل المتسلسل ويمنع الإشارة.

للتحقق من صحة هذا التوقع ، لجأ الباحثون إلى جاردين وزملائه شيلي غرايمز ودوايت أندرسون لمعرفة ما إذا كانت إزالة إحدى قطع الدومينو التي تشير بالفعل قد أوقفت المحرك عن تعبئة الحمض النووي. ورقة ثالثة ، نشرت في PNAS، يوضح أن التخريب نجح. بعد تحور قطعة الدومينو في مسار الإشارة بحيث تصبح غير قادرة على العمل ، لا يزال بإمكان المحرك ربط الوقود وحرقه تمامًا كما كان دائمًا ، لكنه كان أسوأ بكثير في تعبئة الحمض النووي.

قال جاردين: "الآلية الجديدة التي تنبأت بها الهياكل عالية الدقة والتنبؤات التفصيلية قدمت مستوى من التفاصيل أكبر مما كان لدينا من قبل". "سمح لنا هذا باختبار دور المكونات الحرجة للمحرك ، وبالتالي تقييم صلاحية هذه الآلية الجديدة كما نفهمها حاليًا."

والنتيجة هي إشارة قوية إلى أن النموذج قريب جدًا من وصف كيفية تصرف المحرك في الطبيعة. تخطط المجموعة لمواصلة نهجها الهيكلي والكيميائي الحيوي والمحاكاة المتكامل للغاية لمزيد من الاختبار والتنقيح للنموذج المقترح. إنهم يأملون في إمكانية استخدام هذا الفهم الأساسي في يوم من الأيام لمحاربة المرض أو إنشاء محرك جزيئي اصطناعي.

قال آريا: "كل التقنيات مستوحاة من الطبيعة بطريقة أو بأخرى". "الآن بعد أن عرفنا حقًا كيف يعمل هذا المحرك الجزيئي ، نأمل أن يلهم باحثين آخرين لابتكار اختراعات جديدة باستخدام هذه الآليات نفسها."


طريقة تطور المرض

انتقال الأنفلونزا وآليات المرض

تنتقل فيروسات الإنفلونزا عن طريق الرذاذ التنفسي الكبير عن طريق السعال أو العطس أو التحدث أو من خلال ملامسة الأسطح المصابة [54]. ترتبط فيروسات الإنفلونزا بشقوق السكر على سطح الخلايا الظهارية لمجرى الهواء حيث يحدث تكاثر الفيروس وانتشاره وتساقطه خلال فترة حضانة 1 & # x020132 & # x000a0 يومًا متوسطة [55 & # x0201357]. تحدث ذروة التكاثر الفيروسي عادةً في غضون 4 & # x000a0 يوم من ظهور الأعراض وتنتهي في غضون 7 & # x0201310 & # x000a0days ، وتستمر لفترة أطول في الأطفال والمضيفين الذين يعانون من نقص المناعة [58 & # x0201360]. في المتوسط ​​يصيب شخص واحد & # x02014 شخص إلى شخصين إضافيين ، ومع ذلك ، فإن هذا الرقم التناسلي (R.0) تختلف حسب السلالة الفيروسية والعوامل الاجتماعية والبيئية [61]. العدوى الفيروسية تضعف الحاجز المخاطي لمجرى الهواء وتعطل الغشاء الشعري السنخي مما يساهم في تسرب السوائل والخلايا الالتهابية إلى الفضاء السنخي مما يضعف تبادل الغازات مما يؤدي إلى نقص الأكسجة في الدم [62 ، 63]. غالبًا ما تعقد العدوى البكتيرية المصاحبة الحالات الشديدة التي تساهم في فشل الجهاز التنفسي والوفاة ، مع المكورات العنقودية الذهبية و أنواع العقدية كالمسببات المرضية السائدة [64]. تقتصر عدوى فيروس الأنفلونزا الموسمية إلى حد كبير على الجهاز التنفسي ، ومع ذلك ، فإن فيروسات H5 و H7 HPAI لها موقع انقسام متعدد القاعدة داخل هيماجلوتينين مما يسمح بالتكاثر خارج الجهاز التنفسي [65 ، 66]. العدوى بسلالة واحدة من الأنفلونزا لا تمنح مناعة كاملة لسلالات أو أنواع فرعية أخرى [67].

انتقال الحصبة وآليات المرض

تعد الحصبة من أكثر التهابات الجهاز التنفسي انتشارًا ، وتنتشر عن طريق التعرض لقطرات كبيرة من الجهاز التنفسي من خلال السعال أو العطس أو التحدث عن طريق الاتصال غير المباشر مع الأسطح المصابة أو عن طريق قطرات معدية صغيرة يمكن أن تظل معلقة في الهواء لمدة تصل إلى 2 و # x000a0 ساعة [10 ، 68 ]. تعد الخلايا المتغصنة في الجهاز التنفسي ، والخلايا الليمفاوية ، والضامة السنخية أهدافًا مبكرة للعدوى ، حيث تتكاثر الحصبة خلال فترة حضانة تتراوح من 8 إلى 12 يومًا في المتوسط ​​وتنتشر في الخلايا الليمفاوية المحلية وظهارة الجهاز التنفسي ثم تنتشر في الدم عبر الخلايا الليمفاوية المصابة إلى الخلايا الظهارية والبطانية في معظم الأعضاء [69 & # x0201371]. تبدأ فترة العدوى بظهور الحمى وتمتد لعدة أيام بعد ظهور الطفح الجلدي [72]. المقدرة R0 معدل الحصبة هو 9 & # x0201318 يعتمد على حساسية المضيف والعوامل الاجتماعية والبيئية [73]. تصيب الحصبة وتعطل الأنسجة في جميع أنحاء الجسم ، ومع ذلك ، فإن المرض الشديد يرجع في المقام الأول إلى الجهاز التنفسي السفلي والمضاعفات العصبية [72]. تمنح عدوى الحصبة الطبيعية مناعة مدى الحياة ، كما أن النقل السلبي للأجسام المضادة للأم يحمي الأطفال حديثي الولادة خلال فترة ما بعد الولادة المبكرة [74]. الأفراد الذين يتعافون من عدوى الحصبة معرضون لخطر الإصابة بعدوى ثانوية [75 ، 76].

انتقال السارس وفيروس كورونا وآليات المرض

ينتقل فيروس SARS-CoV عن طريق قطرات تنفسية كبيرة وعن طريق ملامسة الأسطح المصابة. تدعم البيانات الوبائية أيضًا انتقال فيروس السارس عبر القطيرات الصغيرة المحمولة جواً على الرغم من تقدير R0 من 0.86 & # x020131.83 يجادل ضد كون هذا المسار السائد للانتشار [77 ، 78]. يرتبط SARS-CoV بمستقبلات الإنزيم المحول للأنجيوتنسين (ACE) -2 على الخلايا الظهارية التنفسية والخلايا الرئوية والضامة السنخية مما يؤدي إلى تلف السنخ المنتشر وفشل الجهاز التنفسي [79 ، 80]. السارس هو عدوى جهازية مع فيروسية يتم اكتشافها في معظم الحالات وتؤثر على أنواع وأعضاء متعددة من الخلايا [81 ، 82]. تعد إصابة الكلى الحادة متعددة العوامل مع وجود دليل على نخر النبيبات الحاد والتهاب الأوعية والتليف الكبيبي ، وتعزى مظاهر الجهاز العصبي المركزي جزئيًا على الأقل إلى العدوى المباشرة للخلايا العصبية التي تؤدي إلى الوذمة والتنكس [83].

ينتقل فيروس MERS-CoV عن طريق قطرات تنفسية كبيرة وعن طريق ملامسة الأسطح المصابة بمعدل R0 من & # x0003c1 إلى & # x0003e1 خارج مقابل داخل إعدادات الرعاية الصحية ، على التوالي [84]. يربط MERS-CoV ثنائي ببتيدل ببتيداز 4 (DPP4) على الخلايا الظهارية التنفسية والخلايا الرئوية حيث يخضع لتكرار مثمر خلال فترة حضانة 2 & # x0201314 & # x000a0 يوم [16]. قد يستمر خروج الفيروسات من الجهاز التنفسي السفلي لأسابيع [85 ، 86]. على الرغم من عدم توثيق الفيروسات في جميع الحالات ، إلا أنها مرتبطة بمرض شديد وعدوى منتجة للـ DCs ، ويعتقد أن الضامة تسهل خلل التنظيم المناعي [87 ، 88]. يتم التعبير عن DPP4 على نطاق واسع على الخلايا خارج الرئة ، ومع ذلك ، يتوفر عدد قليل من بيانات التشريح لتحديد التوزيع الفيروسي [16 ، 89].

