معلومة

هل يتحلل الحمض النووي المستخلص بعد فترة زمنية معينة؟


للاستخدام المباشر كقالب في تشغيل PCR. Chelex 100 5-10٪ w / v استخراج. بدون سرد البروتوكول بالكامل ، في النهاية يتم صب المادة الطافية ثم تخزينها عند 4 درجات مئوية. كان لدي انطباع بأن هذا يمكن تخزينه واستخدامه لاحقًا بشكل غير محدد تقريبًا ، لكن اثنتين من أربع عينات تم استخلاصها قبل عدة أشهر فشلت في إنتاج منتج (عندما كان معروفًا أنه يجب أن يكونا).

بافتراض عدم حدوث أخطاء وكانت ردود الفعل متشابهة ، فهل هناك سبب تقني لتراجع النموذج إلى نقطة غير قابلة للاستخدام؟

هل هناك قاعدة عامة حول المدة التي يمكن توقع استمرارها بشكل معقول؟


قاعدتي الأساسية لعينات الحمض النووي (في TE أو الماء) - إذا كانت لدي خطط لاستخدامها في ذلك الأسبوع ، فأنا أخزنها في 4C. إذا كنت أخطط لاستخدامه في غضون شهر ، فأنا أحفظه في درجة حرارة -20 درجة مئوية. إذا لم أكن متأكدًا من الوقت الذي سأستخدمه فيه ، فسأحتفظ بعدة قسامات عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. يمكن أن يتحلل الحمض النووي عن طريق التحلل المائي الحمضي في الماء ، بسبب تلوث النيوكليزات في العينة ، وبسبب دورات التجميد / الذوبان المتعددة.


استخراج الحمض النووي

تم استخلاص الدنا من اليرقات الفردية أو الحوريات أو البالغين أو المبايض باستخدام الحمض النووي الجينومي من مجموعة الأنسجة (Macherey-Nagel). حضور ال S. pierantonius تم قياس الحمض النووي عن طريق تضخيم التسلسل لـ S. pierantonius-جين محدد nuoCD. تم تطبيع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي مع جين أكتين المضيف. تستخدم تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي مجسات الفلورسنت لتحديد كمية الحمض النووي مزدوج الشريطة. في حين أن تقارير تفاعل البوليميراز المتسلسلة القياسية تنظر فقط إلى المنتج المضخم في نهاية التفاعل ، يقيس تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي تكوين هذا المنتج بمرور الوقت.


المقدمة

تطلبت التطورات البحثية الحديثة في الاضطرابات الجينية جمع كميات كبيرة من الحمض النووي عالي الجودة الذي يجب الحصول عليه من مصادر عينات مختلفة. تعد كتابة الحمض النووي حاليًا أكثر الطرق المصدق عليها للتعرف الشخصي على بقع السوائل الجسدية البشرية الموجودة في مسرح الجريمة. في مجموعة متنوعة من الدراسات الجينية ، تتمثل الطريقة الشائعة الاستخدام في الحصول على الحمض النووي الجيني من الخلايا المنواة للدم المحيطي نتيجة لغزو هذا النهج ، وقد يكون من الصعب الحصول على عينات من الأشخاص الخاضعين للدراسة. 1 ، 2 كانت مخططات العزلة مملة ، كما كانت أوقات التحليل الإجمالية طويلة إلى حد ما. تشمل المصادر البديلة الأخرى لعزل الحمض النووي الخلايا الشدقية ، والشعر مع الجريب ، والبول ، والتي يسهل الحصول عليها بطريقة غير باضعة من جمع الدم الغازي. 2 يمكن إجراء جمع الخلايا الشدقية بسهولة عن طريق مسحة شدق بمسحة قطنية أو باستخدام إجراء غسل الفم. 3 يوفر عزل الحمض النووي باستخدام مسحات الشدق العديد من المزايا ، مثل المعالجة الفعالة من حيث التكلفة ، ومتطلبات حجم العينة الأقل ، والأرشفة طويلة الأجل ، ومدى ملاءمة الجمع الذاتي. إنه أكثر راحة للمريض ، وتوفر المسحات الشدقية حمضًا نوويًا كافيًا لـ PCRs ، لأنها تتطلب عددًا قليلاً من النانوجرامات من الحمض النووي. 3

يعد شعر الإنسان أحد أكثر المواد البيولوجية شيوعًا المرتبطة بالتحقيقات القانونية وقد تم استخدامه في العمل السكاني القائم على الإحصاء والتحليل القائم على الحمض النووي في علم الجريمة. 4 الطريقة الأكثر قيمة لاختبار الحمض النووي هي تحليل التكرار الترادفي القصير للحمض النووي النووي. 5 هذا ممكن عند وجود جزء الجذر من الشعر و / أو الأنسجة الملتصقة. ومع ذلك ، فإن الشعر التيلوجيني (الشعر المتساقط) ، المرتبط غالبًا بمسرح الجريمة ، قد لا يحتوي على أي مواد نووية. 5 الميتوكوندريا الخلوية والحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) لا يزالان على حالهما ، 5 ، 6 بينما تتحلل النواة مع تصلب جذع الشعرة أثناء التقرن ، ويمكن تحليل mtDNA من الشعر المتقرن. لسوء الحظ ، تتطلب الطبيعة الغنية بالبروتين لعينات الشعر خطوات إضافية لتحطيم العمود وإطلاق الحمض النووي (مثل التجزئة باستخدام طاحونة زجاجية مجهرية ، متبوعة باستخلاص مذيب عضوي) 7 & # x02013 9 ، وبالتالي تعريض العينة إلى زيادة خطر التلوث. إن تحقيق الطب الشرعي لبقع البول البشرية له أهمية كبيرة عند تحديد الموقع الدقيق للجريمة ونوع الوفاة. 10 بول الإنسان هو عينة مناسبة لتحليل السموم في اختبارات تعاطي المنشطات وفحص الأدوية. 11

ومع ذلك ، نظرًا للصعوبات العملية والأسباب المنهجية ، من الضروري تحسين الظروف لتعظيم إنتاجية ونقاء الحمض النووي الذي يتم الحصول عليه من أنواع مختلفة من العينات باستخدام طرق مختلفة. الطريقة المبسطة ، الموضحة في هذه الدراسة ، لاستخراج الحمض النووي من أعمدة الشعر التي تقلل من الخطوات غير الضرورية تقضي فعليًا على تلوث الحمض النووي وتحافظ أيضًا بشكل كبير على المدة الزمنية للتحليل الذي سيكون مفيدًا لمجتمع الطب الشرعي وكذلك مجتمع البحث القائم على السكان. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مطلب انخفاض حجم العينة المقترن بجمع العينة بطريقة غير باضعة يسمح بأخذ عينات من الأطفال تظهر بسهولة في توظيف الدراسة الأوسع في دراسات الحالة المستندة إلى السكان. علاوة على ذلك ، يمكن تصور تطوير هذه الطريقة المبسطة حيث يمكن تطبيقها كأداة تشخيصية طبية مع تحليل الحمض النووي التي يمكن إجراؤها على نطاق زمني قصير إلى حد معقول (& # x0223c8 h) للكشف عن حالات المرض ، وهو التشخيص الطبي الحالي. مجال رغباته بفارغ الصبر.


فحص لنشاط إنزيمات إصلاح الختان الأساسي في المستخلصات الخلوية باستخدام مجسات DNA الفلورية

تتم إزالة قواعد الحمض النووي التالفة بواسطة آلية إصلاح استئصال القاعدة (BER). تبدأ هذه العملية الأنزيمية بفعل أحد جليكوزيلات الحمض النووي ، والذي يتعرف على قواعد الحمض النووي التالفة ويزيلها عن طريق التحلل المائي. ن- روابط جليكوسيدية مع تكوين مواقع أبورينيك / أبيرميدينيك (AP). يحلل نوكلياز Apurinic / apyrimidinic 1 (APE1) رابطة الفوسفوديستر على الجانب 5′ من موقع AP مع توليد كسر الحمض النووي أحادي الجديلة. يرتبط انخفاض النشاط الوظيفي لأنزيمات BER بزيادة مخاطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية والتنكسية العصبية والأورام. في هذا العمل ، طورنا طريقة مضان لقياس نشاط جليكوزيلات الحمض النووي البشري الرئيسية ونوكلياز AP ​​في مستخلصات الخلايا. تم اختبار فعالية مجسات الحمض النووي الفلوريسنت باستخدام الإنزيمات المنقاة ، وتم اختبار أكثر المسابير كفاءة في فحوصات النشاط الإنزيمي في مستخلصات خلايا A549 و MCF7 و HeLa و WT-7 و HEK293T و HKC8. كان نشاط الإنزيمات المسؤولة عن إصلاح مواقع AP وإزالة مخلفات اليوراسيل و 5،6-dihydrouracil أعلى في خطوط الخلايا السرطانية مقارنة بخط خلايا الكلى البشرية HKC8 الطبيعي.


