معلومة

لا توجد نطاقات منتجات مهضومة ، لكن المحددات مرئية. ماذا يمكن أن يكون الأسباب؟

لا توجد نطاقات منتجات مهضومة ، لكن المحددات مرئية. ماذا يمكن أن يكون الأسباب؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

اضطررت إلى هضم الملحق الخاص بي الذي يحتوي على البلازميد وناقل آخر يجب ربط الملحق الخاص بي به ، كل منهما يحتوي على BamHI و NotI.

عند الهضم ، قمت بتشغيل الجل للتحقق من النتائج. بدا أن الهضم كان جيدًا في المرة الأولى مع نطاقات جيدة بشكل معقول. نظرًا لأنني كنت بحاجة إلى مزيد من التركيز ، قمت بتشغيل الجل بنفس إعداد التفاعل (30 ميكرو لتر) للمرة الثانية.

حسنًا 1 - علامة 100 نقطة أساس

البئر 2 - أدخل في متجه (820 نانوغرام / ميكرو لتر ، 3 ميكرو لتر)

حسنًا 3- ناقل البلازميد الذي يجب ربط الملحق به (1000 نانوغرام / ميكرو لتر ، 2 ميكرو لتر)

كانت الأشرطة باهتة بينما لم يكن هناك أي فرق على الإطلاق في الآبار الأخرى. ماذا يمكن أن يكون سبب الفشل أثناء الجولة الثانية؟ لقد أجريت عملية الهضم الثانية في غضون 40 دقيقة بعد الأولى.


عادة لا توجد مشكلة الاختلاط. أحد الأسباب المحتملة هو التدهور. لكنك تقول إن العلامة باهتة (لن تتدهور العلامة). صبغ الجل بمزيد من EtBr وانظر مرة أخرى. إذا أعدت استخدام الجل ، فقم بالتأكيد بتلطيخه مرة أخرى لأن EtBr يهاجر نحو الكاثود.

لا يبدو لي الأمر كأنه تدهور ولكن يجب توخي الحذر في المرة القادمة:

  • استخدم الماء المعقم حديثًا. إذا لم تكن متأكدًا ، فقم بالتصفية باستخدام حقنة واحتفظ ببعض 10 مل لنفسك
  • تأكد من تعقيم الأواني البلاستيكية بشكل صحيح.
  • استخدم إندو - مجموعات استخلاص البلازميد ، إن وجدت
  • قم بإذابة البلازميد في TE (فقط إذا كان التركيز مرتفعًا ولا تحتاج إلى وضع الكثير في خليط التفاعل وإلا يتداخل EDTA في التفاعلات. في هذه الحالة استخدم Tris-Cl pH-7.6).
  • إذا كان عليك هضم الكثير من الحمض النووي ، فقم بإعداد تفاعلات صغيرة في العديد من الأنابيب.
  • لا تحضن التفاعل لفترة طويلة جدًا (> 6 ساعات).
  • قم بتعطيل الإنزيم عن طريق التسخين إذا لم تقم بتشغيل الجل على الفور.
  • تأكد من أن مخازن الجل التي تعمل بالهلام ليست قديمة جدًا.

البلازميدات 101: كيفية التحقق من البلازميد الخاص بك باستخدام تحليل الهضم المقيد

تهانينا ، لديك بلازميد يعبر عن الجين الذي يثير اهتمامك (YGOI) ومستعد للغوص في تجاربك الوظيفية! سواء كنت قد قمت باستنساخ البلازميد بنفسك أو حصلت عليه من زميل في القاعة ، فمن الأفضل دائمًا قضاء بعض الوقت لتأكيد أنك تعمل بالبناء الصحيح ، والتحقق من أن البلازميد الذي تلقيته يطابق التسلسل المتوقع . هنا في Addgene ، نستخدم مراقبة الجودة المستندة إلى NGS لتأكيد تسلسل جميع البلازميدات التي نوزعها. هذه الطريقة تستغرق وقتًا طويلاً ، لذلك نوصي بمجموعة متنوعة من الطرق لفحص البلازميدات والتحقق منها. هنا ، سنغطي تحليل ملخص القيود.


سؤال شائع: لماذا أرى مسحة الحمض النووي على هلام الاغاروز بعد هضم التقييد؟

هناك عدة أسباب محتملة وراء رؤية مسحة الحمض النووي على هلام الاغاروز بعد هضم التقييد. لمناقشة هذا الموضوع يرجى الرجوع إلى الفيديو أعلاه.

يمكن أن تنتج مسحة الحمض النووي على هلام الاغاروز بعد هضم التقييد من واحد أو أكثر مما يلي:
1. نوكلياز التلوث في تفاعل الهضم
2. مشاكل مع تشغيل المخزن المؤقت في هلام مربع أو
3. إنزيم التقييد له علاقة ارتباط عالية بالحمض النووي
قد يأتي مصدر تلوث نوكلياز من تحضير الحمض النووي أو محلول الهضم أو الماء المستخدم في خليط الهضم. مع الضوابط المناسبة ، يمكن فحص كل من هذه المكونات بشكل مستقل بعد الحضانة في درجة حرارة الهضم المحددة.
تشغيل المخازن المؤقتة التي تم الحفاظ عليها في درجة حرارة الغرفة لفترات طويلة من الوقت يمكن أن تنفجر في النهاية وتؤثر سلبًا على الرحلان الكهربي. إذا كان المخزن المؤقت الموجود في صندوق الهلام يبدو غائما وأظهر تشغيل الجل نتائج غير طبيعية ، اشطف علبة الهلام واستخدم جلًا جديدًا قبل تحميل الهضم للحصول على أفضل النتائج.
في حالة الاشتباه في ارتباط الحمض النووي ، فإن إضافة 0.1 - 0.5 ٪ من محلول SDS بعد الهضم سيساعد الإنزيم على الانفصال عن الحمض النووي ويسمح بعرض نمط النطاقات المناسب عند تشغيله على الجل.
يرجى الرجوع إلى إرشادات استخدام إنزيم التقييد أو دليل حل المشكلات المقدم للحصول على معلومات إضافية.


حول الرحلان الكهربائي للهلام والبلازميد:

يمكن أن يوجد DNA البلازميد في ثلاثة أشكال: ملفوف ، دائري مفتوح (oc) ، وخطي (غالبًا ما يشار إلى DNA البلازميد الفائق الالتفاف على أنه DNA دائري مغلق تساهميًا ، ccc).
في الجسم الحي ، DNA البلازميد عبارة عن دائرة شديدة الالتفاف لإحكام وضعها داخل الخلية. في المختبر ، باتباع إعداد دقيق للبلازميد ، سيظل معظم الحمض النووي ملفوفًا بشكل فائق ، لكن كمية معينة ستحافظ على شقوق أحادية الخيط. نظرًا لوجود كسر في واحد فقط من الخيوط ، سيظل الحمض النووي دائريًا ، لكن الكسر سيسمح بالدوران حول العمود الفقري للفوسفودايستر وسيتم إطلاق الملفات الفائقة.
تحافظ عقدة صغيرة ومضغوطة فائقة الالتفاف من ccc-DNA على احتكاك أقل ضد مصفوفة agarose مقارنة بالدائرة المرنة الكبيرة المفتوحة من oc-DNA. لذلك ، بالنسبة للحجم الكلي نفسه ، يعمل الحمض النووي الفائق الالتفاف أسرع من الحمض النووي الدائري المفتوح. يمر الحمض النووي الخطي من خلال نهاية هلامية أولاً ، وبالتالي يحافظ على احتكاك أقل من الحمض النووي الدائري المفتوح ، ولكنه أكثر من ملفوف. وهكذا ، ينتج البلازميد غير المقطوع شريطين على هلام يمثلان مطابقة oc و ccc. ومع ذلك ، إذا تم قطع البلازميد مرة واحدة باستخدام إنزيم تقييد ، يتم تقليل جميع المطابقات فائقة الالتفاف والدائرية المفتوحة إلى شكل خطي.
بعد العزلة ، تتراكم النكات العفوية مع تقدم العمر التحضيري للبلازميد. يمكن رؤية هذا بوضوح على المواد الهلامية حيث تتغير نسبة التطابقين بمرور الوقت: محضرات البلازميدات التي تم إذابتها وإعادة تجميدها عدة مرات ، تُظهر المزيد من الحمض النووي OC أكثر من المحضرات الطازجة.