انتقال فيروس الجدري وآليات المرض

ينتقل فيروس VARV في المقام الأول عن طريق قطرات تنفسية كبيرة وبدرجة أقل من خلال ملامسة الأشياء الملوثة مثل القشور أو الفراش أو الملابس أو عن طريق قطرات تنفسية صغيرة محمولة جواً [90 ، 91]. يُعتقد أن VARV يتكاثر في ظهارة مجرى الهواء وينتشر إلى الغدد الليمفاوية الإقليمية [92 ، 93]. يتكاثر VARV داخل الغدد الليمفاوية وينتشر عبر مجرى الدم بذر المشاهد البعيدة بما في ذلك الجلد والطحال ونخاع العظام والكبد والكلى والأعضاء الأخرى [94]. تظهر الحمى بعد فترة حضانة تبلغ 12 & # x000a0 يومًا في المتوسط ​​، ويتبع الطفح الجلدي الحمى بمقدار 3 & # x020134 & # x000a0days ، بالتزامن مع تساقط فيروسي عالي المستوى من إفرازات بلعومية [95 ، 96]. المقدرة R0 من الجدري بين 3.5 و 6 [97]. يتم اكتشاف فيروسات الدم عالية المستوى في كثير من الأحيان مع النزفية مقارنة بالجدري النوع العادي ، على الرغم من أن الآليات الدقيقة لفشل الأعضاء التي لوحظت في الحالة المميتة لم يتم تحديدها بشكل جيد [98 & # x02013101].


كشف الباحثون عن الإجراءات الداخلية لمحرك تعبئة الحمض النووي الفيروسي

اكتشفت مجموعة من الباحثين الإجراءات الداخلية التفصيلية للمحرك الجزيئي الذي يحزم المواد الجينية في فيروسات DNA مزدوجة الشريطة. يقدم هذا التقدم نظرة ثاقبة لخطوة حاسمة في دورة تكاثر الفيروسات مثل الجدري والهربس والفيروسات الغدية. يمكن أن يكون مصدر إلهام للباحثين الذين يصنعون آلات مجهرية تعتمد على المحركات الحيوية التي تحدث بشكل طبيعي.

أجرى البحث علماء من جامعة ديوك وجامعة مينيسوتا وجامعة ماساتشوستس والفرع الطبي بجامعة تكساس (UTMB). تظهر النتائج على الإنترنت في ثلاثية من الأوراق المنشورة في Science Advances و Proceedings of the National Academy of Sciences and Nucleic Acids Research.

قال غوراف آريا ، أستاذ الهندسة الميكانيكية وعلوم المواد والهندسة الطبية الحيوية: "كان هناك العديد من المعلومات المفقودة التي حالت دون فهمنا لكيفية عمل هذه الأنواع من محركات تغليف الحمض النووي ، والتي أعاقت قدرتنا على تصميم العلاجات أو تطوير تقنيات جديدة". والكيمياء في ديوك. "ولكن مع الرؤى والمحاكاة الجديدة ، تمكنا من تجميع نموذج لهذه الآلية الرائعة ، وهو الأكثر تفصيلاً الذي تم إنشاؤه على الإطلاق لهذا النوع من الأنظمة."

تأتي الفيروسات في العديد من الأصناف ، لكن تصنيفها يعتمد عمومًا على ما إذا كانت ترمز مخططاتها الجينية إلى الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أحادي أو مزدوج الشريطة. الاختلاف مهم من نواح كثيرة ويؤثر على كيفية تعبئة المادة الجينية في فيروسات جديدة. بينما تقوم بعض الفيروسات ببناء حاوية بروتين تسمى قفيصة حول الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي المنتج حديثًا ، يقوم البعض الآخر بإنشاء القفيصة أولاً ثم تملأها بالمواد الجينية.

"محاولة رؤية المحرك المرتبط بالفيروس يشبه محاولة رؤية التفاصيل في شعلة تمثال الحرية من خلال التقاط صورة للتمثال بأكمله."

جوشوا باجاك.

تأخذ معظم فيروسات الحمض النووي مزدوجة الشريطة المسار الأخير ، والذي يمثل العديد من التحديات. الحمض النووي مشحون سالبًا ولا يريد أن يتكدس معًا في مساحة صغيرة. ويتم تعبئتها في هيكل كثيف للغاية ، شبه بلوري ، والذي يتطلب أيضًا الكثير من القوة.

قال جوشوا باجاك ، طالب دكتوراه يعمل في مختبر آريا: "الفائدة من ذلك أنه عندما يكون الفيروس جاهزًا لإصابة خلية جديدة ، فإن الضغط يساعد على حقن الحمض النووي في الخلية بمجرد ثقبها". "تشير التقديرات إلى أن الضغط يتجاوز 800 رطل لكل بوصة مربعة ، وهو ما يقرب من عشرة أضعاف الضغط في زجاجة شمبانيا مغطاة بالفلين".

يتطلب دفع الحمض النووي إلى قفيصة صغيرة عند هذا القدر من الضغط محركًا قويًا للغاية. حتى وقت قريب ، كان لدى الباحثين فقط إحساس غامض بكيفية عمل هذا المحرك بسبب صعوبة تخيله. يتجمع المحرك فقط على جسيم الفيروس ، وهو ضخم مقارنة بالمحرك.

قال باجاك: "إن محاولة رؤية المحرك مرتبطًا بالفيروس يشبه محاولة رؤية التفاصيل في شعلة تمثال الحرية من خلال التقاط صورة للتمثال بأكمله".

ولكن في مؤتمر عقد مؤخرًا ، علم باجاك أن مارك مورايس ، أستاذ الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية في جامعة UTMB ، وبول جاردين ، أستاذ العلوم التشخيصية والبيولوجية في جامعة مينيسوتا ، كانا يعملان على هذا المحرك لسنوات ولديهما المعدات و المهارات اللازمة لمعرفة التفاصيل. يبدو أن بعض نتائجهم الأولية تتطابق مع النماذج التي كان باجاك يبنيها مع القليل من المعلومات المتوفرة بالفعل. ازداد حماس المجموعة لأن نتائجهم المنفصلة كانت تتقارب نحو آلية مشتركة وشرعوا بسرعة في حل لغز المحرك الفيروسي معًا.

في ورقة بحثية نُشرت في Science Advances ، حل مورايس وزملاؤه تفاصيل المحرك بأكمله في أحد تكويناته. ووجدوا أن المحرك يتكون من خمسة بروتينات مرتبطة ببعضها البعض في شكل يشبه الحلقة. كل من هذه البروتينات يشبه كوبين ماصين مع زنبرك بينهما ، مما يسمح للجزء السفلي بالتحرك عموديًا في تشكيل حلزوني حتى يتمكن من الإمساك بالعمود الفقري الحلزوني للحمض النووي.

قال مورايس: "نظرًا لأنه كان بإمكانك وضع حوالي 100000 من هذه المحركات على رأس دبوس وكلها تتحرك في الأرجاء ، فقد كان من الصعب إلقاء نظرة فاحصة عليها"."ولكن بعد أن ساعدنا زملائي في جامعة UTMB مايكل وودسون ومارك وايت في تصويرهم باستخدام مجهر إلكتروني بالتبريد ، تم وضع إطار عام للآلية في مكانه الصحيح."

في ورقة ثانية ، نُشرت في Nucleic Acids Research ، التقطت مجموعة Morais المحرك في تكوين ثان باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية. هذه المرة تم تجميع أكواب الشفط السفلية للمحرك معًا في حلقة مستوية ، مما دفع الباحثين إلى تخيل أن المحرك قد ينقل الحمض النووي إلى الفيروس عن طريق التصعيد بين التكوينين.

"جمع جوشوا الكثير من القرائن والمعلومات لإنشاء هذا النموذج. لكن النموذج يكون مفيدًا فقط إذا كان بإمكانه توقع رؤى جديدة لم نكن نعرفها بالفعل ".

غوراف آريا

لاختبار هذه الفرضية ، أجرى باجاك وآريا عمليات محاكاة للخدمة الشاقة على Anton 2 ، أسرع كمبيوتر عملاق متاح حاليًا لتشغيل عمليات محاكاة الديناميكيات الجزيئية. لم تدعم نتائجهم الآلية المقترحة فحسب ، بل قدمت أيضًا معلومات حول كيفية الالتواء الدقيق لتروس المحرك بين التكوينين.