2 طرق

تم جمع مشابك الزعانف (حوالي 1 سم 2) من الزعنفة الشرجية والذيلية (مع تجنب النسيج الغضروفي قدر الإمكان) من خمسة أسماك النهاش الأسترالية (جميعها من نفس العمر وتحت نفس الظروف البيئية) من وحدة أبحاث المأكولات البحرية في نيلسون يديره المعهد النيوزيلندي لأبحاث النبات والأغذية المحدودة. استخدمنا ثلاث معالجات تخزين: محلول الحفظ ، والمعالجة الحرارية ، ودرجة حرارة التخزين (الشكل 1). في المجموع ، تم تخزين 200 مشبك زعنفة بشكل فردي في أنابيب معقمة بحجم 2.0 مل ، مع محلول حفظ 1.5 مل. بهذه الطريقة ، تم غمر كل عينة بالكامل في المحلول وعدم ملامستها لعينات أخرى ، مما قد يمنع المحلول من دخول الأنسجة. تم جمع العينات خلال فترة زمنية مدتها ساعتان ، وتنظيف معدات أخذ العينات بالإيثانول بين الأفراد. تم استخراج مشابك الزعانف في خمس نقاط زمنية مختلفة: يوم واحد ، وأسبوع ، وأسبوعان ، وشهر ، و 3 أشهر. حلا الحفظ المستخدمان في هذه الدراسة هما الإيثانول (المطلق & GT99.5٪ ، الدرجة: البيولوجيا الجزيئية) و DESS (20٪ DMSO ، 0.25 M EDTA ، محلول مشبع بكلوريد الصوديوم ، انظر الملحقين S1 و S2). يجفف الإيثانول الخلايا ويسبب تخثر البروتينات من أجل الحفاظ على العينة عن طريق تثبيط العمليات الخلوية التي قد تكسر الحمض النووي. يمنع DESS تدهور الحمض النووي عن طريق إلغاء تنشيط الإنزيمات المعتمدة على المعادن (أي DNase) باستخدام EDTA. بالإضافة إلى ذلك ، تم ضبط محلول مخزون EDTA 0.5 M الخاص بنا على الرقم الهيدروجيني 8 مع NaOH لإذابة EDTA ، مما يخلق تأثير التخزين المؤقت للأس الهيدروجيني. كان المحلول عبارة عن ملح مركب بكلوريد الصوديوم (NaCl) الذي يعمل على استقرار الحمض النووي (MacFarlane et al. ، 2017). أخيرًا ، يُعرف DMSO بنقل المركبات (على سبيل المثال ، EDTA و NaCl) عبر أغشية الخلايا ويعمل كمبرد (Seutin et al. ، 1991). من المعروف أن DESS يؤدي أداءً جيدًا في نطاق واسع من درجات الحرارة ، بما في ذلك درجة حرارة الغرفة. تم تحضين العينات المعالجة حرارياً عند 80°C لمدة 5 دقائق في غضون ساعة من أخذ العينات لتدمير إنزيمات الحمض النووي المهينة. تم تخزين العينات في درجة حرارة "باردة" تبلغ 5 درجات مئوية وفي درجة حرارة الغرفة (

20 درجة مئوية). تم اختيار درجات الحرارة لتشبه ظروف التخزين التي تتم مواجهتها عادةً في الحقل وتعتبر بشكل عام دون المستوى الأمثل للتخزين على مدار عدة أيام. تم تخزين جميع العينات في ظروف مظلمة. تم استخراج خمس مكررات تقنية من كل فرد لكل مجموعة من علاجات الحفظ على مدى خمس فترات زمنية مختلفة (الشكل 1) ، مما أدى إلى ما مجموعه 200 عملية استخراج الحمض النووي.

تم استخلاص الحمض النووي باستخدام بروتوكول استخراج عالي الملح مقتبس من الجنابي ومارتينيز (1997) (انظر الملحقين S1 و S2). لتوحيد كمية الحمض النووي المستخرج من كل عينة ، تم استخدام ما بين 30 و 40 مجم من الأنسجة لكل عملية استخراج. تم إجراء جميع عمليات الاستخراج بواسطة نفس المشغل. تم استخدام أطراف الماصة ذات التجويف العريض في كل مرة يتم فيها سحب الحمض النووي من بين الأنابيب لتقليل الإجهاد البدني على شظايا الحمض النووي. تمت إزالة الحمض النووي طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة في 100 ميكرولتر من محلول TE (10 ملي مولار Tris-HCl pH 8 ، 1 ملي مولار EDTA). تم قياس الشوائب وتركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي Implen © NP80 ومجموعة Qubit واسعة النطاق (Invitrogen ©). تم تخفيف العينات لتركيز

3.0 نانوغرام / ميكرولتر وتقييمها على محلل الشظايا (التحليلي المتقدم) باستخدام مجموعة تحليل الحمض النووي الجيني عالي الحساسية ، و PROsize V3.0.1.6 لتلخيص النتائج.

تم إجراء ANOVA متعدد العوامل لاختبار المتغيرات التي كان لها تأثير كبير على حالة الحفاظ على العينة وتجزئة الحمض النووي. تم تحديد كمية تجزئة الحمض النووي باستخدام نقاط جودة GQN المطبقة في PROsize ، بناءً على الجبهة الأمامية مقابل أحجام الشظايا المعروفة في سلم الحمض النووي الجيني HS. أجرينا ثلاثة ANOVA منفصلة متعددة العوامل: واحدة باستخدام جميع العينات واثنتان باستخدام عينات من كل من معالجات الحل. تم إجراء تصور لانحلال حجم الجزء لكل علاج بمرور الوقت من خلال تقييم مخطط كهربية (تم تنفيذه في PROsize). تم دمج المخطط الكهربائي باستخدام برنامج نصي مخصص من لغة بايثون. أدت الاختلافات الطفيفة بين كل شوط إلى تقديرات نقطية مختلفة لأحجام أجزاء أكبر. لإنشاء نقاط بيانات متداخلة بين كل من عمليات تحليل الأجزاء الثلاثة ، تم تقريب أحجام الأجزاء التي تزيد عن 1 كيلو بايت إلى أقرب 10 ، وتم حساب متوسط ​​قيم وحدة التألق النسبية (RFU) عبر أحجام الأجزاء المتطابقة. وبالمثل ، تم تقريب أحجام الأجزاء التي تزيد عن 10 كيلو بايت إلى أقرب 100 وتم حساب متوسط ​​قيم RFU مرة أخرى. تم قص قيم RFU السلبية إلى الصفر. تم حساب متوسط ​​قيم RFU لكل علاج بعد التقسيم ، وتم تقدير فواصل الثقة 95٪ ورسمها في R (R Core Team ، 2013).

أخيرًا ، تم تقدير المساحة الموجودة أسفل كل منحنى باستخدام DescTools (Signorell ، 2016). لقد قدرنا المنطقة الواقعة تحت كل منحنى لكل علاج لتقييم الوفرة النسبية للحمض النووي HMW في الكمية الإجمالية للحمض النووي. لم تؤخذ أحجام الأجزاء الأصغر من 250 نقطة أساس في الاعتبار لمنع التحيزات من الحمض النووي الريبي. تم الحصول على النسب المئوية المعيارية للوزن الجزيئي العالي بأخذ قطعة الأرض ذات المساهمة الأكبر للوزن الجزيئي العالي (أي أكبر مساحة تحت المنحنى أعلى من 20 كيلو بايت) واستخدام ذلك لتوحيد المساهمات ذات الوزن الجزيئي العالي من الآخرين العلاجات.