هذه صورة فوتوغرافية بالأبيض والأسود لجيل الاغاروز المحتوي على بروميد إيثيديوم ، بعد الرحلان الكهربائي لثلاث عينات من الحمض النووي. كان الجل على مصباح الأشعة فوق البنفسجية عند تصويره. كان لونه برتقاليًا ضعيفًا بينما كان لنطاقات الحمض النووي لون برتقالي لامع بسبب الارتباط المحدد لـ EthBr بجزيئات الحمض النووي.
كان الانتقال من أعلى إلى أسفل: كان الأنود (+) في الجانب السفلي من هذا الهلام ، وكان القطب السالب (-) في الأعلى. تهاجر جزيئات الحمض النووي الأصغر بشكل أسرع من الجزيئات الكبيرة ، وتختلف النطاقات في الشدة: الأجزاء الأكبر تربط المزيد من EthBr. هذا جيد جدا مرئي في خط علامة الحجم 1. يتم إنشاء جميع الشظايا في هذا الممر عن طريق هضم حمض نووي معين ، لذلك توجد شظايا في كميات متساوية ويتوافق سطوع العصابات مع أطوالها (المعروفة).
من الواضح أن في الممر 2 توجد شظيتان بكميات غير متساوية (يجب أن يحتوي الشريط العلوي على جزيئات DNA أطول ، ولكنه أقل كثافة من النطاق السفلي ..). في هذه الحالة بالذات ، يرجع السبب في ذلك إلى أنها تمثل شكلين دائريين من نفس الحمض النووي البلازميدي (oc في الأعلى ، و ccc أدناه). تعتمد نسبة كميات الحمض النووي في كلا النطاقين على عمر وجودة تحضير البلازميد.

راجع أيضًا SCLResources و gtLambda DNA للحصول على معلومات حول نمط شريط هلام من Lambda DNA هضم.


توليد سريع لخطوط الطماطم المعقمة للذكور مع استخدام علامة لإنتاج البذور المهجنة بواسطة نظام CRISPR / Cas9

نظرًا لأدائها الزراعي المتفوق ، يتم حاليًا استخدام أنواع هجينة من محاصيل الخضروات على نطاق واسع. ومع ذلك ، يتطلب الإنتاج الهجين الفعال إخصاءً يدويًا شاقًا لضمان نقاء البذور المهجنة في الطماطم بسبب عدم وجود نظام عقم فعال للذكور. هنا ، أنشأنا نوعين من خطوط الطماطم النووية المعقمة للذكور مع علامات فحص مختلفة في نظام متكرر متناوب قصير ومتباعد بانتظام (CRISPR) / CRISPR المرتبط بالبروتين 9 (Cas9). شارك بالضربة القاضية عقيمة الذكور 10 35 (مللي 10 35 ) والجلوتاثيون S- ترانسفيراز (GSTAA) خلق خطًا معقمًا للذكور يتميز بهيبوكوتيل أخضر. ال مللي 10 35 تم إدخال طفرة biallelic في خلفية الطماطم الصوفية ، مما أدى إلى ارتباط عقم الذكور والنمط الظاهري غير الصوفية. تم اختيار نوعين من السلالات المعقمة للذكور بسهولة في مرحلة الشتلات عن طريق لون hypocotyl أو كثافة trichome وأظهروا أيضًا نقاء عالي للبذور أثناء إنتاج البذور المهجنة. أنشأ عملنا الإجراء الخاص بالنقل السريع للنمط الظاهري للذكور العقيمة إلى والدي الهجينة دون تعديل إضافي بواسطة نظام CRISPR / Cas9 الذي يمكن تطبيقه عمليًا على إنتاج البذور المهجنة في الطماطم. ستكون هذه الطريقة هي الأساس والمثال للإنشاء الوالد المعقم لمحاصيل متعددة للإنتاج الهجين باستخدام نظام CRISPR / Cas9.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


لماذا أرى عصابة (مجموعات) DNA ملطخة أو مبتسمة أو هجرة متناقضة للحمض النووي؟

يستخدم العديد من العملاء جل GelRed® أو GelGreen® للراحة. ومع ذلك ، نظرًا لأن GelRed® و GelGreen® أصباغ عالية التقارب مصممة لتكون صبغات أكبر لتحسين سلامتها ، فإنها يمكن أن تؤثر على انتقال الحمض النووي في المواد الهلامية الجاهزة. قد تنتقل بعض العينات ، مثل الحمض النووي المقيد الهضم بشكل غير طبيعي في GelRed® أو GelGreen® المواد الهلامية الجاهزة.

النصيحة رقم 1: حمل كمية أقل من الحمض النووي

غالبًا ما يحدث التلطيخ والابتسام في هلام ®GelRed أو GelGreen® الجاهز بسبب الحمل الزائد للحمض النووي. إذا رأيت تحولات هجرة النطاق أو تلطيخًا وابتسامًا ، فحاول تقليل كمية الحمض النووي المحملة. كمية التحميل الموصى بها للسلالم والعينات ذات التركيز المعروف هي 50-200 نانوغرام / ممر. بالنسبة للعينات ذات التركيز غير المعروف ، حاول تحميل نصف أو ثلث الكمية المعتادة من الحمض النووي. هذا عادة ما يحل مشاكل ترحيل النطاق.

نصيحة رقم 2: جرب بروتوكول ما بعد التلوين

لتجنب أي تدخل قد يكون للصبغة على هجرة الحمض النووي ، نوصي باستخدام بروتوكول ما بعد التلوين. إذا كان تطبيقك يتطلب تحميل أكثر من الكمية الموصى بها من الحمض النووي ، فاستخدم بروتوكول ما بعد التلوين. بينما نوصي باستخدام المواد الهلامية بعد التلوين لمدة 30 دقيقة ، قد تتمكن من رؤية العصابات في أقل من خمس دقائق ، اعتمادًا على كمية الحمض النووي الموجودة. يمكن إعادة استخدام حلول ما بعد التلوين. راجع ورقة معلومات منتج GelRed® أو ورقة معلومات منتج GelGreen® للحصول على بروتوكولات مفصلة.


كتاب الأسلوب

الاغاروز الكهربائي للهلام هو الطريقة الأسهل والأكثر شيوعًا لفصل وتحليل الحمض النووي. قد يكون الغرض من الجل هو النظر إلى الحمض النووي ، لتحديد كميته أو عزل شريط معين. يتم تصوير الحمض النووي في الجل عن طريق إضافة بروميد إيثيديوم ، وهو مطفر أو أصباغ مملوكة ملكية أقل سمية مثل GelRed و GelGreen و SYBR Safe. يرتبط بروميد الإيثيديوم والأصباغ المسجلة الملكية بالحمض النووي وهي فلورية ، مما يعني أنها تمتص ضوء الأشعة فوق البنفسجية غير المرئي وتنقل الطاقة كضوء مرئي.