بينما تظل قمم البروتينات مرتبطة بشكل ثابت بجسيم الفيروس ، يتحرك نصفيها السفليين لأعلى ولأسفل في نمط دوري مدعوم بجزيء يحمل الطاقة يسمى ATP. بمجرد أن تتحرك جميع البروتينات للأعلى - تسحب الدنا معها - تطلق البروتينات المنتج الثانوي للتفاعل الكيميائي ATP. يؤدي هذا إلى إطلاق الحلقة السفلية للحمض النووي والعودة إلى حالتها الحلزونية الأصلية ، حيث تمسك مرة أخرى بالمزيد من ATP والحمض النووي لتكرار العملية.

قال آريا: "جمع جوشوا الكثير من القرائن والمعلومات لإنشاء هذا النموذج". "لكن النموذج يكون مفيدًا فقط إذا كان بإمكانه توقع رؤى جديدة لم نكن نعرفها بالفعل."

النموذج في جوهره عبارة عن سلسلة من الإجراءات الميكانيكية التي يجب أن تتلاءم معًا وتحدث بترتيب تسلسلي حتى يعمل كل شيء بشكل صحيح. تنبأت محاكاة باجاك بسلسلة محددة من الإشارات الميكانيكية التي تخبر قيعان البروتينات ما إذا كان ينبغي لها أن تمسك بالحمض النووي أم لا. مثل سقوط خط من قطع الدومينو ، فإن إزالة أحد مسارات الإشارات من الوسط يجب أن يوقف التفاعل المتسلسل ويمنع الإشارة.

"جميع التقنيات مستوحاة من الطبيعة بطريقة أو بأخرى. والآن بعد أن عرفنا حقًا كيف يعمل هذا المحرك الجزيئي ، نأمل أن يلهم باحثين آخرين لابتكار اختراعات جديدة باستخدام هذه الآليات نفسها."

غوراف آريا

للتحقق من صحة هذا التوقع ، لجأ الباحثون إلى جاردين وزملائه شيلي غرايمز ودوايت أندرسون لمعرفة ما إذا كانت إزالة إحدى قطع الدومينو التي تشير بالفعل قد أوقفت المحرك عن تعبئة الحمض النووي. تظهر ورقة ثالثة ، نُشرت في PNAS ، أن التخريب نجح. بعد تحور قطعة الدومينو في مسار الإشارة بحيث تصبح غير قادرة على العمل ، لا يزال بإمكان المحرك ربط الوقود وحرقه تمامًا كما كان دائمًا ، لكنه كان أسوأ بكثير في تعبئة الحمض النووي.

قال جاردين: "الآلية الجديدة التي تنبأت بها الهياكل عالية الدقة والتنبؤات التفصيلية قدمت مستوى من التفاصيل أكبر مما كان لدينا من قبل". "سمح لنا هذا باختبار دور المكونات الحرجة للمحرك ، وبالتالي تقييم صحة هذه الآلية الجديدة كما نفهمها حاليًا."

والنتيجة هي إشارة قوية إلى أن النموذج قريب جدًا من وصف كيفية تصرف المحرك في الطبيعة. تخطط المجموعة لمواصلة نهجها الهيكلي والكيميائي الحيوي والمحاكاة المتكامل للغاية لمزيد من الاختبار والتنقيح للنموذج المقترح. إنهم يأملون في إمكانية استخدام هذا الفهم الأساسي في يوم من الأيام لمحاربة المرض أو إنشاء محرك جزيئي اصطناعي.

قال آريا: "كل التقنيات مستوحاة من الطبيعة بطريقة أو بأخرى". "الآن بعد أن عرفنا حقًا كيف يعمل هذا المحرك الجزيئي ، نأمل أن يلهم باحثين آخرين لإنشاء اختراعات جديدة باستخدام هذه الآليات نفسها."

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (GM118817 ، GM122979 ، GM127365) والمؤسسة الوطنية للعلوم (MCB1817338). تم أيضًا جمع بيانات Cryo-EM في مرافق التصوير بالتبريد الإقليمية المدعومة من NIH (1U24 GM116787-01 ، 1U24 GM116792-01). تم إجراء عمليات المحاكاة على الكمبيوتر العملاق Anton 2 الذي أتاحه D.E. شو للأبحاث واستضافتها في مركز بيتسبرغ للحوسبة الفائقة عبر المعاهد الوطنية للصحة (R01GM116961) والكمبيوتر العملاق المذنب المستضاف في مركز سان دييغو للكمبيوتر العملاق عبر NSF (ACI-1053575).

"التغليف الفيروسي ATPases تستخدم تبديل الغلوتامات إلى نشاط ثنائي ATPase ونقل الحمض النووي." جوشوا باجاك وروكني آتز وبريندان جيه هيلبرت ومارك سي مورايس وبريان إيه كيلش وبول جاردين وجوراف آريا. PNAS ، 27 أبريل 2021118 (17) e2024928118. DOI: 10.1073 / pnas.2024928118


العروض الجارية!

صفقة اشتراك لمدة عامين اشتراك لمدة عام
جميع ملاحظات PMF IAS وفر 30٪ وفر 10٪
الجغرافيا + البيئة وفر 30٪ وفر 10٪

4.11.7: فيروسات الحمض النووي المزدوجة - فيروسات الجدري - علم الأحياء

مرحبًا بك في صفحة Pox Virus الخاصة بي! تم إنشاء هذا الموقع لفصل في جامعة ستانفورد يسمى Human Biology 115: Humans and Viruses ، قام بتدريسه الدكتور روبرت سيجل. انقر هنا للحصول على ارتباطات لمواقع الويب حول عائلات الفيروسات البشرية الأخرى.

تركز هذه الصفحة على الجدري الذي تسبب منذ بداية التاريخ في أوبئة مدمرة في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك ، في أكتوبر 1977 ، وبعد جهود حثيثة من قبل منظمة الصحة العالمية ، أصبح هذا المرض أول مرض يتم القضاء عليه تمامًا.

| مقدمة | الجدري الصغير | التصنيف والتصنيف | فيروسات وأمراض بشرية أخرى | ناقل الحركة | | الاستجابة المناعية والدفاعات المضيفة | التطعيم | استئصال الجدري والأمراض الفيروسية الأخرى | روابط ويب مفيدة | المراجع |

فيروسات الجدري هي الأكبر والأكثر تعقيدًا بين جميع الفيروسات. في الواقع ، هي كبيرة بما يكفي ، بحجم فيريون 220-350 × 115-260 نانومتر ، يمكن رؤيتها تحت المجهر الضوئي. تصيب مجموعة واسعة من العوائل وتنقسم إلى فئتين فرعيتين: Chordopoxvirinae و Entomopoxviridae. تنتمي جميع فيروسات الجدري البشرية إلى فصيلة Chordopoxovirinae الفرعية ، ومعظمها ينتمي إما إلى فيروس Orthopox (variola ، واللقاح ، وجدري البقر) أو جنس Parapoxvirus (Orf virus). فيروس جدري الماء لا ينتمي لهذه العائلة! - إنه فيروس الهربس.

  • الجينوم: DNA مزدوج الشريطة ، أحادي الجزء ، خطي ، غير معدي يشفر أكثر من 100 جين ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي transcripase المعتمد على الحمض النووي
  • علم التشكل المورفولوجياnucleocapsid "معقد" ، بيضاوي الشكل أو لبنة الشكل
  • مغلف: orthopox مغلف ، parapox ليست كذلك
  • تكرار: يحدث في السيتوبلازم
  • مجموعة المضيف: يختلف نطاق العائل باختلاف الفيروسات حيوانية المصدر أمر شائع ، لكن الجدري الصغير يصيب البشر فقط
  • الأورام: قد تسبب أورام حميدة
| مقدمة | الجدري الصغير | التصنيف والتصنيف | فيروسات وأمراض بشرية أخرى | ناقل الحركة | | الاستجابة المناعية والدفاعات المضيفة | التطعيم | استئصال الجدري والأمراض الفيروسية الأخرى | روابط ويب مفيدة | المراجع |

تنتشر فيروسات الجدري بشكل شائع عن طريق الاتصال المباشر. في حالة الجدري ، يوجد الفيروس في الآفات في الجهاز التنفسي العلوي ، والتي يمكن أن تنتقل للآخرين في إفرازات القطيرات ، وفي الآفات الجلدية. على الرغم من أن الفيروس شديد العدوى ، إلا أن طريقة الانتقال هذه تجعل انتشاره بطيئًا نسبيًا.