النتائج

استجابة بطيئات المشية المجففة بعد الإجهاد الحراري عند 37 درجة مئوية

متوسط ​​25.8 (sd = 6.6) P. richtersi تم استخراج العينات في مكررات فضلات أوراق الشاهد ، وتم استخراج متوسط ​​24.5 (sd = 7.2) حيوان في مكررات مضغوطة.

كانت معدلات البقاء النهائية لكل من الحيوانات المجهدة والضابطة عالية دائمًا (أكثر من 80 ٪) ، بغض النظر عن مدة التجربة (7 و 14 و 21 يومًا الشكلان 1 و 2). كانت معدلات البقاء النهائية لبطيئات المشية المستخرجة من فضلات الأوراق مباشرة قبل بدء التجربة 83.4٪ (sd = 9.9).

لم تسجل فروق ذات دلالة إحصائية في معدلات البقاء على قيد الحياة النهائية بين بطيئات المشية المجهدة والسيطرة في أي اختبار للبقاء على قيد الحياة. لم تسجل فروق ذات دلالة إحصائية بين معدلات البقاء النهائية في كل من الحيوانات المجهدة والضابطة بشكل مستقل عن مدة التجربة (7 ، 14 و 21 يوما). بالإضافة إلى ذلك ، لم تسجل أي فروق ذات دلالة إحصائية بين معدلات البقاء النهائية لكل من بطيئات المشية المجهدة والضابطة فيما يتعلق بمعدلات البقاء النهائية المسجلة قبل بداية التجربة.

كانت Δ انتعاش الحيوانات المجهدة عند 37 درجة مئوية دالة على الأيام التي قضاها في الفرن (اختبار ارتباط بيرسون: ص= 0.004 الشكل 3). كان شفاء الحيوانات المجهدة لمدة 21 يومًا أعلى بكثير من تعافي الحيوانات المجهدة لمدة سبعة أيام (مان ويتني يو-اختبار: ص= 0.034) وتلك الخاصة بطيئات المشية التي جمعت في فضلات الأوراق قبل بداية التجربة (مان ويتني يو-اختبار: ص= 0.034). كلما زاد التعافي ، زاد عدد الحيوانات التي تحتاج إلى وقت أطول لاستعادة الحياة النشطة. لم يتم تسجيل فروق ذات دلالة إحصائية في Δ عمليات الاسترداد بين الضوابط.

استجابة بطيئات المشية المجففة بعد التأثيرات المجمعة للإجهاد الحراري عند 37 درجة مئوية ورطوبة نسبية مختلفة

في التجربة أ (بطيئات المشية المجففة بشكل طبيعي داخل فضلات الأوراق) ، متوسط ​​23.4 (sd = 9.2) P. richtersi تم استخراج العينات من مكررات فضلات الأوراق. تم تسجيل أعلى معدل بقاء نهائي (76.4٪ ، sd = 6.6) للحيوانات المحفوظة عند 0-3٪ RH ، بينما تم تسجيل أدنى معدل (61.1٪ ، sd = 6.6) للحيوانات التي تم الحفاظ عليها عند 80٪ RH (الشكل 4) . تم العثور على علاقة عكسية كبيرة بين معدلات البقاء على قيد الحياة النهائية وقيم RH (اختبار ارتباط بيرسون: ص= 0.003). كان معدل البقاء النهائي للحيوانات المحفوظة عند 0-3٪ RH أعلى بكثير من تلك المحفوظة عند 80٪ RH (Mann-Whitney يو-اختبار: ص=0.009).

بقاء العينات المجففة من Paramacrobiotus richtersi في مكررات السيطرة. أيام الصفر تتوافق مع بداية التجربة. يمثل كل عمود شريط القيمة المتوسطة في كل عمود يمثل الانحراف المعياري.

بقاء العينات المجففة من Paramacrobiotus richtersi في مكررات السيطرة. أيام الصفر تتوافق مع بداية التجربة. يمثل كل عمود شريط القيمة المتوسطة في كل عمود يمثل الانحراف المعياري.

كان الاسترداد Δ مرتبطًا بشكل مباشر بقيم RH (اختبار ارتباط بيرسون: ص& lt0.001). كان الانتعاش المسجل عند 80٪ رطوبة نسبية أعلى بكثير من ذلك المسجل عند 0-3٪ رطوبة نسبية (مان ويتني يو-اختبار: ص= 0.009) وبنسبة 20٪ رطوبة نسبية (RH) (مان ويتني يو-اختبار: ص= 0.009). لم يتم تسجيل فرق كبير في Δ الانتعاش بين 0-3٪ و 20٪ رطوبة نسبية.

في بطيئات المشية المجففة تجريبياً على ورق نشاف (التجربة ب) ، تم تسجيل أعلى بقاء نهائي (82.0٪ ، sd = 17.9) للعينات المحفوظة عند 0-3٪ رطوبة نسبية (الشكل 5). تم الحفاظ على البقاء النهائي للحيوانات عند 20٪ رطوبة نسبية و 50٪ رطوبة نسبية 58.0٪ (sd = 11.0) و 56.4٪ (sd = 10.0) ، على التوالي. ماتت جميع الحيوانات المحفوظة عند 80٪ من الرطوبة النسبية (الشكل 5).

تم العثور على علاقة عكسية بين معدلات البقاء على قيد الحياة النهائية ومستويات RH (اختبار ارتباط بيرسون: ص& lt0.001). كانت نسبة البقاء على قيد الحياة النهائية عند 0-3٪ أعلى بكثير من تلك المسجلة عند 20٪ RH (Mann-Whitney يو-اختبار: ص= 0.039) وعند 50٪ رطوبة نسبية (RH) (مان ويتني يو-اختبار: ص=0.026).

بقاء العينات المجففة من Paramacrobiotus richtersi بعد الإجهاد الحراري عند 37 درجة مئوية. يمثل كل عمود شريط القيمة المتوسطة في كل عمود يمثل الانحراف المعياري.

بقاء العينات المجففة من Paramacrobiotus richtersi بعد الإجهاد الحراري عند 37 درجة مئوية. يمثل كل عمود شريط القيمة المتوسطة في كل عمود يمثل الانحراف المعياري.

Paramacrobiotus richtersi. تم تسجيل عمليات الاسترداد في مكررات التحكم والمعالجة. تمثل الخطوط منحنيات خطية للتكيف مع البيانات الإجمالية.

Paramacrobiotus richtersi. تم تسجيل عمليات الاسترداد في مكررات التحكم والمعالجة. تمثل الخطوط منحنيات خطية للتكيف مع البيانات الإجمالية.

انتعاش الحيوانات المجففة المحفوظة عند 50٪ رطوبة نسبية أعلى بشكل ملحوظ (مان ويتني يو-اختبار: ص= 0.007) من تلك الموجودة في بطيئات المشية التي تم الحفاظ عليها عند 20٪ رطوبة نسبية. لم تسجل فروق ذات دلالة إحصائية في Δ الانتعاش بين 50٪ - (0-3)٪ رطوبة نسبية وبين (0-3) - 20٪ رطوبة نسبية. أخيرًا ، لم يتم العثور على علاقة بين Δ الانتعاش ومستويات RH.

تدهور الحمض النووي

لم يلاحظ أي أضرار مرئية في الحمض النووي المزدوج الشريطة لعينات مجففة من P. richtersi احتفظ بها لمدة 21 يومًا عند 37 درجة مئوية و 20٪ ، 50٪ أو 80٪ رطوبة نسبية وفي الضوابط (بطيئات المشية النشطة رطبة أو مجففة الشكل 6). لم تظهر جميع الممرات أي تلطيخ ، وهو ما يرتبط عادةً بتدهور الحمض النووي. لم تُلاحظ أي أضرار مرئية في الحمض النووي الخيطي الفردي لعناصر التحكم (بطيئات المشية النشطة أو المجففة الشكل 7) وفي بطيئات المشية المحفوظة لمدة 21 يومًا عند 20٪ رطوبة نسبية. ومع ذلك ، لوحظ تلطيخ في بطيئات المشية المجففة المحفوظة لمدة 21 يومًا عند 37 درجة مئوية و 50٪ أو 80٪ رطوبة نسبية ، مما يشير إلى وجود فواصل حبلا مفردة.