ما نسبة الجل؟

معظم المواد الهلامية الاغاروز مصنوعة بين 0.7٪ و 2٪. سيظهر هلام 0.7٪ فصلًا جيدًا (دقة) لشظايا الحمض النووي الكبيرة (5 & # 821110 كيلو بايت) وسيظهر هلام 2٪ دقة جيدة للأجزاء الصغيرة (0.2 & # 82111 كيلو بايت). يرتفع بعض الأشخاص بنسبة تصل إلى 3٪ لفصل الأجزاء الصغيرة جدًا ولكن هلام بولي أكريلاميد العمودي يكون أكثر ملاءمة في هذه الحالة. المواد الهلامية منخفضة النسبة ضعيفة جدًا وقد تنكسر عند محاولة رفعها. غالبًا ما تكون المواد الهلامية ذات النسبة العالية هشة ولا يتم تثبيتها بالتساوي. أنا عادة أصنع 1٪ من المواد الهلامية.

أي خزان جل؟

المواد الهلامية الصغيرة مقاس 8x10 سم (minigels) تحظى بشعبية كبيرة وتعطي صورًا جيدة. تستخدم المواد الهلامية الكبيرة في تطبيقات مثل النشاف الجنوبي والشمالي. حجم الاغاروز المطلوب للمينيجل حوالي 30 & # 821150 مل ، للهلام الأكبر قد يكون 250 مل. تفترض هذه الطريقة أنك تصنع هلامًا صغيرًا.

كم يجب تحميل الحمض النووي؟

السؤال الكبير. ربما تقوم بإعداد هلام تحليلي لمجرد إلقاء نظرة على الحمض النووي الخاص بك. بدلاً من ذلك ، قد تقوم بإعداد هلام تحضيري لفصل جزء من الحمض النووي قبل قطعه من الجل لمزيد من العلاج. في كلتا الحالتين ، تريد أن تكون قادرًا على رؤية عصابات الحمض النووي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في هلام ملطخ بالإيثيديوم بروميد. عادةً ما يكون الشريط مرئيًا بسهولة إذا كان يحتوي على حوالي 20 نانوغرام من الحمض النووي.

الآن فكر في مثال. افترض أنك تهضم بلازميدًا يتكون من 3 كيلو بايت من المتجه و 2 كيلو بايت من الإدخال. أنت تستخدم EcoRI (إنزيم تقييد شائع) وتتوقع أن ترى ثلاثة نطاقات: المتجه الخطي (3 كيلو بايت) ، ونهاية الإدخال 5 بوصة (0.5 كيلو بايت) ونهاية الإدخال (1.5 كيلو بايت). لكي ترى أصغر نطاق (0.5 كيلو بايت) ، فأنت تريد أن تحتوي على 20 نانوغرام على الأقل من الحمض النووي. أصغر نطاق هو 1/10 من حجم البلازميد غير المقطوع. لذلك تحتاج إلى قطع 10x20 نانوغرام ، أي 200 نانوغرام من الحمض النووي (0.2 & # 181 جم). ثم ستحتوي نطاقاتك الثلاثة على 120 نانوغرام و 20 نانوغرام و 60 نانوغرام من الحمض النووي على التوالي. ستكون الأشرطة الثلاثة مرئية بوضوح على الجل وستكون الفرقة الأكبر ست مرات أكثر سطوعًا من أصغر فرقة.

تخيل الآن قطع البلازميد نفسه باستخدام BamHI (إنزيم تقييد شائع آخر) وأن BamHI يقطع البلازميد مرة واحدة فقط ، ليخطوه. إذا هضمت 200 نانوغرام من الحمض النووي في هذه الحالة ، فستحتوي الحزمة على 200 نانوغرام من الحمض النووي وستكون مشرقة جدًا.

الكثير من الحمض النووي تحميلها على مادة هلامية شيء سيء. يبدو أن الفرقة تعمل بسرعة (مما يعني أنها أصغر مما هي عليه بالفعل) وفي الحالات القصوى يمكن أن تفسد المجال الكهربائي للنطاقات الأخرى ، مما يجعلها تظهر بالحجم الخطأ أيضًا.

القليل من الحمض النووي هي فقط مشكلة من حيث أنك لن تكون قادرًا على رؤية أصغر الفرق الموسيقية لأنها باهتة جدًا.

بعد قولي هذا كله ، فإن المواد الهلامية للحمض النووي متسامحة ، وستعطي مجموعة واسعة من أحمال الحمض النووي نتائج مقبولة. عادةً ما أستوعب وتحميل 2 & # 82114 & # 181L من 50 & # 181L التي تم الحصول عليها من مجموعة miniprep. بالنسبة لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يعتمد ذلك على تفاعل البوليميراز المتسلسل ولكن في التطبيقات الروتينية يجب أن يكون 10 & # 821120 & # 181L كثير لرؤية المنتج على الجل.

أي مشط؟

هذا يعتمد على حجم الحمض النووي الذي تقوم بتحميله وعدد العينات. الأمشاط التي تحتوي على العديد من الأسنان الصغيرة قد تحمل 10 & # 181 لتر. هذا ليس جيدًا إذا كنت تريد تحميل 20 & # 181L من ملخص التقييد بالإضافة إلى 5 & # 181L من مخزن التحميل المؤقت. عند تحديد ما إذا كان المشط يحتوي على أسنان كافية ، تذكر أنك بحاجة إلى تحميل ممر واحد على الأقل ، ويفضل أن يكون اثنان.

صنع الجل (جل 1٪ ، حجم 50 مل)

تزن 0.5 جرام من الاغاروز في دورق مخروطي سعة 250 مل. إضافة 50 مل 0.5xTBE ، دوامة للخلط.

من الجيد استخدام وعاء كبير ، طالما أنه يناسب الميكروويف ، لأن الاغاروز يغلي بسهولة.

الميكروويف لحوالي 1 دقيقة لإذابة الاغاروز.

يمكن أن يغلي محلول الاغاروز بسهولة شديدة لذا استمر في فحصه. من الجيد إيقافه بعد 45 ثانية وإعطائه دوامة. يمكن أن تصبح شديدة السخونة ولا تغلي حتى تخرجها ثم تغلي على يديك. وبالتالي ارتداء القفازات وامسكها بطول الذراعين. يمكنك استخدام موقد بنسن بدلاً من الميكروويف - فقط تذكر أن تستمر في مشاهدته.

اتركه ليبرد على المقعد لمدة 5 دقائق إلى حوالي 60 درجة مئوية (فقط حار جدًا بحيث لا يمكن الإمساك به بأيدي عارية).

إذا اضطررت إلى غليها لفترة طويلة لإذابة الاغاروز ، فربما تكون قد فقدت بعض الماء في بخار الماء. يمكنك وزن الدورق قبل وبعد التسخين وإضافة القليل من الماء المقطر لتعويض هذا الحجم المفقود. أثناء تبريد الاغاروز ، قم بإعداد خزان الجل جاهزًا ، على سطح مستو.

أضف 1 & # 181 لتر من بروميد الإيثيديوم (10 مجم / مل) وقم بخلط المكونات

السبب في السماح للأغاروز بالتبريد قليلاً قبل هذه الخطوة هو تقليل إنتاج بخار بروميد الإيثيديوم. إيثيديوم بروميد هو مطفر ويجب التعامل معها بحذر شديد. تخلص من الطرف الملوث في حاوية نفايات بروميد الإيثيديوم المخصصة. يتكون محلول بروميد الإيثيديوم 10 & nbspmg / mL باستخدام أقراص (لتجنب وزن المسحوق) ويتم تخزينه في 4 & # 176 درجة مئوية في الظلام مع ملصقات TOXIC عليه.

هناك بدائل لاستخدام بروميد الإيثيديوم السام والمسبب للطفرات:

صب الجل ببطء في الخزان. ادفع أي فقاعات بعيدًا إلى الجانب باستخدام طرف يمكن التخلص منه. أدخل المشط وتأكد من وضعه بشكل صحيح.

فائدة السكب البطيء هي أن معظم الفقاعات تبقى في القارورة. اشطف القارورة على الفور.

اتركيه لمدة 30 دقيقة على الأقل ، ويفضل ساعة واحدة ، مع الغطاء إذا أمكن.