| مقدمة | الجدري الصغير | التصنيف والتصنيف | فيروسات وأمراض بشرية أخرى | ناقل الحركة | | الاستجابة المناعية والدفاعات المضيفة | التطعيم | استئصال الجدري والأمراض الفيروسية الأخرى | روابط ويب مفيدة | المراجع |

ينتج عن الإصابة بفيروس الجدري مناعة خلوية. عادة ما يكون الأشخاص المصابون بالجدري محصنين ضد المرض لبقية حياتهم.

| مقدمة | الجدري الصغير | التصنيف والتصنيف | فيروسات وأمراض بشرية أخرى | ناقل الحركة | | الاستجابة المناعية والدفاعات المضيفة | التطعيم | استئصال الجدري والأمراض الفيروسية الأخرى | روابط ويب مفيدة | المراجع |

  • فيروسات الجدري ، مع مخططات مبهرة للجينوم وعملية النسخ المتماثل.
  • فيروسات POX البشرية ، مع صور عن قرب للجدري الصغير.
  • الفصيلة: الجدري
  • فيروسات POX
  • إدوارد جينر (1749-1823)
  • البوكيز

| مقدمة | الجدري الصغير | التصنيف والتصنيف | فيروسات وأمراض بشرية أخرى | ناقل الحركة | | الاستجابة المناعية والدفاعات المضيفة | التطعيم | استئصال الجدري والأمراض الفيروسية الأخرى | روابط ويب مفيدة | المراجع |
  • Dulbecco R و Ginsberg HS. علم الفيروسات (الطبعة الثانية) ، فيلادلفيا: شركة جي بي ليبينكوت ، 1988 ، ص 179-191.
  • ليلاند د. علم الفيروسات السريرية، فيلادلفيا: W.B. شركة سوندرز ، 1996 ، ص. 152-3.
  • Metselaar D و Simpson DIH. علم الفيروسات العملي لطلاب الطب والممارسين في البلدان الاستوائيةأكسفورد: مطبعة جامعة أكسفورد ، 1982 ، ص 37 ، 173-83.
  • سيجل آر ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه.
  • الأبيض DO و Fenner FJ. علم الفيروسات الطبية (الطبعة الثالثة) ، أورلاندو: المطبعة الأكاديمية ، 1986 ، الصفحات 278-280 ، 433-443.

تم إنشاؤها بواسطة جينيفر يوان ، علم الأحياء البشري ، دفعة 1998
جامعة ستانفورد ، ستانفورد ، كاليفورنيا
تاريخ آخر تعديل: 17 فبراير 1999


التعرف على الأجسام المضادة لبروتينات غلاف فيروس اللقاح المناعي

فيروس Vaccinia (VACV) هو فيروس DNA مزدوج الشريطة مغلف والمكون النشط للقاح الجدري. أدى الاستخدام المنتظم لهذا اللقاح إلى القضاء على الجدري المنتشر (فيروس الجدري ، VARV) من البشر. تكريما لنجاحه ، تم إنهاء التحصين العالمي في أواخر السبعينيات. تُعزى فعالية اللقاح إلى الإنتاج القوي للأجسام المضادة الواقية ضد العديد من بروتينات الغلاف من VACV ، والتي تحمي ضد العدوى بفيروس VARV الممرض. منذ انتهاء التطعيم العالمي ، لا يمتلك معظم الأطفال والشباب مناعة ضد الجدري. هذا مصدر قلق ، لأن الجدري يعتبر سلاحًا بيولوجيًا محتملاً. على الرغم من أن لقاح الجدري يعتبر المعيار الذهبي لجميع اللقاحات وقد تمت دراسة المستضدات المستهدفة على نطاق واسع ، إلا أن الحواتم التي تستهدفها الأجسام المضادة الواقية وآلية الارتباط بها كانت ، حتى وقت قريب ، سيئة الوصف. إن فهم التفاعل الدقيق بين الأجسام المضادة وحلقاتها سيكون مفيدًا في تصميم لقاحات أفضل ضد الأمراض الأخرى. سنناقش في هذه المراجعة الأساس الهيكلي للتعرف على مستضدات VACV المناعية A27 و A33 و D8 و L1 بواسطة الأجسام المضادة الواقية ومناقشة الآثار المحتملة فيما يتعلق بقدرتها الوقائية.

الكلمات الدالة: الأجسام المضادة معقدات الأجسام المضادة - مستضد التلقيح تصوير البلورات بالأشعة السينية لفيروس اللقاح.


النتائج

المؤتلف Variola K7L هو بروتياز خافت

تم التعبير عن K7L الموسومة بعلامة GST بتنسيق بكتريا قولونية كبروتين قابل للذوبان (1 مجم / لتر مزرعة بكتيرية) ، منقى ومشقوق بالثرومبين كما هو موضح في & # x0201c الإجراءات التجريبية & # x0201d (انظر الشكل 1). تم ترحيل K7L على SDS-PAGE بالحجم المتوقع 45 كيلو دالتون (الشكل 1 ب). اقترح كروماتوغرافيا استبعاد الحجم كتلة جزيئية تبلغ 75 & # x0201380 كيلو دالتون ، أكثر اتساقًا مع التجانس في المحلول (الشكل 1). ج). تم تأكيد ذلك من خلال تجارب الارتباط المتبادل ، والتي أظهرت ثنائيات ولكن لا توجد بوليمرات عالية المستوى (الشكل 1). ب). أكد التنبيذ التحليلي الفائق (الذي لا يتأثر بالشكل الجزيئي) أن K7L موجود كثنائي قوي إلى حد ما إما في غياب أو وجود 25 ٪ من الجلسرين (الشكل التكميلي 2) ، مع كد قيم 0.4 & # x000b1 0.2 & # x003bc م (بدون جلسرين) و 0.2 & # x000b1 0.1 & # x003bc م (25٪ جلسرين). في التركيزات المستخدمة في فحوصات نشاطنا ، من المتوقع أن يكون K7L قاتمة بشكل أساسي. يمكن تخزين K7L لعدة أشهر في 50٪ جلسرين عند & # x0221220 & # x000b0C أو & # x0221280 & # x000b0C دون فقدان نشاط التحلل. ومع ذلك ، فقد الإنزيم نشاطه في درجات حرارة أعلى ، مع نصف عمر & # x0223c5 h عند 23 & # x000b0C و & # x0223c30 دقيقة عند 37 & # x000b0C. لذلك ، تم إجراء قياسات النشاط في 20 & # x0201325 & # x000b0C.

الأهداف المبلغ عنها من K7L هي P25K و P4a و P4b. لتحديد نشاط المؤتلف K7L ، قمنا باحتضانه مع في المختبر تمت ترجمة بروتينات P25K و P4a و P4b المعبر عنها من التركيبات التي تشفر بروتينات اللقاح المتشابهة للغاية (لأن DNA variola لم يكن متاحًا). يختلف Variola و Vaccinia P25K و P4a و P4b بنسبة تتراوح بين 1 & # x020133 ٪ ، وجميع الاختلافات في التسلسل بعيدة عن مواقع الانقسام انظر المحاذاة التكميلية. نظرًا لأن التسلسلات تعرض درجة عالية من الهوية ، فمن المحتمل جدًا أن يكون نشاط variola K7L تجاه بروتينات اللقاح مطابقًا بشكل أساسي لانقسام بروتينات variola المقابلة. تم إجراء فحوصات النشاط في وجود 40٪ من الجلسرين (الشكل 2). يوجد موقع انشقاق مفترض واحد في P4b (Gly 60 & # x02193Ser 61) واثنان في P25K (Gly 18 & # x02193Ser 19 و Gly 32 & # x02193Ala 33). وفقًا للاتفاق ، لاحظنا منتجي انقسام للكتلة الجزيئية المتوقعة لـ P25K (32 و 30 كيلو دالتون الشكل 2). ج) وواحد لـ P4b (64 كيلو دالتون الشكل 2 د). كان انقسام أحد مواقع P25K سريعًا بشكل خاص ، ولاحظنا انقسامًا أبطأ للموقع الآخر و P4b بواسطة K7L. على النقيض من ذلك ، لم يتم شق P4a بواسطة K7L في ظل ظروفنا التجريبية (الشكل 2 ه).