البقاء على قيد الحياة Paramacrobiotus richtersi العينات التي تم تجفيفها بشكل طبيعي داخل فضلات الأوراق وتعرضت لقيم مختلفة من الرطوبة النسبية للهواء (RH) ولإجهاد حراري عند 37 درجة مئوية لمدة 21 يومًا (التجربة أ). يمثل كل عمود شريط القيمة المتوسطة في كل عمود يمثل الانحراف المعياري.

البقاء على قيد الحياة Paramacrobiotus richtersi العينات التي تم تجفيفها بشكل طبيعي داخل فضلات الأوراق وتعرضت لقيم مختلفة من الرطوبة النسبية للهواء (RH) ولإجهاد حراري عند 37 درجة مئوية لمدة 21 يومًا (التجربة أ). يمثل كل عمود متوسط ​​شريط القيمة في كل عمود الانحراف المعياري.

البقاء على قيد الحياة Paramacrobiotus richtersi تم تجفيف العينات تجريبياً على ورق نشاف وتعرضت لقيم مختلفة من الرطوبة النسبية للهواء (RH) ولإجهاد حراري عند 37 درجة مئوية لمدة 21 يومًا (التجربة ب). يمثل كل عمود شريط القيمة المتوسطة في كل عمود يمثل الانحراف المعياري.

البقاء على قيد الحياة Paramacrobiotus richtersi تم تجفيف العينات تجريبياً على ورق نشاف وتعرضت لقيم مختلفة من الرطوبة النسبية للهواء (RH) ولإجهاد حراري عند 37 درجة مئوية لمدة 21 يومًا (التجربة ب). يمثل كل عمود شريط القيمة المتوسطة في كل عمود يمثل الانحراف المعياري.


نتائج

حان وقت ذبول البتلة وانقطاعها

Antirrhinum majus (Scrophulariaceae) و هجين البطونية (Solanaceae) لها أزهار منفردة ، ولكل منها خمس بتلات مدمجة. Argyranthemum frutescens (Asteraceae) لها رؤوس أزهار مركبة بحلقة خارجية من 20 زهيرة شعاعية ، ولكل منها بتلة واحدة كبيرة. يُعرَّف مصطلح "بتلات" هنا على النحو التالي: جميع البتلات الموجودة في كورولا النوعين الأولين ، أو البتلات الكبيرة لجميع أزهار الأشعة في A. frutescens.

أظهرت بتلات جميع الأنواع ذبول مرئي مرتبط بالـ PCD (الشكل 1). كان وقت الذبول ، من بداية الزهرة الكاملة ، ∼9 و 10 و 7 أيام Argyranthemum ، أنتيرهنوم، و البطونية، على التوالى. للأغراض الحالية ، تم تمييز أربع مراحل نمو: في S1 ، فتحت الزهرة للتو تمامًا ، وفي S2 كانت أولى أعراض الذبول مرئية ، وفي S3 كانت أعراض الذبول موجودة بوضوح في جميع البتلات وفي جميع أنحاء البتلات ، وفي S4 كانت أعراض الذبول موجودة بوضوح في جميع البتلات وفي جميع أنحاء البتلات ، كانت البتلات جافة بشكل واضح.

حان الوقت لذبول البتلة وانفصال البتلة فيها Antirrhinum majus ، Argyranthemum frutescens، و هجين البطونية. المرحلة S1 ، فتحة الزهرة الكاملة S2 ، ظهور ذبول البتلة S3 ، ذبول البتلة بالكامل S4 ، البتلات جافة. كل الصور لها نفس المقياس.

حان الوقت لذبول البتلة وانفصال البتلة فيها Antirrhinum majus ، Argyranthemum frutescens، و هجين البطونية. المرحلة S1 ، فتحة الزهرة الكاملة S2 ، ظهور ذبول البتلة S3 ، ذبول البتلة بالكامل S4 ، البتلات جافة. كل الصور لها نفس المقياس.

بعد الذبول الشديد (S3) ، سقطت البتلات في حدود 1 د بوصة البطونية. بقيت بتلات النوعين الآخرين متصلة بالنبات وجفت بشكل واضح خلال 3-4 أيام بعد الذبول الشديد.

تدهور الحمض النووي

أظهرت تحليلات هلام Agarose عدم وجود تدهور في الحمض النووي بحلول وقت فتح الزهرة الكاملة في جميع الأنواع الثلاثة (الشكل 2 ، S1). في المرحلة S2 ، تم العثور على انهيار شامل للحمض النووي أرغيرانتيموم و زهرة الخطم نبات. حدث تدهور أقل بكثير بحلول ذلك الوقت في البطونية بتلات (الشكل 2). في المرحلة S3 ، كان التدهور مشابهًا لـ S2 في أرغيرانتيموم و زهرة الخطم نبات. في هذه المرحلة ، كان التدهور واسع النطاق في البطونية ( الصورة 2). أظهرت المرحلة S4 عددًا أقل من شظايا الحمض النووي على المواد الهلامية على الاغاروز مقارنةً بالمرحلة 3 ، في كلاهما أرغيرانتيموم و البطونية. تم العثور على مزيد من التجزئة ، مقارنة مع المرحلة 3 ، في زهرة الخطم نبات ( الصورة 2). لوحظ فقط سلم خافت للحمض النووي في جميع الأنواع الثلاثة المختبرة (الشكل 2). كشف الحمض النووي الكلي ، كما هو محدد بواسطة قياس الامتصاص الطيفي الجزيئي ، عن زيادة في المرحلة S2 في أرغيرانتيموم، متبوعًا بانخفاض تدريجي في المرحلتين S3 و S4 (الشكل 3). في زهرة الخطم نبات، تم العثور على انخفاض كبير بين المرحلتين S1 و S2. في البطونية، بقيت كمية الحمض النووي كما هي بين S1 و S2 ، ثم انخفضت بشكل حاد في S3 (الشكل 3).

تحليل هلام الاغاروز للحمض النووي الكلي المعزول من بتلات Antirrhinum majus ، Argyranthemum frutescens، و هجين البطونية. تم استخلاص قسامة 3 ميكروغرام من الحمض النووي الكلي من البتلات ، ثم تم فصلها بالكهرباء في هلام الاغاروز بنسبة 3٪ وملطخة بصبغة هلام الحمض النووي SYBR Gold. تشير الممرات S1 - S4 إلى الحمض النووي المعزول من البتلات في المراحل S1 - S4. المرحلة S1 ، فتحة الزهرة الكاملة S2 ، ظهور ذبول البتلة S3 ، ذبول البتلة بالكامل S4 ، البتلات جافة.

تحليل هلام الاغاروز للحمض النووي الكلي المعزول من بتلات Antirrhinum majus ، Argyranthemum frutescens، و هجين البطونية. تم استخراج قسامة 3 ميكروغرام من الحمض النووي الكلي من البتلات ، ثم تم فصلها بالكهرباء في هلام الاغاروز بنسبة 3 ٪ وملطخة بصبغة هلام الحمض النووي SYBR Gold. تشير الممرات S1 - S4 إلى الحمض النووي المعزول من البتلات في المراحل S1 - S4. المرحلة S1 ، فتحة الزهرة الكاملة S2 ، ظهور ذبول البتلة S3 ، ذبول البتلة بالكامل S4 ، البتلات جافة.

DNA لكل كورولا في Antirrhinum majus و هجين البطونية، وفي بتلات جميع زهيرات شعاع Argyranthemum frutescens. تم تقدير مستويات الحمض النووي عن طريق الامتصاص الجزيئي الطيفي. القيم تعني ± SD لتجربتين منفصلتين (إجمالي ن= 4). المرحلة S1 ، فتحة الزهرة الكاملة S2 ، ظهور ذبول البتلة S3 ، ذبول البتلة بالكامل S4: تجف البتلات.

DNA لكل كورولا في Antirrhinum majus و هجين البطونية، وفي بتلات جميع زهيرات شعاع Argyranthemum frutescens. تم تقدير مستويات الحمض النووي عن طريق الامتصاص الجزيئي الطيفي. القيم تعني ± SD لتجربتين منفصلتين (إجمالي ن= 4). المرحلة S1 ، فتحة الزهرة الكاملة S2 ، ظهور ذبول البتلة S3 ، ذبول البتلة بالكامل S4: تجف البتلات.