قد يبدو الجل مضبوطًا في وقت أقرب بكثير ، لكن تشغيل الحمض النووي في مادة هلامية في وقت قريب جدًا يمكن أن يعطي نتائج رهيبة مع عصابات منتشرة ملطخة.

صب 0.5x TBE عازلة في خزان الجل لغمر الجل حتى 2 & # 82115 ملم عمق. هذا هو المخزن المؤقت قيد التشغيل.

يجب عليك استخدام نفس المخزن المؤقت في هذه المرحلة الذي استخدمته لصنع الجل. بمعنى آخر. إذا كنت تستخدم 0.6xTBE في الجل ، فاستخدم 0.6xTBE لمخزن التشغيل. تذكر إزالة مُشكِّلات الهلام المعدنية إذا كان خزان الجل يستخدمها.

تجهيز العينات

نقل كمية مناسبة من كل عينة إلى أنبوب microfuge جديد.

قد يكون 10 & # 181L من تفاعل 50 & # 181L PCR أو 5 & # 181L من 20 & # 181L هضم إنزيم مقيد. إذا كنت تقوم بتحميل 20 & # 181L بالكامل من تفاعل 20 & # 181L PCR أو هضم الإنزيم (كما أفعل غالبًا) ، فلا داعي لاستخدام أنابيب جديدة ، ما عليك سوى إضافة مخزن التحميل المؤقت في أنابيب PCR. اكتب في كتابك المختبر الترتيب المادي للأنابيب حتى تتمكن من تحديد الممرات على صورة الهلام.

أضف كمية مناسبة من المخزن المؤقت للتحميل في كل أنبوب واترك الطرف في الأنبوب.

أضف 0.2 حجمًا من المخزن المؤقت للتحميل ، على سبيل المثال. 2 & # 181L في عينة 10 & # 181L. سيتم استخدام الحافة مرة أخرى لتحميل الجل.

أقوم بتخزين علاماتي جاهزة ممزوجة مع مخزن التحميل المؤقت في 4 & # 176 درجة مئوية. أعلم أنه يجب تحميل 2 & # 181L ومقدار الحمض النووي في كل فرقة. انظر أدناه لمزيد من المعلومات حول هذا.
تجنب استخدام الآبار النهائية إذا أمكن. على سبيل المثال ، إذا كان لديك 12 عينة و 2 محددات ، فستستخدم 14 ممرًا في المجموع. إذا كان المشط الخاص بك قد شكل 18 بئراً فلن تستخدم 4 آبار. من الأفضل عدم استخدام الآبار الخارجية لأنها من المرجح أن تعمل بشكل منحرف.

استمر في تحميل العينات والانتهاء من الممر النهائي للعلامة

أقوم بتحميل المواد الهلامية من اليمين إلى اليسار مع توجيه الهلام بحيث تكون الآبار قريبة من حافة المقعد ، وسوف ينتقل الحمض النووي بعيدًا عن حافة المقعد. هذا بسبب نشر المواد الهلامية ، عن طريق الاصطلاح ، كما لو كانت الآبار في الأعلى والحمض النووي يجري في الصفحة.

أغلق خزان الجل ، وقم بتشغيل مصدر الطاقة وتشغيل الجل عند 5 فولت / سم.

على سبيل المثال ، إذا كانت المسافة بين الأقطاب الكهربائية 10 سم ، فقم بتشغيل الجل عند 50 فولت. ومن الجيد تشغيل الجل بشكل أبطأ من ذلك ولكن لا يتم تشغيله بشكل أسرع. أعلى من 5 فولت / سم قد يسخن الاغاروز ويبدأ في الذوبان مع آثار كارثية على دقة هلام الخاص بك. يقوم بعض الأشخاص بتشغيل الجل ببطء في البداية (على سبيل المثال. 2 فولت / سم لمدة 10 دقائق) للسماح للحمض النووي بالانتقال إلى الجل ببطء وبشكل متساوٍ ، ثم تسريع الهلام لاحقًا. هذا قد يعطي دقة أفضل. لا بأس من تشغيل المواد الهلامية طوال الليل بجهد منخفض للغاية ، على سبيل المثال. 0.25 & # 82110.5 فولت / سم ، إذا كنت تريد العودة إلى المنزل في الساعة 11 بالفعل.

تحقق من تدفق التيار

يمكنك التحقق من ذلك على مصدر الطاقة ، يجب أن تكون المللي أمبير في نفس موقف الكرة مثل الجهد ، ولكن أفضل طريقة هي النظر إلى الأقطاب الكهربائية والتحقق من أنها غازات متطورة (مثل الفقاعات). إذا لم يكن كذلك ، فتحقق من التوصيلات ، وأن مصدر الطاقة متصل بالتيار الكهربائي وما إلى ذلك ، إلخ. من المعروف أن هذا يحدث إذا استخدم الناس الماء بدلاً من تشغيل العازلة.

مراقبة تقدم الجل بالرجوع إلى صبغة العلامة.

أوقف الهلام عندما يعمل أزرق البروموفينول بمقدار 3/4 طول الهلام.

أوقف تشغيل خزان الجل وافصله عن التيار الكهربائي واحمل الجل (في حامله إن أمكن) إلى الغرفة المظلمة للنظر إليه على صندوق ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

بعض حوامل الهلام ليست شفافة للأشعة فوق البنفسجية ، لذا عليك وضع الجل بعناية على السطح الزجاجي للصندوق الضوئي. الأشعة فوق البنفسجية هي مسرطنة ويجب عدم تركه يلمع على الجلد أو العينين العاريتين. لذا ارتدِ واقيًا للوجه وقفازات وأكمام طويلة.

يعطي مخزن التحميل اللون والكثافة للعينة لتسهيل تحميلها في الآبار. أيضًا ، يتم شحن الأصباغ سلبًا في محاليل محايدة وبالتالي تتحرك في نفس اتجاه الحمض النووي أثناء الرحلان الكهربائي. هذا يسمح لك بمراقبة تقدم الجل. أكثر الأصباغ شيوعًا هي البروموفينول الأزرق (سيجما B8026) والزيلين سيانول (سيجما X4126). يتم توفير الكثافة بواسطة الجلسرين أو السكروز.

الكمية الدقيقة للصبغة ليست مهمة
يُخزن في 4 & # 176 درجة مئوية لتجنب نمو العفن في السكروز. 10 مل من المخزن المؤقت للتحميل سوف يستمر لسنوات.

يهاجر البروموفينول الأزرق بمعدل يعادل 200 & # 8211400 bp DNA. إذا كنت تريد رؤية شظايا في أي مكان بالقرب من هذا الحجم ، فاستخدم الصبغة الأخرى لأن أزرق البروموفينول سيحجب رؤية الأجزاء الصغيرة. يهاجر زيلين سيانول بتكافؤ 4 كيلو بايت تقريبًا. لذلك لا تستخدم هذا إذا كنت تريد تصور أجزاء من 4 كيلو بايت.