الأهداف الفيروسية المفترضة لـ K7L و في المختبر أنماط الانقسام. أو P4a و P4b و P25K و P17K هي بروتينات أساسية فيروسية ، في حين أن P21K هو بروتين غشاء الغلاف. الأسماء البديلة المستندة إلى الجينات (بتنسيق أقواس) بالإضافة إلى مواقع الانقسام المفترضة وأرقام بقاياها. بيتم عرض محاذاة مواقع الانقسام. توجد المخلفات الحمضية التي تعزز الانقسام بالخط العريض. ج, د، و ه، تم نسخ وترجمة البلازميدات التي تشفر البروتينات المشار إليها في المختبر. تمت إضافة المؤتلف GST-K7L للأوقات المحددة ، وتم إنهاء التفاعل بالغليان في المخزن المؤقت لعينة SDS. تم تطوير المواد الهلامية SDS-PAGE باستخدام الستربتافيدين- HRP للكشف عن بروتينات الركيزة المعالجة وغير المعالجة. العصابات المشتركة في كل من المواد الهلامية P4b و P4a تنتمي إلى بروتينات غير ملطخة على وجه التحديد. استخدمت تفاعلات الانقسام 0.3 & # x003bc m GST-K7L عند 25 & # x000b0C في 50 م م كلوريد الصوديوم ، 2 م م DTT ، 30 م م تريس ، درجة الحموضة 8.0 ، عازلة تحتوي على 40٪ جلسرين و 12٪ حجم / حجم من منتج الترجمة.

الجلسرين يعزز نشاط K7L

لتقييم نشاط عينات K7L ، قمنا بتجميع العديد من ركائز الببتيدل المقابلة لمواقع الانقسام المفترضة P25K و P4a و P4b (الجدول 1). كانت الببتيدات مؤلفة من N- نهائية وتحتوي على ACC مثل الفلوروفور. تم قياس النشاط عن طريق إطلاق الفلوروفور الحر باستخدام مقياس التألق الذي يعمل في الوضع الحركي. يُظهر K7L نشاطًا منخفضًا ضد Ac-ISAG-ACC ، ولكن تم تحسين نشاطه بشكل كبير في وجود 45 ٪ من الجلسرين (الشكل 3). أ). على غرار الجلسرين ، زادت الأسمولية الأخرى مثل البيتين والسكروز أيضًا من النشاط ضد Ac-ISAG-ACC (الشكل 3). ب). نتيجة لذلك ، تم إجراء قياسات النشاط الروتينية في وجود 40 & # x0201345 ٪ من الجلسرين عند درجة حموضة مثالية قدرها 8.0 (الشكل 3). ج) ما لم يذكر خلاف ذلك. زاد الجلسرين من نشاط K7L ضد الببتيدات الفلورية الأخرى المتميزة عن ركائز البروتين كامل الطول Ac-ISAG-ACC (البيانات غير معروضة) ، وبالتالي نستنتج أن تأثير الأسمولية يكون على الإنزيم ، وليس الركيزة.

الجدول 1

التحلل البروتيني K7L للببتيدات الفلورية

تم تقييم المعلمات الحركية في محلول Tris-HCl 30 م م ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 100 نانومتر كلوريد الصوديوم ، و 2 م م DTT ، و 45٪ جلسرين مع مجموعة من تركيزات الببتيد و K7L من 0.2 إلى 1.0 & # x003bc م. NM ، غير مُقاس. تشير الأخطاء إلى الانحراف المعياري المرصود لثلاثة قياسات.

مصدر التسلسلتسلسل الببتيدكقط/كمكم
م & # x022121 س & # x022121& # x003bc م
P25K ، Gly 18 & # x02193Ser 19 AC-FFAG-ACC300 & # x000b1 5100 & # x000b1 15
P25K، Gly 32 & # x02193Ala 33 AC-VIAG-ACC120 & # x000b130NM
P4b، Gly 60 & # x02193Ser 61 AC-ISAG-ACC80 & # x000b130830 & # x000b1110
P4a، Gly 614 & # x02193Ser 615 AC-FYAG-ACC560 & # x000b1 90NM
P4a، Gly 697 & # x02193Thr 698 AC-TNAG-ACCلا انقساملا انقسام
P25K ، Gly 18 & # x02193Ser 19 AC-TIFFAG-ACC570 & # x000b1307.5 & # x000b1 3
P25K ، Gly 18 & # x02193Ser 19 AC-EDTIFFAG-ACC14400 & # x000b130026 & # x000b1 7
P4a، Gly 614 & # x02193Ser 615 AC-RYFYAG-ACC880 & # x000b1140NM
P4a، Gly 614 & # x02193Ser 615 AC-CPRYFYAG-ACC1010 & # x000b120150 & # x000b130

تأثيرات التثبيت للأسمولات والملح ودرجة الحموضة وتركيز الإنزيم على نشاط K7L. أ، الموضح هو النشاط (السرعة كدالة لتركيز Ac-ISAG-ACC) في وجود 10 و 45 ٪ من الجلسرين. ب، الموضح هو مقارنة لتنشيط K7L بواسطة البيتين والجلسرين والسكروز (السرعة كدالة لتركيز الأسمولية) في 35 & # x003bc m Ac-ISAG-ACC. ج، الموضح هو تأثير تركيز كلوريد الصوديوم على نشاط K7L في 35 & # x003bc m Ac-ISAG-ACC. تم قياس السرعات الأولية عند 25 & # x000b0C في 30 م تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 2 م م DTT مع إضافة المكونات المختلفة. ج، الموضح هو تأثير الأس الهيدروجيني على نشاط K7L في وجود 45 ٪ من الجلسرين. د، الموضح هو تأثير تركيز K7L على النشاط المحدد لـ K7L تجاه 30 & # x003bc m Ac-EDTIFFAG-ACC في وجود 10٪ جلسرين.

Dimerization يعزز نشاط K7L

قمنا بتحليل تأثير dimerization K7L على نشاط معين من خلال ملاحظة اعتماد التركيز على انقسام ركيزة الببتيد المسمى ACC (الشكل 3). د). كان للاعتماد شكل سيني مع التيار المتردد50 = 0.2 & # x000b1 0.1 & # x003bc m ، والذي يتوافق مع كد يتم تحديد القيمة بواسطة تنبيذ تحليلي فائق (انظر أعلاه). تربط هذه النتيجة بوضوح نشاط K7L مع dimerization.

أخيرًا ، قمنا بمقارنة أنشطة المؤتلف K7L المنتج في E. coli مقابل خلايا الثدييات المصابة بفيروس اللقاح (الشكل التكميلي 3). لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية ، مما يشير إلى أن K7L لا يتم تنشيطه تفاضليًا في خلايا الثدييات (على سبيل المثال عن طريق التعديل اللاحق للترجمة).

سبر خصوصية الركيزة

تم تحديد خصوصية الركيزة لقاح I7L مسبقًا بواسطة في الجسم الحي مقايسات الانقسام من P25K متحولة (5 ، 42 ، 43). ومع ذلك ، نظرًا لأن البيانات المنشورة لم تقدم مقارنات كمية لكفاءات الانقسام ، فقد أجرينا تحليلًا متعمقًا لـ K7L. موقع P1 لجميع ركائز K7L الطبيعية المفترضة هو بقايا Gly.لاختبار تحمل K7L كميًا ، قمنا بتحور Gly المحفوظ في الموضعين 18 و 32 من P25K إلى Ala وقارننا كفاءات الانقسام مع النوع البري P25K. كما هو مبين في الشكل 4 أ، تم شق كلا موقعي WT P25K بالكامل في 1 و 9 ساعات ، على التوالي ، في حين لم يتم الحصول على دليل على انقسام المسخ المزدوج بعد 9 ساعات من الحضانة. يشير هذا إلى تفضيل قوي جدًا لـ Gly في موضع P1 من ركائز البروتين.

التنميط الفرعي للموقع K7L والمقارنة مع تفضيلات الركيزة ذات الصلة بالبروتياز. أ، P25K والطفرة المزدوجة ، G18A / G32A ، تم إنتاجها في بيئة خالية من الخلايا في المختبر نظام النسخ / الترجمة (Promega) ، المشقوق بواسطة المؤتلف K7L-GST للأوقات المحددة ، ويتم تصوره بعد SDS-PAGE كما هو موضح في & # x0201c الإجراءات التجريبية. & # x0201d ب، تفضيلات الأحماض الأمينية في مواضع P3-P1 & # x02032 في موقع الانقسام ، يظهر Gly & # x02193Ser 18 من P25K أن Gly 32 كان دائمًا متحورًا إلى Ala لتسهيل التحليل الكمي. أجريت التحليلات بنفس الطريقة الموضحة في لوحة أ. تم إدخال طفرات مفردة في مواضع P3-P1 & # x02032 من موقع Gly & # x02193Ser 18 ، كما هو موضح في المحور الافقي. ال محور رأسي يظهر معدلات الانقسام النسبي (٪). ج، تم إنشاء مكتبة من الببتيدات التي تستكشف مواضع P2-P4 كما هو موضح في & # x0201c الإجراءات التجريبية ، & # x0201d والأنشطة النسبية لـ 0.5 & # x003bc m K7L فيما يتعلق بأكثر الركيزة المشقوقة كفاءة في كل موضع. أجريت جميع التفاعلات في 40٪ من الجلسرين. ال المحور الافقي يُظهر الأحماض الأمينية المكتوبة في الرمز القياسي المكون من حرف واحد والأحماض الأمينية غير الطبيعية هي: ا، نورليوسين ب، & # x003b2- ألانين. د، تتم مقارنة التفضيلات النسبية مع البروتينات deSUMOylating و deubiquitizing البروتياز ذات الصلة. أحمر يشير إلى أعلى نشاط أسود يشير إلى الأدنى. يتم تجميع التفضيلات من خلال تشابهها مع K7L.