DNA لكل نواة أو كتلة DNA

إذا لم يكن من الواضح أن بنية تشبه النواة المحتوية على الحمض النووي لا تزال تعمل كنواة ، فإنها تسمى هنا كتلة الحمض النووي. من المفترض أن الهياكل المحتوية على الحمض النووي التي لوحظت في S1 (الشكل 5) هي نوى وأن الكروماتين المكثف قليلاً (الشكل 5 S2) لا يزال موجودًا في النواة.

تم استخدام صبغة التألق DAPI ، الخاصة بالحمض النووي ، لتحديد كمية الحمض النووي لكل نواة (أو كتلة الحمض النووي) ، باستخدام قياس التدفق الخلوي. يتم تقديم البيانات في رسم بياني يوضح عدد النوى أو كتل الحمض النووي لكل فئة مضان ، حيث x- ينقسم المحور إلى فئات من زيادة التألق (الشكل 4 أ). في S1 ، يكون توزيع الفلورة في زهرة الخطم نبات و البطونية كانت متشابهة: قمة حادة تمثل النوى في G1 مرحلة دورة الخلية (الشكل 4 أ). الذروة الرئيسية زهرة الخطم نبات تحولت إلى فئات منخفضة من الفلورة ، وانخفضت في الارتفاع ، وأصبحت أوسع في المرحلة S2. تم العثور على عدد قليل من كتل الحمض النووي في فصول منخفضة للغاية من التألق. في المرحلة S3 ، تحولت القمة الرئيسية إلى مضان أقل. اختفت الذروة في المرحلة S4 ، عندما كان العديد من كتل الحمض النووي مضانًا منخفضًا (الشكل 4 أ). في البطونية، حدثت هذه التغييرات بسرعة أكبر نسبيًا مما كانت عليه في زهرة الخطم نبات. في S2 ، كانت الذروة الرئيسية أصغر بكثير بالفعل ، وتم العثور على العديد من كتل الحمض النووي بحلول ذلك الوقت في فصول ذات تألق منخفض. بالمراحل S3 و S4 ، انخفضت الذروة الرئيسية أكثر (الشكل 4 أ).

تحديد التدفق الخلوي للفلورة بواسطة كتل DNA الملطخة بـ DAPI (بما في ذلك النوى الوظيفية) في بتلات Antirrhinum majus ، Argyranthemum frutescens، و هجين البطونية. (أ) تم الحصول على الرسوم البيانية عن طريق قياس التدفق الخلوي لـ ∼ 5000 كتلة DNA. المرحلة S1 ، فتحة الزهرة الكاملة S2 ، ظهور ذبول البتلة S3 ، ذبول البتلة بالكامل S4 ، البتلات جافة. (ب) مناظر مكبرة للأجزاء الصغيرة التي تم وضعها بقيم مضان بين 10 1 و 2 × 10 1 من الرسوم البيانية في (أ). النوى الانقسامية ، إن وجدت ، يشار إليها بدائرة.

تحديد التدفق الخلوي للفلورة بواسطة كتل DNA الملطخة بـ DAPI (بما في ذلك النوى الوظيفية) في بتلات Antirrhinum majus ، Argyranthemum frutescens، و هجين البطونية. (أ) تم الحصول على الرسوم البيانية عن طريق قياس التدفق الخلوي لـ ∼ 5000 كتلة DNA. المرحلة S1 ، فتحة الزهرة الكاملة S2 ، ظهور ذبول البتلة S3 ، ذبول البتلة بالكامل S4 ، البتلات جافة. (ب) مناظر مكبرة للأجزاء الصغيرة التي تم وضعها بقيم مضان بين 10 1 و 2 × 10 1 من الرسوم البيانية في (أ). النوى الانقسامية ، إن وجدت ، يشار إليها بدائرة.

في أرغيرانتيموم بتلات ، لوحظت قمتان عريضتان إلى حد ما في S1. تحولت القمة الثانية قليلاً إلى مضان أقل بين S1 و S2 ، وانخفضت في الارتفاع من S1 إلى S3. لقد اختفى بواسطة S4. بقيت القمة الأولى في نفس الموضع من S1 إلى S3 وزادت في الارتفاع بين S1 و S2 ، ثم بقيت على نفس الارتفاع (S3) واختفت بعد ذلك (S4). زاد عدد كتل الحمض النووي ذات الفلورة المنخفضة جدًا من S2 إلى S4 (الشكل 4 أ).

نظرًا لأن القمة الرئيسية في S1 تم وضعها عند قيمة الفلورة التعسفية البالغة 10 1 ، فإن أي نوى انقسامية تحتوي على ضعف كمية الحمض النووي التي تحتوي على G1 من المتوقع أن تكون النواة 2 × 10 1. في الواقع ، هذا هو المكان الذي تم فيه العثور على قمة صغيرة في S1 في زهرة الخطم نبات و البطونية (الشكل 4 ب). لم يتم العثور على مثل هذه الذروة الصغيرة في مراحل لاحقة من التطور ، ولم يتم ملاحظة ذروة صغيرة في أي مرحلة في أرغيرانتيموم (الشكل 4 ب). قد يتم التساؤل عما إذا كانت الذروة الثانية في أرغيرانتيموم يمثل النوى الانقسامية. كما تمت الإشارة إليه في المناقشة ، يُقترح أنه لا يفعل ذلك.

مورفولوجيا النووية

تم عزل كتل النوى أو الحمض النووي من البتلات ، الملطخة بـ DAPI ، ثم تمت ملاحظتها باستخدام الفحص المجهري الفلوري. عند مقارنة المراحل S2 مع S1 ، فإن نوى زهرة الخطم نبات أظهر زيادة كبيرة في الأسفار وانخفاض في القطر (الشكل 5). بالمقارنة مع S2 ، زاد قطر النوى بمقدار S3. في تلك المرحلة ، كان لكتل ​​الكروماتين مضان ساطع. في المرحلة S4 ، يبدو أن قطر هذه الكتل قد زاد. كما زاد قطر النوى فيما يتعلق بـ S3 (الشكل 5).

مورفولوجيا كتل الحمض النووي الملطخة بـ DAPI (بما في ذلك النوى الوظيفية) في بتلات Antirrhinum majus ، Argyranthemum frutescens، و هجين البطونية. المرحلة S1 ، فتحة الزهرة الكاملة S2 ، ظهور ذبول البتلة S3 ، ذبول البتلة بالكامل S4 ، البتلات جافة. الأسهم الموجودة في إحدى صور S3 الخاصة بـ أرغيرانتيموم و البطونية تشير إلى تجزئة واضحة لكتلة الحمض النووي.

مورفولوجيا كتل الحمض النووي الملطخة بـ DAPI (بما في ذلك النوى الوظيفية) في بتلات Antirrhinum majus ، Argyranthemum frutescens، و هجين البطونية. المرحلة S1 ، فتحة الزهرة الكاملة S2 ، ظهور ذبول البتلة S3 ، ذبول البتلة بالكامل S4 ، البتلات جافة. الأسهم الموجودة في إحدى صور S3 الخاصة بـ أرغيرانتيموم و البطونية تشير إلى تجزئة واضحة لكتلة الحمض النووي.

التغييرات المورفولوجية في أرغيرانتيموم كانت مماثلة لتلك الموجودة في البطونية (الشكل 5). في المرحلة S3 ، كان لبعض كتل الحمض النووي قطرًا أصغر وإشراقًا أكثر إشراقًا من النوى المعزولة في المرحلتين S1 و S2. في المرحلة S4 ، أصبح قطر العديد من كتل الحمض النووي أصغر بشكل متزايد. لوحظ تجزئة واضحة لكتلة الحمض النووي في مثال واحد لكل منها أرغيرانتيموم و البطونية (الشكل 5 ، الأسهم).

قطر أرغيرانتيموم كانت النوى في S1 حوالي ثلاثة أضعاف النوعين الآخرين المختبرين (الشكل 5). أرغيرانتيموم يحتوي على نوعين من النوى في المرحلتين S1 و S2 ، أحدهما بقطر أصغر بكثير من الآخر (البيانات غير معروضة). الصور التي تمثل S1 و S2 من أرغيرانتيموم يوضح الشكل 5 أمثلة نموذجية لهاتين المجموعتين.