هناك العديد من الأنواع المختلفة لعلامات حجم الحمض النووي. في الأيام الخوالي ، كان أرخص الحمض النووي المحدد من العاثيات ، لذا فإن الكثير من الواسمات كانت عبارة عن دنا الملتهمة المقطوعة بواسطة إنزيمات تقييدية. العديد من هذه لا تزال تحظى بشعبية كبيرة ، على سبيل المثال ، lambda HindIII ، lambda PstI ، PhiX174 HaeIII. هذه تعطي نطاقات بأحجام معروفة ولكن الأحجام عشوائية. اختر علامة بدقة جيدة لحجم الجزء الذي تتوقع رؤيته في عينة الممرات. على سبيل المثال ، بالنسبة لمنتجات PCR الصغيرة ، قد تختار PhiX174 HaeIII ولكن بالنسبة لشظايا 6 كيلوبايت ، يمكنك اختيار lambda HindIII. في الآونة الأخيرة ، بدأت الشركات في إنتاج علامات سلم ذات نطاقات على فترات زمنية محددة ، على سبيل المثال. 0.5 ، 1 ، 1.5 ، 2 ، 2.5 كيلو بايت وما إلى ذلك حتى 10 كيلو بايت. إذا كنت تعرف الكمية الإجمالية للحمض النووي الذي تم تحميله في ممر محدد ، وتعرف أحجام جميع النطاقات ، يمكنك حساب كمية الحمض النووي في كل شريط مرئي على الجل. يمكن أن يكون هذا مفيدًا جدًا في تحديد كمية الحمض النووي في نطاقات العينة الخاصة بك بالمقارنة مع نطاقات العلامة. من الجيد تحميل مسارين للعلامات ، يحيطان بالعينات. تبيع الكثير من الشركات علامات حجم الحمض النووي. من المفيد التسوق للحصول على أرخص. غالبًا ما تبيع شركة التكنولوجيا الحيوية المحلية لأحواض المطبخ علامات ممتازة.

يرمز TBE إلى Tris Borate EDTA.

يستخدم الناس أيضًا TAE (Tris Acetate EDTA). اصنع مخزونًا من 10 أضعاف باستخدام كواشف رخيصة. لا تستخدم كواشف "من الدرجة التحليلية" باهظة الثمن. يمكن شراء قاعدة تريس وحمض البوريك بكميات كبيرة.

قم بإذابة المكونات في 1.9 لتر من الماء المقطر. يصل الرقم الهيدروجيني إلى حوالي 8.3 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم ويصل إلى 2 لتر.


المقدمة

يتم استنساخ الحمض النووي تقليديًا عن طريق هضم مصدر البلازميد أو جزء الحمض النووي وناقل متلقي مع إنزيمات تقييدية ، واستخراج الأجزاء المهضومة من مادة هلامية ، وربط الأجزاء المنقاة باستخدام ليجاز الحمض النووي (انظر البروتوكولات الحالية مقالة Struhl ، 1991). هذا النهج مناسب لربط جزء أو جزأين من الحمض النووي في ناقل ، لكنه لا يعمل بشكل جيد لربط أجزاء متعددة في متجه في خطوة واحدة. لحسن الحظ ، تتوفر طرق استنساخ جديدة تسمح بتجميع عدة شظايا في متجه في خطوة واحدة ، بما في ذلك طرق الاستنساخ القائمة على التماثل (على سبيل المثال ، تجميع Gibson) والطرق التي تعتمد على نوع إنزيمات تقييد IIS ، مثل استنساخ Golden Gate (المسمى في إشارة إلى استنساخ البوابة ، ولكن أيضًا كلعب مع اسم الجسر). يتم تنفيذ Golden Gate باستخدام تفاعل تقييد-ربط في دورة حرارية. يتم وصف معلمات إعداد وتنفيذ تفاعل تجميع Golden Gate القياسي في البروتوكول الأساسي 1 والموضحة في الشكل 1. يتطلب استنساخ Golden Gate أن يكون للمتجه والإدخالات بنية محددة فيما يتعلق بوجود أو عدم وجود مواقع تقييد محددة. يتم توفير طريقة لتحويل متجه الاستنساخ العادي إلى متجه استنساخ متوافق مع Golden Gate في البروتوكول الأساسي 2. يتم توفير مثال لاستيعاب إدخال لاستنساخ Golden Gate في البروتوكول الأساسي 3 ، والذي يشرح كيفية تصميم الاشعال للتضخيم والاستنساخ لجين مهم في ناقل Golden Gate.

إن إنشاء وحدات نسخ محددة والتجميع اللاحق لوحدات النسخ في بنى متعددة الجينات باستخدام طرق الاستنساخ التقليدية ليست مهمة بسيطة. هذا لا يرجع فقط إلى تجميع الحمض النووي نفسه ، ولكن أيضًا بسبب صعوبة تصميم استراتيجيات الاستنساخ للتركيبات الكبيرة. أحد أسباب هذا القيد هو أن مواقع التعرف على إنزيمات التقييد المستخدمة في كل خطوة من خطوات الاستنساخ لا تزال موجودة عادة في التركيبات بعد الربط. لذلك ، يجب استخدام إنزيمات تقييد مختلفة لكل خطوة متتالية ، مما يجعل تخطيط استراتيجية الاستنساخ صعبًا للغاية أو مستحيلًا عند العمل مع عدد كبير من الجينات. يتم توفير حل لهذه المشكلة من خلال توحيد الأجزاء واستراتيجية التجميع ، جنبًا إلى جنب مع استخدام استنساخ Golden Gate لتجميع الحمض النووي في كل خطوة من خطوات الاستنساخ. يتم استخدام هذه الإستراتيجية بواسطة نظام الاستنساخ المعياري MoClo (Engler et al.، 2014 Weber، Engler، Gruetzner، Werner، & Marillonnet، 2011 Werner، Engler، Weber، Gruetzner، & Marillonnet، 2012). يعتمد نظام MoClo على استخدام الأجزاء القياسية التي يتم تصنيعها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والمستنسخة في العمود الفقري المتجه ، والمتسلسلة. تحتوي الأجزاء القياسية على تسلسل الحمض النووي لعنصر وراثي أساسي ، مثل المحفز أو تسلسل الترميز أو المنهي. يوفر البروتوكول الأساسي 4 طريقة لاستنساخ أجزاء من منتجات PCR في خطوة واحدة (الشكل 1) ، ويوفر البروتوكول البديل طريقة لاستنساخ الأجزاء الأكبر في خطوتين متتاليتين. يسمح الهيكل القياسي للأجزاء بإعادة استخدامها في العديد من التركيبات المختلفة دون الحاجة إلى تضخيم PCR. كما يسمح بتوحيد إجراءات التجميع. يتم تجميع التركيبات متعددة الجينات من الأجزاء الأساسية باستخدام سلسلة من خطوات التجميع في وعاء واحد. تم وصف استراتيجية الاستنساخ وخطوات الاستنساخ المختلفة المستخدمة مع نظام MoClo في البروتوكول الأساسي 5.

1: أداء رد فعل نموذجي لاستنساخ البوابة الذهبية

يتكون مبدأ استنساخ Golden Gate من استخدام إنزيم تقييد IIS من النوع و ligase في ربط تقييد لتجميع العديد من أجزاء الحمض النووي بترتيب خطي محدد في متجه في خطوة واحدة (الشكل 2 أ). اكتب إنزيمات تقييد IIS تشق الحمض النووي خارج تسلسل موقع التعرف على الحمض النووي. على سبيل المثال ، موقع التقييد الخاص بـ بسأنا (GGTCTC N ↓ N1ن2ن3ن4) يتكون من تسلسل موقع التعرف على الحمض النووي (GGTCTC) وموقع انشقاق الحمض النووي (↓) مما يؤدي إلى تراكم الحمض النووي أحادي الجديلة 4 نانومتر (N1ن2ن3ن4) بعد الهضم. لكي تكون مناسبة لاستنساخ Golden Gate ، يجب أن تكون جميع أجزاء الحمض النووي محاطة بمواقع تقييد لأنزيم تقييد IIS من النوع ، مع اتجاه داخلي بحيث يتم قطع تسلسل موقع التعرف على الحمض النووي من شظايا الحمض النووي أثناء خطوة الهضم (الشكل 2 ب) . يجب أن يحتوي ناقل الوجهة أيضًا على موقعي تقييد لنفس النوع من إنزيم IIS ، ولكن مع اتجاه خارجي بحيث يتم أيضًا شق مواقع التعرف على الحمض النووي من المتجه بخطوة الهضم. أخيرًا ، يجب أن تكون جميع المتراكبات أحادية الجديلة 4-nt (وتسمى أيضًا مواقع الاندماج) في نهايات شظايا الحمض النووي والمتجه فريدة ومكملة للسماح بالتصلب حتى نهاية الجزء التالي أو المتجه. نظرًا لأن جزيء الحمض النووي المؤتلف الدائري المتوقع لا يحتوي على مواقع تقييد للإنزيم المستخدم ، فلا يمكن إعادة هضمه ، مما يسمح بإجراء التقييد والربط في نفس مزيج التفاعل. يسمح هذا لشظايا الحمض النووي التي تم ربطها مرة أخرى في العمود الفقري البلازميد الأولي الخاص بها بالخضوع لمزيد من دورات الهضم والربط حتى يتم دمجها أخيرًا في المنتج المؤتلف المطلوب (الشكل 2 ج). هذا مفيد لنقل جزء من ناقل إلى التالي ، ولكنه يزداد أهمية عند الحاجة إلى استنساخ عدة أجزاء في خطوة واحدة. وذلك لأن عدد أحداث الربط المحتملة يزيد بشكل كبير مع عدد البلازميدات في مزيج الربط ، في حين أن فرصة الحصول على منتج مرتبط بشكل صحيح في خطوة واحدة تصبح غير محتملة بشكل متزايد (الشكل 2 د). يؤدي ربط التقييد إلى كفاءة استنساخ عالية ويسمح بربط ما يصل إلى 24 شظية في تفاعل استنساخ واحد (Potapov et al. ، 2018).