درسنا بعد ذلك انقسام ركائز رباعي الببتيد واستخدمنا نهج مكتبة الركيزة للمسح الموضعي لتحديد التفضيلات المثلى في المواضع P2 و P3 و P4. تم إصلاح موضع P1 على أنه Gly ، وتم تغيير كل من مواضع P2 و P3 و P4 بشكل عشوائي إلى واحد من 18 & # x0201320 من الأحماض الأمينية ، بما في ذلك norleucine و & # x003b2-alanine (الشكل 4). ج). نظرًا لأننا استخدمنا تركيزات مماثلة من الببتيد ، يمكن قياس المساهمات النسبية لبدائل الأحماض الأمينية في النشاط بشكل مباشر. تظهر النتائج تفضيلًا كبيرًا لـ Ala عند P2. كانت الانتقائية عند P3 أقل ، لكن البقايا الكارهة للماء كانت جيدة التحمل بشكل خاص. كان موضع P4 أكثر تقييدًا من P3 وأظهر تفضيلًا واضحًا للمخلفات الكارهة للماء (الشكل 4). ج). تتوافق هذه النتائج جيدًا مع الأشكال المتسلسلة الموجودة في أهداف الانقسام الطبيعي لـ K7L (الشكل 2 ج) وتمييز K7L عن البروتياز وثيق الصلة في Clan CE (الشكل 4 د) (39).

استخدمنا بعد ذلك ملاحظاتنا القائمة على الببتيد في تحليل طفري للركيزة الطبيعية المفترضة P25K. قمنا بتحور مواضع P3 و P2 و P1 & # x02032 في موقع الانقسام Gly 18 & # x02193Ser 19 أثناء إدخال طفرة Ala في Gly 31 لإسكات أي مساهمة للانقسام الثانوي (الشكل 4). ب). أظهر P1 & # x02032 في موقع Gly 18 & # x02193Ser 19 تفضيلًا واضحًا لـ Ser و Ala ، المخلفات الأكثر شيوعًا في جميع مواقع الانقسام الطبيعية المفترضة K7L (الشكل 2). ب). وجدنا أيضًا أن استبدال Ala في P2 بـ Gly لم يؤثر على معدل الانقسام ، مما يؤكد الاقتراح بأن انقسام الركائز الطبيعية قد يتأثر بالمواد الخارجية (12).

لتأكيد هذه النتائج ، قمنا بتوليف ركائز ACC فردية من رباعي الببتيد تتوافق مع تسلسل رباعي الببتيد الأمثل ومواقع الانقسام في P25K و P4b و P4a وشاركنا في احتضانها مع K7L. ال كقط/كم ثم تم حساب المعلمات من بيانات الانقسام (الجدول 1) ، وكشف عن تفضيل Tyr و Phe في الموضع P3. تشير هذه النتائج إلى أن خصوصية K7L في المواضع P2 و P1 و P1 & # x02032 المحيطة بالرابطة المقصية ترتبط جيدًا بمواقع الانقسام لتسلسل البروتينات الطبيعية (الشكل 2 ، C & # x02013E). ومع ذلك ، خارج هذه المنطقة ، تنهار الارتباطات.

رسم خرائط موقع ملزمة الركيزة الممتدة لـ K7L

تشير التناقضات في خصوصيات موقع الانقسام بين ركائز الببتيد والبروتين خارج الشق الحفزي إلى أن البقايا البعيدة أكثر من P4-P1 قد تؤثر على النشاط. لتحديد تأثير مواقع البقايا البعيدة على نشاط K7L ، استخدمنا استراتيجيتين. في الإستراتيجية الأولى ، قمنا بتوسيع ركائز الببتيدل المستندة إلى ACC لتشمل بقايا P1-P8 المطابقة لمواقع الانقسام P25K و P4a. تكشف القياسات الحركية أن مد كلا الركيزتين إلى بقايا P5 و P6 أعطى تحسينًا طفيفًا فقط في معدل التحلل المائي الببتيد. في المقابل ، أدى تمديد الركائز إلى الموضعين P7 و P8 إلى تعزيز التحلل المائي بما يصل إلى 25 ضعفًا مع ترك التحلل المائي للببتيد القائم على P4a دون تغيير تقريبًا. بشكل ملحوظ ، تم تفضيل البقايا المشحونة سالبًا في P7 و P8 ، المشتقة من مواقع الانقسام P25K ، على البقايا المحايدة الموجودة في هذه المواضع في الموقع P4a ومتواليات P4b.

في إستراتيجية ثانية ، قمنا بتوليف الببتيدات التي غطت بقايا P9-P4 & # x02032 من P25K و P4a و P4b ، المشتقة عند نهايتها N مع FAM. سمح لنا ذلك بمراقبة الانقسام بواسطة PR-HPLC للعينات الموقوتة بتركيزات منخفضة من الركيزة & # x003bc ، مما يسمح بتقدير الكفاءة التحفيزية (كقط/كم) (راجع & # x0201c الإجراءات التجريبية & # x0201d). تم تأكيد مواقع الانقسام بشكل مستقل بواسطة مطياف الكتلة MALTI-TOF. تمشيا مع النتائج المعروضة في الجدول 1 ، تم شق الببتيدات التي تشمل موقع P25K Gly 18 & # x02193Ser 19 بواسطة K7L بكفاءة أكبر بكثير من الببتيدات المشتقة من مواقع أخرى من بروتينات P25K و P4a و P4b.

ومن المثير للاهتمام ، أن الببتيد FAM-LDRIITNAGTCTV الذي يمتد على موقع الانقسام Gly 697 & # x02193Thr 698 من P4a بدا مقاومًا لتحلل البروتين K7L. كان هذا متوافقًا مع البيانات الموجودة على ببتيد Ac-TNAG-ACC مما يدل على أن هذا الموقع غير موات للغاية للانقسام بواسطة K7L (الجدول 2). بالاتفاق ، أكدت بيانات قياس الطيف الكتلي MALDI-TOF أن الببتيد FAM-LDRIITNAGTCTV لم ينشق حتى بمستويات عالية جدًا من K7L (غير معروض). على غرار الركيزة Ac-EDTIFFAG-ACC ، أدت إزالة بقايا P9-P7 من تسلسل الببتيد P25K الأمثل إلى تقليل معدل الانقسام بمقدار & # x0223c40 أضعاف. بشكل ملحوظ ، لم يكن لتمديد الركائز إلى ما بعد الرابطة المقصية في الاتجاه الرئيسي (أسفل المصب من الرابطة المقصية) أي تأثير كبير على معدلات الانقسام ، ويمتد من P2 & # x02032 إلى P4 & # x02032 فقط تحسين متواضع (أقل من ضعفين) في الحفز (الجدول 2). بشكل عام ، ترتبط بيانات الانقسام الخاصة بنا للببتيدات الأطول ارتباطًا جيدًا بنشاط K7L في المختبر ضد ركائز البروتين (P25K و P4b). استنادًا إلى بياناتنا ، من المحتمل أن موقع Gly 697 & # x02193Thr 698 لبروتين P4a هو ركيزة دون المستوى الأمثل لـ K7L.

الجدول 2

التحلل البروتيني K7L للببتيد المسمى P9-P4 & # x02032 FAM

تم تقييم المعلمات الحركية في المخزن المؤقت Tris-HCl 30 م ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 100 نانومتر كلوريد الصوديوم ، و 2 م م DTT ، و 45٪ من الجلسرين مع 10 & # x003bc م الببتيد و K7L من 0.1 إلى 1.0 & # x003bc م. تم استخدام O (نورليوسين) بدلاً من Met لتفادي أكسدة الأخير أثناء تخليق تسلسل DDLQMVIAG & # x02193AKSK. تشير الأخطاء إلى أن S.D. قياسين. ND ، غير محدد.