تلطيخ المواد الدهنية حول النوى وكتل الحمض النووي

تم عزل كتل النوى والحمض النووي ، في مراحل مختلفة من PCD ، وتلطيخها باستخدام الفلوروكروم الفلوروكرومي الموجب للدهون.6. كانت نفس النوى ملطخة بـ DAPI وتمت مقارنة الصورتين الفلوريتين (الشكل 6). في جميع الأنواع الثلاثة التي تم اختبارها ، أشار الفحص المجهري للنوى الفلورية في المرحلة S1 التي كانت ملطخة بـ DAPI إلى غلاف نووي. والمثير للدهشة ، تلطيخ مع الفلوروكروم ديوك الموجبة للدهون6 لم تكشف عن وجود غلاف نووي في المرحلة S1 في أي من الأنواع الثلاثة التي تم اختبارها. وبالمثل ، لم يتم اكتشاف مثل هذا التركيب الغشائي حول النواة أو كتل الحمض النووي بعد DiOC6 تلطيخ كتل الحمض النووي والأنوية المعزولة في المرحلتين S2 و S3 (النتائج غير معروضة). تلطيخ مع DiOC6ومع ذلك ، فقد أظهر وجود مادة محبة للدهون حول معظم النوى في المرحلة S4 في جميع الأنواع الثلاثة (الشكل 6). في زهرة الخطم نباتديوك6 ملطخة مادة محبة للدهون في المرحلة S4 ، عندما كانت النوى في مرحلة مميزة من تجزئة الكروماتين ، وهي مرحلة غير موجودة في المرحلتين S2 و S3 من هذا النوع (الشكل 6). في أرغيرانتيموم و البطونيةديوك6 ملطخة فقط نوى صغيرة جدًا ، والتي لم يتم العثور عليها في المراحل السابقة (الشكل 6).

تلطيخ تفاضلي للمواد الغشائية وكتل الحمض النووي في بتلات Antirrhinum majus ، Argyranthemum frutescens، و هجين البطونية. كانت كتل الحمض النووي (بما في ذلك النوى الوظيفية) المعزولة من البتلات ملطخة بـ DAPI و DiOC6، ثم لوحظ باستخدام مجهر مضان تحت إثارة U و IB. في جميع الأنواع الثلاثة ، أظهر الغلاف النووي مضانًا بعد تلطيخه باستخدام DiOC6 فقط في المرحلة S4 ، وليس في المراحل السابقة.

تلطيخ تفاضلي للمواد الغشائية وكتل الحمض النووي في بتلات Antirrhinum majus ، Argyranthemum frutescens، و هجين البطونية. كانت كتل الحمض النووي (بما في ذلك النوى الوظيفية) المعزولة من البتلات ملطخة بـ DAPI و DiOC6، ثم لوحظ باستخدام مجهر مضان تحت إثارة U و IB. في جميع الأنواع الثلاثة ، أظهر الغلاف النووي مضانًا بعد تلطيخه باستخدام DiOC6 فقط في المرحلة S4 ، وليس في المراحل السابقة.

العدد الإجمالي لكتل ​​الحمض النووي لكل كورولا أو في بتلات زهيرات الأشعة

تم قياس العدد الإجمالي لكتل ​​النوى أو الحمض النووي لكل كورولا ، أو في جميع بتلات زهيرات الأشعة ، بواسطة تلطيخ DAPI القياسي. تم أخذ جزء معروف من العينة الإجمالية لقياس التدفق الخلوي ، حيث تم استخدام الأداة لحساب عدد النوى أو كتل الحمض النووي في العينة. في زهرة الخطم نبات، انخفض عدد النوى أو كتل الحمض النووي لكل كورولا ، كما هو محدد بواسطة قياس التدفق الخلوي ، من اليوم الثالث بعد فتح الزهرة الكاملة ، أي بوضوح قبل المرحلة S2 (الشكل 7). تم العثور على زيادة في عدد كتل الحمض النووي في بتلات جميع زهيرات الأشعة أرغيرانتيموم وكورولا البطونية (الشكل 7). في أرغيرانتيموم، زاد العدد بنحو الثلث ، وفي البطونية العدد تضاعف تقريبا. من يوم 10 (أرغيرانتيموم) أو اليوم 7 (البطونية), the measured number of DNA masses decreased again ( Fig. 7).

Number of DNA masses per corolla in Antirrhinum majus و Petunia hybrida, and in the petals of all ray florets of Argyranthemum frutescens Determination used flow cytometry. Values are means±SD of five separate experiments.

Number of DNA masses per corolla in Antirrhinum majus و Petunia hybrida, and in the petals of all ray florets of Argyranthemum frutescens Determination used flow cytometry. Values are means±SD of five separate experiments.


The Basics of DNA Extraction

You’ve probably heard of the Genetic Code or the Blueprint of Life these terms refer to DNA. All living things, including animals, plants, and bacteria, have DNA in their cells. DNA is a very long molecule made up of a chain of nucleotides and the order of these nucleotides is what makes organisms similar to others of their species and yet different as individuals. Genes are sections within this long DNA molecule.

In order to study DNA, you first have to get it out of the cell. In eukaryotic cells, such as human and plant cells, DNA is organized as chromosomes in an organelle called the nucleus. Bacterial cells have no nucleus. Their DNA is organized in rings or circular plasmids, which are in the cytoplasm. The DNA extraction process frees DNA from the cell and then separates it from cellular fluid and proteins so you are left with pure DNA.

The three basic steps of DNA extraction are 1) lysis, 2) precipitation, and 3) purification.

Step 1: Lysis
In this step, the cell and the nucleus are broken open to release the DNA inside and there are two ways to do this. First, mechanical disruption breaks open the cells. This can be done with a tissue homogenizer (like a small blender), with a mortar and pestle, or by cutting the tissue into small pieces. Mechanical disruption is particularly important when using plant cells because they have a tough cell wall. Second, lysis uses detergents and enzymes such as Proteinase K to free the DNA and dissolve cellular proteins.

Step 2: Precipitation
When you complete the lysis step, the DNA has been freed from the nucleus, but it is now mixed with mashed up cell parts. Precipitation separates DNA from this cellular debris. First, Na+ ions (sodium) neutralize the negative charges on the DNA molecules, which makes them more stable and less water soluble. Next, alcohol (such as ethanol or isopropanol) is added and causes the DNA to precipitate out of the aqueous solution because it is not soluble in alcohol.

Step 3: Purification
Now that DNA has been separated from the aqueous phase, it can be rinsed with alcohol to remove any remaining unwanted material and cellular debris. At this point the purified DNA is usually re-dissolved in water for easy handling and storage.

Targeted Alaska Grade Level Expectations
[9] SC1.1 The student demonstrates an understanding of how science explains changes in life forms over time, including genetics, heredity, the process of natural selection, and biological evolution by recognizing that all organisms have chromosomes made of DNA and that DNA determines traits.


Protein profiling

In order to understand how the protein can be used to identify individuals, it is important to understand that proteins are coded by DNA. This means that a certain level of the genetic variation that we see in different people’s DNA passes into their proteins. In fact, genetic information in the DNA is translated into amino-acid chains that make up proteins.

DNA profiling has been useful, but it has its downsides. wikimedia

The authors focused their attention on hair samples obtained from four different groups of people. Three samples were collected from American-European, American-African and Kenyan living subjects. The fourth was collected from two British archaeological excavations, one in London and the second in Kent, dating from about 1750 to 1853 respectively. They also analysed hair samples from 76 living humans of American-European and African descent.

Hairs from different subjects were milled and then biochemically processed with a solution of urea, the major organic component of human urine dithiothreitol, a detergent and a substance called trypsin, which can cut chains of amino acids. This resulted in mixtures of peptides (short amino-acid sequences), which were then analysed using a liquid chromatography mass spectrometer, which separates compounds of particular masses so that we can identify them.

In this way, the researchers managed to pin down around a hundred protein markers that can help identify someone using a single hair. The most common proteins, both in the modern and archaeological samples, were structural compounds like keratins – the main component of hair – and related proteins. The accuracy of the technique is such that we can reliably identify an individual among 12,500 people in the European population (the value was considerably lower in the African population).