يمكن أن تكون أجزاء الحمض النووي المستخدمة شظايا خطية تم الحصول عليها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ولكن يمكن أيضًا أن تكون متواليات مستنسخة في بلازميد دائري. يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تفاعل استنساخ Golden Gate عندما يتوفر كل من أجزاء الحمض النووي وناقل الوجهة كبلازميدات.

المواد

  • تنقية DNA البلازميد:
    • متجه وجهة البوابة الذهبية (انظر البروتوكول الأساسي 2 أو متاح من Addgene أو باحثين آخرين)
    • إدراج (DNA البلازميد)
    • 10 يو / ميكرولتر بسأنا (نيو إنجلاند بيولابس ، القط رقم R0535L)
    • 10 يو / ميكرولتر بي بي آيأنا (Thermo Fisher Scientific، cat. no. ER1012)
    • 10 يو / ميكرولتر بي إس إمBI (نيو إنجلاند بيولابس ، القط رقم R0580s)
    • مقياس الطيف الضوئي (على سبيل المثال ، Nanodrop 1000 ، Peqlab)
    • 0.2 مل من ألواح PCR (Thermo Fisher Scientific ، القط رقم AB0600)
    • أختام لوحة PCR اللاصقة (Thermo Fisher Scientific ، رقم القط AB0588)
    • جهاز التدوير الحراري (على سبيل المثال ، C1000 Touch ، BioRad)
    • أنابيب ميكروسينتريفوج 1.5 مل
    • حاضنة بلوك 37 درجة و 42 درجة مئوية (على سبيل المثال ، Eppendorf ThermoMixer)
    • حاضنة 37 درجة مئوية وحاضنة شاكر
    • قوارير أو أنابيب الثقافة
    • برنامج تحليل الحمض النووي (على سبيل المثال ، Vector NTI ، Thermo Fisher Scientific)

    ملاحظة: اكتب إنزيمات IIS التي تولد تراكمًا ثلاثي الأبعاد عند الانقسام ، مثل إلغويمكن أيضًا استخدام I (Thermo Fisher Scientific ، القط رقم ER1931).

    أداء ربط التقييد

    1. قم بقياس تركيز الحمض النووي للبلازميدات الداخلة والمتجهة باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

    2. أضف كميات متساوية من كل إدخال وناقل إلى خليط التفاعل. استخدم 20 fmol من كل بلازميد في حجم تفاعل إجمالي 15 أو 25 ميكرولتر على النحو التالي:

    • x1 µl ناقلات الحمض النووي
    • x2 إدراج 1
    • x3 إدراج 2
    • x4 إدراج 3
    • 1.0 ميكرولتر T4 DNA ligase
    • 0.5 ميكرولتر من نوع إنزيم IIS
    • 1.5 ميكرولتر 10 × عازلة ربط
    • ح2O إلى 15 ميكرولتر
    • x1 ناقلات µl
    • x2 إدراج 1
    • x3 إدراج 2
    • … …
    • xن إدراج µl ن
    • 1.5 ميكرولتر T4 DNA ligase
    • 1.0 ميكرولتر نوع انزيم IIS
    • 2.5 ميكرولتر 10 × عازلة ربط
    • ح2O إلى 25 ميكرولتر

    يتم حساب حجم كل بلازميد DNA بالصيغة: 20 (fmol) × الحجم (bp) / التركيز (ng / l) / 1520. إذا كان الحجم المحسوب منخفضًا جدًا لسحب الأنابيب الدقيقة (& lt0.3 ميكرولتر) ، فيجب تخفيف البلازميد 10 أضعاف في الماء ، ويجب إضافة حجم أكبر 10 أضعاف من هذا التخفيف.

    3. احتضان المزيج في دائري حراري بالشروط التالية:

    • 50 دورة: 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، 16 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
    • 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
    • 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق
    • 16 درجة مئوية

    عند استخدام BsaI ، يتم تنفيذ خطوة الهضم النهائية التي تبلغ مدتها 5 دقائق عند 50 درجة مئوية ، حيث يمكن لـ BsaI الهضم عند 37 درجة مئوية و 50 درجة مئوية. في المقابل ، عند استخدام BpiI ، لا تزال خطوة الهضم النهائية تتم عند 37 درجة مئوية ، حيث أن هذه هي درجة حرارة الهضم المثلى لهذا الإنزيم.

    تحويل المنتج إلى الإشريكية القولونية

    4. يضاف مزيج الربط الكامل (15 أو 25 ميكرولتر) إلى 50 ميكرولتر المختص بكتريا قولونية الخلايا واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة.

    5. صدمة الحرارة عند 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. دع الخلايا تتعافى على الجليد لمدة دقيقتين.

    6. إضافة 500 ميكرولتر LB أو SOC المتوسطة واهتز الخلايا لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية في ThermoMixer.

    7. لوحة على لوحات LB تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة و X-gal. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

    لاستنساخ ردود الفعل مع واحد إلى ثلاثة إدراج ، لوحة 10-20 ميكرولتر. صفيحة ذات أحجام أكبر لزيادة عدد الإضافات ، لأن عدد المستعمرات التي تم الحصول عليها سيكون أقل. على سبيل المثال ، لوحة 50 ميكرولتر أو أكثر للتركيبات المكونة من أكثر من ثلاث أجزاء.

    اختر المستعمرات وقيّم الحيوانات المستنسخة

    8. اختيار المستعمرات الفردية وتلقيح 5 مل LB وسط. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة شاكر.

    عادةً ما تحتوي نواقل استنساخ Golden Gate على جزء LacZ للفحص الأزرق والأبيض (يتم استخدام عامل التخليق الحيوي الكاروتينوي أحيانًا كعلامة للفحص باللونين الأحمر والأبيض). يتم انتقاء المستعمرات البيضاء. بالنسبة لتفاعلات الاستنساخ التي لا تتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحضير الأجزاء ، يكون انتقاء مستعمرتين كافياً بشكل عام. بالنسبة لتفاعلات الاستنساخ التي يتم إجراؤها من الأجزاء التي تم تضخيمها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قد تكون هناك حاجة إلى أكثر من نسختين للعثور على واحد لا يحتوي على أي طفرات يسببها تفاعل البوليميراز المتسلسل.

    9. تحضير الحمض النووي باستخدام مجموعة miniprep ، التصفية بحجم 50 ميكرولتر.