البروتين ، موقع الانقسامتسلسل الببتيدكقط/كم
45٪ جلسرين15٪ جلسرين
م & # x022121 س & # x022121
P25K ، Gly 18 & # x02193Ser 19 EEDشجاراي جي& # x02193سISE28000 & # x000b1 30001300 & # x000b1400
P25K ، Gly 18 & # x02193Ser 19 EEDشجاراي جي& # x02193سأنا17500 & # x000b1 1500
P25K ، Gly 18 & # x02193Ser 19 شجاراي جي& # x02193سISE670 & # x000b1220
P25K، Gly 32 & # x02193Ala 33 DDLQ ا السادساي جي& # x02193أKSK3500 & # x000b1800220 & # x000b1100
P4b، Gly 60 & # x02193Ser 61 الخامسDDDالجبهة الاسلامية للانقاداي جي& # x02193أRNQ2000 & # x000b1500
P4a، Gly 614 & # x02193Ser 615 YCPصYFYاي جي& # x02193سربط2100 & # x000b1500
P4a، Gly 697 & # x02193Ser 698 إلالدكتورIITNاي جي& # x02193تيجتلفزيوناختصار الثاني
P4a ، Gly 697 & # x02193Thr 698 mutantإلالدكتورIITNاي جي& # x02193تي س تلفزيوناختصار الثاني
دليل على التنشيط الخيفي الخارجي بوساطة K7L

اقترح التحفيز الكبير لنشاط الحفز K7L على الركائز التي تشغل مواضع P7 و P8 احتمالين 1) التعرف على الركيزة الموسعة أو 2) تفاعل خارجي يعمل كمفتاح خيفي. لمعالجة هذه الفرضيات ، اختبرنا ما إذا كان P25K يمكن أن يعزز تحلل البروتين K7L لركيزة Ac-ISAG-ACC. شاركنا في احتضان K7L (0.5 & # x003bc m) باستخدام P25K (0.1 & # x02013100 & # x003bc m) ثم قمنا بقياس سرعة انقسام الركيزة الفلورية. لم يكن لبروتينات المصل البقري الزلال (BSA) والليزوزيم أي تأثير على سرعة الانقسام ، لكن بروتين P25K عزز نشاط K7L بما يصل إلى 2.4 ضعفًا ، مع تأثير تحفيزي أقصى عند 8 & # x003bc m P25K. أدت تركيزات P25K الأعلى إلى تثبيط نشاط K7L ضد Ac-ISAG-ACC (الشكل 5). أ). في المقابل ، لم يُظهر الببتيد FAM-EEDTIFFAGSISE أي تحفيز لـ Ac-ISAG-ACC وبدلاً من ذلك تم تثبيطه باستخدام IC50 من 37 & # x003bc م ، على غرار التركيز الذي يبدأ عنده P25K في تثبيط انقسام ركيزة مراسل رباعي الببتيد (الشكل 5) ب). تتوافق هذه النتائج مع تأثير خيفي صغير ولكنها تشير إلى أن الآلية الرئيسية للانقسام المعزز للببتيدات الطويلة هي وجود التعرف على الركيزة الممتد والمتضافر.

تأثير P25K كامل الطول وعديد النيوكليوتيدات على نشاط K7L. أ، يظهر التنشيط بواسطة P25K لانقسام Ac-ISAG-ACC. التنشيط المعتمد على التركيز يناسب منحنى الاستجابة للجرعة على شكل جرس ، مع كأ = 8 & # x003bc م و كأنا = 45 & # x003bc م. تم استخدام BSA و lysozyme كعناصر تحكم في الارتباط غير المحدد. ب، الموضح هو تثبيط بواسطة FAM-EEDTIFFAGSISE لانقسام Ac-ISAG-ACC ، مع البيانات المجهزة لمنحنى الاستجابة للجرعة من الدرجة الأولى ، كأنا = 37 & # x003bc م. تم إجراء التفاعلات في 30 م م تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 ، تحتوي على 40٪ جلسرين ، 50 م م كلوريد الصوديوم ، 0.2 & # x020130.5 & # x003bc م K7L ، و 50 & # x003bc م ركيزة Ac-ISAG-ACC. ج، يظهر انقسام P25K بواسطة K7L في وجود عوامل مشتركة مختلفة. تم احتضان 0.3 & # x003bc m K7L للأوقات المحددة مع 8 & # x003bc m P25K في وجود 1 م م مغ 2+ (اللوحة اليسرى) ، الحمض النووي الريبي البشري (0.1 مجم / مل) + ملغ 2+ (اللوحة الوسطى) ، أو الحمض النووي الفيروسي (0.1 مجم / مل) + 1 ملي ميكروغرام 2+ (اللوحة اليمنى). أجريت التجارب 3 ، 15 ، أو 40٪ جلسرين كما هو محدد. تم فصل الملخصات بواسطة SDS-PAGE. د، والصور في ج تم ترقيمها لحساب كل منها كقط/كم القيم كما هو موضح ضمن & # x0201c الإجراءات التجريبية. & # x0201d ه، وتأثيرات الجلسرين ، والحمض النووي الريبي البشري ، والمغنيسيوم 2+ تظهر الأيونات الموجودة على انشقاق Ac-EDTIFFAG-ACC بواسطة K7L. تم احتضان K7L (0.1 & # x003bc m) بشكل مشترك عند 25 & # x000b0C مع الببتيد (10 & # x003bc m). احتوت التفاعلات على 30 م م تريس- حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 50 م م كلوريد الصوديوم ، و 2 م م من DTT ، والتركيزات المحددة من الجلسرين. عند الإشارة ، 1 م MgCl2 أو 0.1 ملغ / مل من الحمض النووي الريبي أضيفت إلى التفاعلات.

تحفز البولينيوكليوتيدات تحلل البروتين لـ P25K بواسطة K7L

P25K هو مادة رابطة عالية من عديد النيوكليوتيدات (كد = 1 & # x020132 ن م) ، بما في ذلك كل من RNA و DNA (44). لاختبار ما إذا كانت عديد النيوكليوتيدات تؤثر على انقسام P25K ، قمنا باحتضان K7L مع P25K في وجود وغياب الحمض النووي الريبي ، DNA لقص مزدوج الشريطة ، والجلسرين. حفز الحمض النووي ، وخاصة الحمض النووي الريبي (كلاهما عند 0.1 مجم / مل) ، بشكل كبير انقسام موقعي P25K ، وكان تأثيرهما قويًا بشكل خاص عند تركيزات منخفضة من الجلسرين (3 & # x0201315 ٪) (الشكل 5 ، ج و د). من الممكن أن تكون هناك حاجة إلى عديد النيوكليوتيدات لتحفيز تحلل البروتين K7L لبروتين P25K وأن هذا التحفيز لا يتطلب وجود نسبة عالية من الجلسرين. الأهم من ذلك ، أن الحمض النووي الريبي (والحمض النووي الفيروسي غير معروض) كلاهما يمنع انقسام ببتيد Ac-EDTIFFAG-ACC بواسطة K7L بواسطة & # x0223c4-fold (الشكل 5). ه) ، مما يشير إلى أن K7L لديه ميل لربط polyanions. علاوة على ذلك ، كان التحفيز متعدد النوكليوتيد للحفز على P25K أعلى بكثير من التأثير المثبط تجاه ركيزة octapeptide. نظرًا لأن التنشيط خاص بالبروتين ، فإننا نقترح أن يؤثر الحمض النووي الريبي والفيروسي على انقسام P25K من خلال تعزيز تفاعله مع K7L في موقع خيفي.

مثبطات ومسببات النشاط القائمة على الببتيد

تم استخدام بصمة الركيزة المفضلة K7L لتصميم المجسات القائمة على النشاط والتي يمكن التعرف عليها بواسطة البروتياز K7L. لهذا الغرض ، تم توظيف تسلسل الببتيد FYAG و EDTIFFAG بعلامة البيوتين N-terminal و VME المتفاعل & # x0201cwarhead & # x0201d (الشكل 6). أ). تم تأكيد انتقائية وكفاءة البيوتين- AEEAc-EDTIFFA-VME بشكل مباشر في تجارب وضع العلامات باستخدام K7L. لتصور المادة المسمى ، تعرضت العينات للنشاف الغربي باستخدام الستربتافيدين- HRP. على الرغم من أن المسبار القصير فشل في تسمية K7L بشكل مرئي ، إلا أن مسبار biotin-AEEAc-EDTIFFA-VME الأطول عند 25 نانومتر كان كافياً لتسمية الموقع النشط لـ K7L ، بما يتوافق مع ثوابت معدل التثبيط المقاسة (الشكل 6). ب). أشار حظر وضع العلامات بواسطة N-ethylmaleimide إلى أن المسبار يستهدف الموقع النشط (الشكل 6 ب).