But this accuracy can be greatly improved by analysing more and more peptides and discovering further protein markers. The current accuracy can be compared to that at the beginning of the DNA typing era. But nowadays, DNA sequencing can reliably identify a person among 10 13 unrelated individuals.


أساليب

Strains and media

All strains were derived from a triple-knockout بكتريا قولونية MG1655 Δ(araC-araBAD) ΔPlacI:LacI Δ(cas3-CRISPR) parent (Supplementary Table 2). Standard plasmids were cloned and propagated using an بكتريا قولونية Mach1-T1 R host (F − ϕ80(لاكZ)ΔM15 ΔلاكX74 hsdR(rك − mك + ) ΔrecA1398 endأ 1 tonA Life Technologies), while plasmids containing an R6Kγ origin of replication were cloned and propagated using an بكتريا قولونية TransforMax EC100D pir-116 host (F mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL (Str ص ) nupG pir-116(DHFR)) (Epicenter). Cells were plated on LB (LB Miller Medium, Difco, #244620) supplemented with 1.5% (w/v) agar (Bacto Agar, Difco, #214010), and liquid cultures were grown in 2YT media (2xYT (Yeast Extract Tryptone) Medium, Difco #244020) for all experiments. Ampicillin (100 μg ml −1 sodium ampicillin, Gold Biotechnology #A-301-25), kanamycin (50 μg ml −1 kanamycin sulfate, Gold Biotechnology #K-120-10), spectinomycin (100 μg ml −1 spectinomycin dihydrochloride, Gold Biotechnology #S-140-5) and/or chloramphenicol (35 μg ml −1 USB #23600-25G) were used as appropriate. L-arabinose (Ara Sigma-Aldrich #A3256-100G) or glucose (Glc BDH #BHD8005-500G) was used as inducer or repressor, respectively.

Strain construction

Genomic knockouts were performed via the λأحمر method using a linear kanamycin-resistant cassette amplified from pKD13 (ref. 65, Supplementary Table 3). Knock-ins of the ∼ 11 kb DNAi actuator plasmids (pACT-01 and -02, Supplementary Fig. 1b) or their fluorescence measurement plasmids (pGFP-01 and pGFP-02, Supplementary Fig. 1c) were achieved by adapting high-efficiency site-specific chromosomal integrations 66 . First, the ستربتوميسيس phage PhiK38−1 attB site 67 (Supplementary Fig. 1a, Supplementary Table 4) was inserted into the host chromosome via the λأحمر method. Next, the linked Kan R marker was removed via pCP20 (ref. 65), and the resulting attB + Kan S host was transformed with a temperature-sensitive plasmid (pInt5ts, Amp R ) expressing the cognate phage integrase Int5 under the control of a Pسيء promoter 67 (Supplementary Fig. 1a). Transformants carrying the integrase plasmid were grown in 2YT containing ampicillin and 1 mM arabinose in a shaking incubator at 30 °C and 250 r.p.m. to an OD600 ∼ 0.5, at which point electrocompetent cells were prepared. The resulting Int5-expressing cells were transformed with an integrative actuator plasmid (pACT-01 or pACT-02, Kan R , non-replicative R6Kγ origin) containing the PhiK38–1 attP site via electroporation and subsequently recovered in 2YT at 37 °C for 3 h. Recombinants were selected for by growth on LB plates containing kanamycin at 37 °C. Successful chromosomal integration at the targeted locus was confirmed with colony PCR, and loss of the temperature-sensitive Int5 expression plasmid was confirmed by Amp S phenotype. For each modified genomic locus, a corresponding donor strain in a wild-type MG1655 background was created. These antibiotic marker-linked loci were then serially transferred to the final recipient host via P1vir viral transductions 68 . Finally, the genomically integrated FRT-flanked R6Kγ origin and kanamycin resistance marker was removed by expression of FLP recombinase following transformation with temperature-sensitive plasmid pCP20 (Amp R , Cm R ) 65 . Loss of the FRT-flanked region and curing of pCP20 was subsequently confirmed by colony PCR and the presence of Kan S , Amp S and Cm S phenotypes. The 1x DNAi device contains the pACT-01 actuator chromosomally integrated at the native CRISPR-cas locus. The 3x DNAi device contains the pACT-01 actuator chromosomally integrated at the LacI locus, and the pACT-02 actuator integrated at the araC-araBAD and CRISPR-cas loci (Supplementary Tables 2 and 3). The 3x GFP strain was constructed identically, except with pGFP-01 or pGFP-02 chromosomally integrated in lieu of pACT-01 or pACT-02, respectively. Each copy of the actuator or GFP plasmid is associated with its own copy of the araC gene, which is under control of either its native Pج promoter (pACT-01) or a constitutive PJ23117 promoter (pACT-02).

Preparation of phagemid virion stock solutions

The viral origin of replication (bp 5,505–5,811) was deleted from M13KO7 69 to create M13Δori (Kan R , p15A), a packaging-defective viral helper plasmid that enables the packaging and secretion of phagemids supplied in عبر but is incapable of infectious self-propagation. MG1655 (F − ) cells were contransformed with M13Δori and either a pPAM-TC (RFP − , Str R ) or a pPAM-NNN (64 PAM library, RFP − , Str R ) target plasmid. Single colonies were selected by growth on kanamycin and spectinomycin, and were used to inoculate 2YT containing the appropriate antibiotics. Samples were grown for 24 h at 37 °C at 250 r.p.m. The cultures were centrifuged at 4,000ز at 4 °C, and the virion-containing supernatant was washed with chloroform, centrifuged again at 4,000ز, and the virion-containing aqueous layer was extracted. High levels of RFP expression from pPAM-NNN-RFP in combination with M13 viral protein expression are lethal to the host, and so these plasmids could not be similarly packaged in this manner.

Plate-based plasmid knockout assay

Host cells containing a DNAi device and an RFP + target plasmid (Str R ) were transformed with a CRISPR targeting plasmid (Cm R ), plated onto LB containing all appropriate antibiotics in addition to 0.5% glucose and grown for 12 h at 37 °C. Single colonies were used to inoculate 2YT (1 ml) containing all appropriate antibiotics and 0.5% glucose, and the resulting liquid cultures were grown in a shaking incubator for 3 h at 37 °C and 250 r.p.m. until OD600=0.25–0.75. Cultures were spun down at 21,000ز, washed once with fresh 2YT (1 ml) and back-diluted to OD600=0.01 into 2YT (2 ml) containing appropriate antibiotics but without selection for the target plasmid (−spectinomycin). The diluted culture was then split into two 1 ml samples, and DNAi activity was either induced by adding 2 mM arabinose or repressed by adding 0.5% glucose. Cultures were then grown in a shaking incubator for 8 h at 37 °C and 250 r.p.m. and periodically sampled. The fraction of host cells retaining the target plasmid (Target + ) was calculated from the ratio of colony forming units obtained from plating onto both target-selective (+spectinomycin) and non-selective (−spectinomycin) LB plates containing all other appropriate antibiotics. In our hands, the plate-based assay was imprecise for measuring samples expected to contain a high fraction (>50%) of target-positive host cells (that is, DNAi OFF or off-target CRISPR samples). A cytometry-based assay was used for precise quantification of these samples (see Cytometry-based plasmid knockout assay (RFP) أدناه).

Cytometry-based plasmid knockout assay

Samples were prepared and induced identically to the plate-based knockout assay described above, except that for sampling, aliquots were back-diluted 1:1,000 into 2YT containing 0.5% Glc and all appropriate antibiotics except spectinomycin, and then outgrown in a shaking incubator at 37 °C and 250 r.p.m. for 8–12 h. This served to arrest further target plasmid loss while allowing for the dilution of accumulated intracellular RFP in the target-negative cells present. Following outgrowth, aliquots were diluted into PBS containing 1 mg ml −1 kanamycin to arrest further growth and protein synthesis and stored at 4 °C. Cells were analysed using a BD Biosciences LSRFortessa. The fraction of cells containing the target plasmid was calculated as fraction of cells with red fluorescence values greater than a 1,000 arbitrary units cut-off. Data were analysed using FlowJo (TreeStar Inc., Ashland, OR), and populations were gated on the basis of forward and side scatter. For all samples, the gated population contained between 10 4 and 10 5 cells.