    10. هضم 1 ميكرولتر في تفاعل 10 ميكرولتر باستخدام إنزيم مناسب (غالبًا بسأنا أو بي بي آيعند استخدام نظام MoClo ، انظر البروتوكول الأساسي 4) لتأكيد التجميع الصحيح عن طريق بصمة الحمض النووي.

    11. إذا تم استخدام تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحضير شظايا الحمض النووي ، فقم بتسلسل البلازميد.

    2: استيعاب متجه لاستنساخ البوابة الذهبية

    يتطلب استنساخ Golden Gate أن تتوافق شظايا الحمض النووي وناقل المستلم مع متطلبات محددة ، مثل وجود مواقع تقييد إنزيم من النوع IIS في نهايات الشظايا والمتجه ، وعدم وجود مواقع التقييد نفسها في التسلسلات الداخلية للشظايا و المتجه. تتوفر العديد من النواقل المناسبة لاستنساخ Golden Gate من عدة مجموعات بحثية ، ومن المرجح أن يزداد عدد النواقل المتاحة في المستقبل. ومع ذلك ، فإن تحويل متجه الاستنساخ القياسي إلى ناقل استنساخ Golden Gate يكون مطلوبًا في بعض الأحيان لتلبية احتياجات المستخدم المحددة. هناك العديد من الاستراتيجيات للقيام بذلك ، بما في ذلك استخدام تجميع Gibson DNA أو استنساخ Golden Gate.

    يتم توفير مثال هنا لتحويل متجه pET-28b (+) للاستخدام مع استنساخ Golden Gate. في هذا المثال ، أ لاكز جزء ألفا يحيط به اثنان بسيتم إدخال مواقع I في المتجه ، لتحل محل موقع multicloning (الشكل 3 أ). ال لاكز سيتم استخدام الجزء لاحقًا للفحص باللونين الأزرق والأبيض. هنا ، موقعان الاندماج المحيطان بـ لاكز الجزء هو AATG و GCTT ، المطابق لمعيار MoClo لاستنساخ متواليات التشفير (انظر البروتوكول الأساسي 4). ومع ذلك ، يمكن أن تكون أي تسلسلات أخرى قد يريدها المستخدم ، طالما أنها مختلفة عن بعضها البعض وغير متناظرة. في الواقع ، يمكن أن تؤدي الأجزاء المتراكبة المكونة من متواليات متناظرة إلى الصلابة نفسها المتراكمة لنسخة إضافية من نفس القطعة في الاتجاه الآخر ، مما يؤدي إلى منتجات ربط مستقرة غير صحيحة مع ذلك وتؤدي إلى انخفاض كبير في كفاءة الاستنساخ. في المثال المتوفر هنا ، يتوافق ATG الذي يعد جزءًا من موقع الاندماج الأول مع كودون بدء الميثيونين ، والذي يتم استنساخه في الإطار مع وجود علامته في تسلسلات ناقلات المنبع. المتجه و لاكز يتم الحصول على الجزء بواسطة PCR ، ويتم التجميع باستخدام إنزيم IIS من النوع الثاني ، بي بي آيأولا لأن هناك أربعة بي بي آيالمواقع في المتجه ، تتم إزالتها باستخدام بادئات مصممة لإدخال طفرات النوكليوتيدات المفردة في تسلسل التعرف على الحمض النووي.

    مواد إضافية (انظر أيضًا البروتوكول الأساسي 1)

    • البادئات الخاصة بالجينات من البائعين التجاريين (على سبيل المثال ، Eurofins Genomics)
    • قالب بلازميد لتضخيم لاكز كاسيت (على سبيل المثال ، pUC19 ، New England Biolabs ، cat. no. N3041S)
    • ناقل DNA البلازميد (على سبيل المثال ، pET-28b (+) ، Novagen ، Merck Millipore ، القط رقم 69418)
    • مجموعة تضخيم PCR عالية الدقة (على سبيل المثال ، KOD Hot Start DNA Polymerase ، Millipore Sigma ، VWR ، cat. no.71086-3)
    • مجموعة تنقية أجزاء PCR (على سبيل المثال ، NucleoSpin Gel و PCR Clean-up ، Macherey Nagel ، القط رقم 740609.250)

    1. تصميم الاشعال لتضخيم لاكز شظية.

    مواقع وتسلسلات التمهيدي لهذا المثال موضحة في الشكل 3. تم تصميم أول اثنين من البادئات ، Pr1 و Pr2 ، لتضخيم لاكز جزء من pUC19. يتم اختيار pUC19 كقالب لأنه يحتوي على جين مختلف لمقاومة المضادات الحيوية (Amp R) من المتجه المتلقي (Kan R). هذا يقلل من احتمال الحصول على بنيات غير صحيحة عن طريق ترحيل متجه القالب غير المهضوم عند فحص الحيوانات المستنسخة بعد التحويل. يحتوي الجزء المضخم على وحدة وظيفية لـ لاكز علامة للفحص الأزرق والأبيض. تحتوي البرايمر Pr1 و Pr2 على بي بي آيI مواقع التقييد (gaagac في الشكل 3 ب) مع مواقع اندماج 4-nt المقابلة لتسلسل AATG و GCTT ، على التوالي. يتبع مواقع الاندماج في اثنين من الاشعال بسمواقع التقييد في الاتجاه المعاكس (تكملة عكسية لـ ggtctc = gagacc في الشكل 3 ب). ال بسستصبح مواقع I جزءًا من المتجه الناتج وسيتم استخدامها لاستنساخ Golden Gate بمجرد صنع المتجه.

    يحتوي المتجه pET-28b على أربعة بي بي آيأقيد المواقع في التسلسلات الداخلية ، والتي يجب إزالتها عن طريق إجراء بدائل أحادية النوكليوتيدات (عملية تسمى التدجين). هناك حاجة لثمانية مواد أولية لهذا الغرض (Pr3 و Pr6-14). يتم إجراء طفرات صامتة لمواقع التقييد الموجودة في تسلسلات الترميز (في هذه الحالة ، مثبط Lac I ، الذي يحتوي على اثنين بي بي آيأنا المواقع). تم صنع زوج نهائي من البادئات (Pr4 و Pr5) لتجنب الاضطرار إلى تضخيم الأجزاء الأكبر من 2 كيلو بايت ، وهذا الزوج من البادئات اختياري. تحتوي جميع أنواع Primers Pr3-14 على ملف بي بي آيأنا موقع مع اختيار موقع اندماج ليكون متوافقًا مع موقع الانصهار للجزء الذي سيتم ربطه به.

    عند الطلب ، يكفي الحصول على أقل كمية ممكنة (أي 0.01 ميكرولتر) بأقل قدر من التنقية (خالٍ من الملح).

    1. قم بإعداد تفاعل PCR سعة 50 ميكرولتر مع زوج التمهيدي Pr1-2 باستخدام pUC19 كقالب.
    2. قم بإعداد ستة تفاعلات 50 ميكرولتر مع أزواج الاشعال من Pr3-4 إلى Pr13-14 باستخدام pET-28b (+) كقالب.

    3. قم بتشغيل 5 ميكرولتر من كل تفاعل على هلام لمعرفة ما إذا كان تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ناجحًا.

    4. تنقية الـ 45 ميكرولتر المتبقية من كل تفاعل باستخدام مجموعة قائمة على العمود (على سبيل المثال ، طقم تنظيف DNA Macherey Nagel NucleoSpin).

    سيؤدي هذا إلى فصل منتج PCR عن أي بوليميريز DNA متبقي و dNTPs ، بالإضافة إلى ثنائيات التمهيدي التي يتم إنتاجها على مستويات مختلفة في معظم تفاعلات PCR.

    5. تحديد منتجات PCR المنقى باستخدام مطياف مثل Nanodrop.

    6. إجراء تفاعل استنساخ البوابة الذهبية (انظر البروتوكول الأساسي 1) باستخدام الإنزيم بي بي آيI. تحويل المنتج إلى بكتريا قولونية (انظر البروتوكول الأساسي 1) وحدد المستعمرات الزرقاء.