يسمي المسبار القائم على النشاط K7L في المختبر وفي مستخلصات الخلايا. أ، كما هو موضح ، هي الصيغ الكيميائية للمسبارات القائمة على الببتيد الحيوي. تم حساب ثوابت التثبيط من خلال ملاحظة الانحلال الزائف من الدرجة الأولى للنشاط (كObs) في وجود تركيز المثبط (أنا). ب, اللوحة العلوية، تم تصنيف K7L (0.2 & # x003bc m) بالتركيزات المشار إليها قصيرة (س) ومنذ فترة طويلة (إل) تحقيقات لمدة 15 دقيقة عند 25 & # x000b0C وتصور باستخدام streptavidin-HRP بواسطة SDS-PAGE. اللوحة السفلية، تم تصور الإنزيم الكلي بواسطة النشاف الغربي باستخدام جسم مضاد لـ K7L على نفس الجل. ج، الموضح هو وضع العلامات على K7L و I7L في اللقاح المصاب بالفيروس (تعدد العدوى = 5 ، 24 ساعة) خلايا BSC-1. عند الإشارة إلى ذلك ، تم التعبير عن المؤتلف K7L بشكل مشترك من ناقل pTF7-3 المنقول. تمت إضافة 10 & # x003bc m EDTIFFAG-VME المعالج حيوياً إلى العينات المتجانسة ، المحتضنة لمدة 15 دقيقة ، وتحميلها على SDS-PAGE. تم تصور البروتينات المعالجة بيوتينيلات باستخدام الستربتافيدين- HRP. ال السهام السوداء تشير إلى مواقع K7L المؤتلف و I7L الفيروسي على الجل. ال فتح السهم يشير إلى عدم وجود نطاق I7L في عينة تفتقر إلى الفيروس.

لاختبار ما إذا كان مسبار biotin-EDTIFFAG-VME يسمي K7L الخلوي ، أضفنا 10 & # x003bc m تركيزات من المسبار إلى lysates من خلايا BSC-1 المصابة بفيروس اللقاح. بعد فترة حضانة قصيرة ، تم تحليل المحللين عن طريق النشاف الغربي باستخدام الستربتافيدين- HRP (الشكل 6). ج) وكذلك مع الجسم المضاد K7L (الشكل التكميلي 4). أظهرت النتائج أن المسبار كان يحمل في الغالب علامة 48 كيلو دالتون في الخلايا المصابة بالفيروس. ستكون التجارب المستقبلية والتحسين المسبق مطلوبة لتحديد ما إذا كانت المجسات الموصوفة هنا قادرة على منع العدوى الفيروسية و / أو النسخ المتماثل.

الاستنتاجات

تم تصنيف K7L من قبل نظام تصنيف MEROPS كعضو في عائلة C57 من peptidase Clan CE (45) ، وهي عشيرة تحتوي على بروتياز معالجة من الفيروس الغدي وفيروس حمى الخنازير الأفريقية ، وإنزيمات deSUMOylating من الخميرة إلى البشر ، وإنزيمات deubiquitizing من النبات و البكتيريا المسببة للأمراض الحيوانية (24 & # x0201329 ، 35). أطباء تقويم العظام K7L موجودون ويفترض أنهم مطلوبون في جميع فيروسات الأورثوبوكس. من خلال استخدام التعبير العابر والتحليلات الشرطية للفيروسات القاتلة ، تم إثبات سابقًا أن I7L ، أخصائي تقويم اللقاح لـ K7L ، مطلوب لمعالجة البروتين الأساسي (7 ، 16 ، 18). استخدمت دراسة منوية مقتطفات من الخلايا المصابة بالفيروس التي تحتوي على I7L لإثبات أن الإنزيم عبارة عن بروتياز السيستين القادر على تشق سلائف البروتين الأساسية P4a و P4b و P25K (17). ومع ذلك ، لم يكن المؤلفون قادرين على إنتاج I7L النشط تحفيزيًا المركب في المختبر، مما يؤدي بهم إلى استنتاج أن العامل المساعد مطلوب للنشاط.

نجاحنا في إنتاج K7L النشط تحفيزيًا بالتعبير في بكتريا قولونية يقودنا إلى اقتراح أن dimerization K7L ، ومن خلال الاستدلال I7L ، مطلوب للنشاط وأن في المختبر أنتج نظام الترجمة المستخدم سابقًا (17) تركيزات غير كافية من البروتين لتمكين dimerization كبير. علاوة على ذلك ، تشير نتائجنا بقوة إلى أن K7L يتطلب بالفعل عامل مساعد لتحقيق أقصى قدر من النشاط. على الرغم من أننا لا نعرف هويته ، فقد أظهرنا أن الجلسرين والأسموليت الأخرى التي تعمل على استقرار الطيات لها تأثير محفز. علاوة على ذلك ، وجدنا أن البوليانيونات لها تأثيرات تفاضلية على نشاط الإنزيم على البروتين تجاه & # x000e0 تجاه ركائز الببتيد. تشير هذه الخصائص معًا إلى لائحة K7L متعددة المتغيرات وأكثر تعقيدًا من تلك الخاصة بأعضاء Clan CE الآخرين ، ربما كنتيجة للمتطلبات الصارمة لأن يتم توطين نشاطها بشكل أساسي أو حصري في virion التكثيف (7 ، 16 ، 18 ).

المعلومات حول البروتياز الفيروسي الأخرى من Clan CE محدودة للغاية ، وحتى الآن فقط تم وصف البروتياز adenain المعالج بالفيروسات الغدانية بتفاصيل مهمة (29 ، 35 ، 46 ، 47). ومن المثير للاهتمام ، أن بعض خصائص K7L تبدو مختلفة عن أعضاء القبيلة الآخرين ، في حين أن البعض الآخر مرتبط. وبالتالي ، يعمل K7L بشكل أكثر كفاءة باعتباره جهاز homodimer ، وهو ليس مطلبًا تم الإبلاغ عنه لأنزيمات Clan CE الأخرى. ومع ذلك ، فقد قدمنا ​​، بالاشتراك مع أعضاء عشيرة CE الآخرين في المختبر دليل على أن العوامل المشتركة تعزز نشاط K7L ، على الرغم من اختلاف التفاصيل. وبالتالي ، يتم تنشيط الأدينين عن طريق الارتباط المتزامن لعاملين مشتركين ، الجزء المكون من 11 بقايا من البروتين الأساسي pIV والحمض النووي الفيروسي (29) ، بينما تشير بياناتنا إلى أن كلا من RNA و DNA oligonucleotides يمكن أن تعزز نشاط K7L تجاه الركيزة المماثلة ، P25K.

يساعد تحليلنا لخصائص ربط الركيزة الممتدة لـ K7L في شرح خصوصية البروتياز لركائزه المتوقعة ، وكشف أن وجود بقايا سالبة الشحنة في مواضع P7 و P8 يعزز بشكل كبير انقسام بعض الركائز.هذا يعني أن التفاعل الخارجي البعيد عن الموقع النشط مطلوب من أجل الانقسام الأمثل للركائز الطبيعية. تمشيا مع النتائج التي توصلنا إليها ، لا يتم شق أي من الببتيدات التي تمتد على موقع الانقسام P4a ، Gly 614 & # x02193Ser 615 ولا بروتين P4a نفسه ، بواسطة K7L المؤتلف.

تم اقتراح K7L كهدف واعد لعلاج الجدري (10 ، 11). في الواقع ، تم الإبلاغ عن جزيء صغير يمنع نضوج بروتين اللقاح الأساسي (10 ، 11) وقد يكون مثبطًا لـ I7L. يوضح تحليل المسبار القائم على النشاط المعتمد على النشاط الحيوي أن K7L نشط ​​وقابل للاستهداف في lysates من الخلايا المصابة. في الختام ، توفر نتائجنا العديد من الأفكار الجديدة حول آلية وخصوصية وتنظيم البروتياز الفيروسي K7L. يوفر عملنا أيضًا أساسًا متينًا بالإضافة إلى أدوات جزيئية محددة (طرق إنتاج البروتياز وتصميم المقايسة وتصميم المانع والتوليف) التي يمكن استخدامها الآن لاستكشاف وظيفة K7L في بيئة قائمة على الخلية.


شاهد الفيديو: Chapter 1 Virus Structure and Morphology (أغسطس 2022).