Plasmid knockout kinetic assay (PAM experiments)

Samples were prepared as for the plate-based knockout assay, except the sample volumes were reduced to 500 μl and all cultures were grown in 96-well format in a shaking incubator at 37 °C and 990 r.p.m. Cultures were sampled and subsequently outgrown as described for the cytometry-based knockout assay. For targets with strong PAM sequences (AAA, AAC, AAG, AAT, AGG, ATG, GAG or TAG), experiments were carried out for 4.5 h with sampling every 10 min beginning at 2 h post induction. For targets with slow (CAG, GGG, GTG, TAA or TAG) or intermediate (ATA or TTG) PAM sequences, experiments were carried out for 8 h with sampling every 15 min starting at 3 h post induction. Following outgrowth, aliquots were diluted into PBS containing 1 mg ml −1 kanamycin to arrest further growth and protein synthesis and stored at 4 °C. Cells were analysed using a BD Biosciences LSRFortessa. Data were analysed using FlowJo (TreeStar Inc., Ashland, OR) and populations were gated on the basis of forward and side scatter. For all samples, the gated population contained between 10 4 and 10 6 cells.

Isolation of target plasmid DNA

Following a plasmid knockout experiment, 500 μl of the resulting culture was collected and spun down at 21,000ز, and the supernatant was removed and discarded. Any resulting pellets were stored at −20 °C until isolation could be performed in parallel. For plasmid knockout samples, plasmid DNA extraction was performed using a miniprep kit (Qiagen) and all samples were normalized to a final volume of 100 μl of EB (Qiagen) for subsequent qPCR analysis. On the basis of experiments in which comparable samples of target-negative cells were doped with known amounts of gel-purified target plasmid (pTAR(S)) and then subjected to analogous DNA extraction techniques, the efficiency of miniprep isolation was estimated at 35±18%.

Isolation of target chromosomal DNA

A 250-μl aliquot of the culture was collected and spun down at 21,000ز, and the supernatant was removed and discarded. Any resulting pellets were stored at −20 °C until isolation could be performed in parallel. Total genomic DNA was extracted using a Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) in accordance with the manufacturer’s protocol, and all the samples were resuspended in a final volume of 100 μl of TE buffer (Promega) for subsequent qPCR analysis. The efficiency of total genomic DNA isolation was calculated to be 14±3.0% by generating qPCR standard curves from known quantities of target DNA and assuming one copy of the genome per c.f.u. and 3 × 10 9 c.f.u. per 250 μl sample.

Quantitative PCR

Quantitative PCR reactions (10 μl total) containing 1 μl of either sample or standard DNA template were prepared from SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX (Bio-Rad) in accordance with the manufacturer’s specifications. The samples were amplified and measured using a Mastercycler RealPlex 2 (Eppendorf) real-time PCR thermocycler. The thermocycling protocol (40 cycles) was as follows: (1) initial denaturation—2:00 at 95 °C (2) melting—0:03 at 95 °C (3) annealing/synthesis: 0:30 at 65 °C. Primers and amplicons are described in Supplementary Table 5, and all primers amplified their targets with 100±5% efficiency. For each amplicon, a series of 5-fold serial dilutions was prepared from a 1 ng μl −1 stock solution of gel-purified target DNA. Each of the eight dilutions spanning 5 −1 to 5 −8 ng μl −1 was then subjected to measurement by qPCR in triplicate, and the resulting Ct values were used to prepare a calibration curve of Ct versus relative copy number (RCN), for which the most dilute solution (5 −8 ng μl −1 ) was arbitrarily designated as RCN=1. When absolute quantification was required, a sample’s RCN value was determined using the calibration curve and subsequently converted to an absolute copy number (ACNsample given in copies per μl sample) value using the formula ACN=RCN × (6.02 × 10 23 copies mol −1 ) × (5 −8 ng μl −1 sample)/M, where M is the molecular weight of the specific dsDNA amplicon (in ng mol −1 , Supplementary Table 5). The isolated DNA samples loaded into the qPCR reactions were more concentrated relative to the initial cultures from which they were obtained, and so ACNsample was then converted to ACNculture (given in copies per ml culture) according to the formula ACNculture=ACNsample × (1,000 μl ml −1 )/C, where C is equal to the initial volume of culture sampled divided by the final volume of the isolated DNA sample. For miniprepped DNA (500 μl culture into 100 μl EB) C=5, and for isolated genomic DNA (250 μl culture into 100 μl TE) C=2.5.

Measuring the impact on cell growth

Strains containing variants of the DNAi devices were co-transformed with both a target plasmid and a corresponding on-target CRISPR plasmid, plated onto LB containing antibiotics in addition to 0.5% glucose, and grown for 12 h at 37 °C. Single colonies were used to inoculate 2YT (1 ml) containing all appropriate antibiotics and 0.5% Glc, and the resulting liquid cultures were grown in a shaking incubator for 3 h at 37 °C and 250 r.p.m. until OD600=0.25–0.75. Cultures were spun down at 21,000ز, washed once with fresh 2YT (1 ml), diluted to OD600=0.01 into 2YT (3 ml) containing kanamycin and/or chloramphenicol as appropriate and then split into 3 × 1 ml samples in a 96-well format. Each sample was induced with Ara (0, 2 or 10 mM) and then grown in a shaking incubator for 8 h at 37 °C and 250 r.p.m. The viable cell titre of each sample was then measured by plating serial dilutions onto non-selective (−spectinomycin) LB plates containing all other appropriate antibiotics.

Evolutionary stability experiments

The strain containing the 3x DNAi device was transformed with the on-target Y+Z dual CRISPR plasmid (pCR-YZ, Cm R ) and a pSC101 target plasmid (pTAR(S), RFP + , Str R ), plated onto LB containing chloramphenicol and spectinomycin in addition to 0.5% Glc, and grown for 12 h at 37 °C. A single colony was used to inoculate 2YT (1 ml) containing chloramphenicol, spectinomycin and 0.5% Glc (‘cell passage media’), and the resulting liquid culture was grown for 3 h in a shaking incubator at 37 °C and 250 r.p.m. until OD600=0.25–0.75. These cells were washed with 2YT (1 ml), and then back-diluted to OD600=10 −5 into fresh cell passage media (1 ml) to mark the start of the experiment (‘day 1’, ر=0). The culture was grown continuously in a shaking incubator at 37 °C and 250 r.p.m. with back-dilution to OD600=10 −5 (75,000- to 100,000-fold) into fresh cell passage media (1 ml) occurring every 12±2 h. In parallel with every fourth such back-dilution (corresponding to a ∼ 48-h period) beginning with the first occurring at ر=0 measurements of DNAi device knockout efficiency and target plasmid stability were performed on a sample removed from the passaged culture in accordance with aforementioned protocols (see both ‘Plasmid knockout assay’ sections above). Continuous culture and periodic measurement of the sample were performed in this manner for a period of 90 days.

Cell death assays

The strain containing the 3x DNAi device was transformed with either an on-target (pCR-G1 or -G2, Cm R ) or an off-target CRISPR targeting plasmid (pCR-N2, Cm R ), plated onto LB containing chloramphenicol in addition to 0.5% Glc, and grown for 12 h at 37 °C. Single colonies were used to inoculate 2YT (1 ml) containing chloramphenicol and 0.5% glucose, and the resulting liquid cultures were grown in a shaking incubator for 3 h at 37 °C and 250 r.p.m. until OD600=0.25–0.75. Cultures were spun down at 21,000ز, washed once with fresh 2YT (1 ml) and back-diluted to OD600=0.01 into 2YT (2 ml) containing chloramphenicol. The diluted culture was then split into two 1-ml samples, and DNAi activity was either induced by adding 2 mM arabinose (DNAi ON) or repressed by adding 0.5% glucose (DNAi OFF). Cultures were then grown in a shaking incubator for 8 h at 37 °C and 250 r.p.m. with periodic removal of samples for analysis. For each sample, the titre of viable cells (in c.f.u. per ml) was then determined by 10-fold serial dilution and subsequent plating onto LB agar containing chloramphenicol. The fraction of viable cells was then calculated as the ratio of the cell titre in the DNAi ON state to that in the DNAi OFF state for a given CRISPR target.


شاهد الفيديو: الحمض النووي- الوعد و الكلفة مترجم للعربية DNA (كانون الثاني 2022).