    في هذا المثال بالذات ، يجب طلاء المحولات على رطل يحتوي على كاناميسين و X-gal. يجب ألا تكون المستعمرات الصحيحة بيضاء ، بل زرقاء.

    7. تحضير الحمض النووي باستخدام مجموعة miniprep.

    8. هضم 1 ميكرولتر مع بسأنا في رد فعل 10 ميكرولتر.

    من المتوقع وجود جزأين من 5.3 كيلو بايت و 506 نقطة أساس لهذا البناء المعين.

    من المرغوب فيه ترتيب تسلسل البلازميد بأكمله باستخدام البادئات المصممة في مواضع مختلفة داخل البلازميد لأنه تم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم المتجه بأكمله. ومع ذلك ، نظرًا لأن بعض المناطق المطلوبة للنسخ المتماثل أو التعبير عن علامة LacZ يجب أن تكون وظيفية إذا كان البلازميد يتكرر وكانت المستعمرات زرقاء ، فقد لا يحتاج البلازميد بأكمله إلى التسلسل. كحد أدنى ، يجب تسلسل جميع العناصر التي ستكون مطلوبة لاحقًا للتعبير عن الجين ، بما في ذلك المنطقة الممتدة من مروج T7 إلى المنهي. يعد تسلسل المنطقة التي تحتوي على موقعي BsaI المقدمين ضروريًا للتأكد من أن تسلسل موقعي الاندماج كما هو متوقع.

    يمكن الآن استخدام متجه الاستنساخ في استنساخ Golden Gate.

    3: استيعاب مدرج لاستنساخ البوابة الذهبية

    يشرح هذا البروتوكول كيفية تصميم البادئات لاستيعاب تسلسل الاهتمام باستنساخ Golden Gate ثم استنساخ الأجزاء المضخمة في ناقل وجهة Golden Gate. يتم إعطاء مثال لاستنساخ تسلسل الترميز لـ نبات الأرابيدوبسيس thaliana تضخيم إيزوفلافون اختزال من أرابيدوبسيس قالب cDNA (انضمام Genbank NM_106183).

    مواد إضافية (انظر أيضًا البروتوكولين الأساسيين 1 و 2)

    • قالب cDNA أو DNA لـ PCR (هنا ، cDNA from أرابيدوبسيس)
    • DNA البلازميد من ناقل وجهة البوابة الذهبية

    1. تصميم الطفرات الصامتة في إطار القراءة المفتوحة لتسلسل الاهتمام في السيليكو باستخدام برامج الاستنساخ (مثل Vector NTI).

    في هذا المثال ، يحتوي تسلسل الترميز على واحد بسأنا موقع (الشكل 4 أ). يتم إزالته في السيليكو باستبدال أحادي النوكليوتيدات ، مما يؤدي إلى حدوث طفرة صامتة (كما هو موضح باللون الأحمر في الشكل 4 ب).

    2. أضف إلى تسلسل الترميز موقعي اندماج متجاورين للتوافق مع المتجه.

    في هذه الحالة ، أضف واحد A قبل كود البدء لإعطاء AATG ، وأضف GCTT بعد كود الإيقاف.

    يظهر التسلسل المضاف باللون الأحمر في الشكل 4 ب ، وتظهر مواقع الاندماج باللون الأزرق.

    3. حدد موقع اندماج في موقع الطفرة.

    سيتم تضخيم شظايا PCR ، واحدة على كل جانب من جوانب الطفرة (I و FR في الشكل 4 أ) ، ثم يتم تجميعها عبر موقع اندماج يتداخل أو بالقرب من النوكليوتيدات الطافرة. يجب أن يكون موقع الاندماج مختلفًا عن مواقع الاندماج الأخرى (AATG و GCTT) ويجب ألا يكون متناوبًا. يجب أن تحتوي على G أو C واحد على الأقل (أكثر ، إن أمكن) ، لأن المواقع التي تحتوي على As أو Ts فقط قد تعمل بشكل أقل جودة لتجميع الحمض النووي (Potapov et al. ، 2018). عند الحاجة إلى العديد من مواقع الاندماج ، يمكن استخدام برنامج Ligase Fidelity Viewer (New England Biolabs ، http://ggtools.neb.com/viewset/run.cgi) للتحقق من ملاءمة جميع المواقع. في المثال الحالي ، يتم تحديد تسلسل واحد ، GGAC (يظهر باللون الأصفر في الشكل 4 ب).

    4. تصميم البادئات بدءاً من جميع مواقع الاندماج. حدد اثنين من الاشعال في الاتجاه المعاكس لكل موقع متحور (في هذه الحالة ، موقع واحد فقط). اجعل البادئات طويلة بما يكفي لإعطاء درجة حرارة انصهار مناسبة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.

    5. أضف تسلسل بسموقع التعرف (tt ggtctc a) على بداية كل البادئات.

    يتم عرض القائمة النهائية من الاشعال في الشكل 4C.

    6. تضخيم شظايا PCR باستخدام أزواج الاشعال المناسبة (Isof1-2 و Isof3-4 الشكل 4A) من أرابيدوبسيس قالب (كدنا) في رد فعل 50 ميكرولتر. قم بتشغيل 5 ميكرولتر على هلام للتحقق من تضخيم الجزء الصحيح. قم بتنقية 45 ميكرولتر المتبقية باستخدام طقم قائم على العمود وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة.

    7. إعداد وتنفيذ رد فعل التجميع كما هو موضح (انظر البروتوكول الأساسي 1).

    لأن هذا المثال يصف استنساخًا بسيطًا مع شظيتين فقط مستنسختين في المتجه ، يجب أن تكون الحضانة البسيطة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين و 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق كافية.

    8. تحويل مزيج الربط إلى مختص بكتريا قولونية، لوحة على LB تحتوي على كاناميسين و X-gal ، وفحص المستعمرات الناتجة.

    يتم هضم Minipreps مع اثنين من الإنزيمات ذات مواقع التقييد المحيطة بالإدخال ، أو مع الإنزيمات التي لها مواقع في الناقل في الإدخال. نظرًا لاستخدام PCR للاستنساخ ، يجب تسلسل الإدخال المستنسخ باستخدام بادئات للتسلسلات في المتجه الذي يحيط بالإدراج.

    4: إنشاء أجزاء معيارية صغيرة متوافقة مع الاستنساخ النمطي الهرمي (MoClo) باستخدام متجهات المستوى 0

    يمكن تجميع أجزاء الحمض النووي من البلازميدات باستخدام استنساخ Golden Gate بسرعة وكفاءة. في المقابل ، يتطلب التجميع من منتجات PCR مزيدًا من العمل ، لأن منتجات PCR غالبًا ما تحتوي على ثنائيات أولية تكونت عن طريق التلدين الخاطئ للبادئات أثناء تضخيم PCR. نظرًا لأن ثنائيات التمهيدي محاطة بنفس مواقع تقييد IIS من النوع مثل منتجات PCR ، فيمكن استنساخها ، مما يؤدي إلى إنشاءات غير صحيحة وتقليل كفاءة الاستنساخ (الشكل 5). حتى لو لم يتم تصنيع ثنائيات أولية ، فإن البنى المستنسخة تحتاج إلى التسلسل للتأكد من أنها لا تحتوي على طفرات يسببها تفاعل البوليميراز المتسلسل. لذلك ، من المنطقي أن يكون لديك نظام حيث يمكن إعادة استخدام أجزاء الحمض النووي المستنسخة والمتسلسلة في تركيبات مختلفة. على سبيل المثال ، يمكن إعادة استخدام الأجزاء التي تحتوي على متواليات تنظيمية مثل المحفزات والمُنهي في العديد من التركيبات المختلفة.

    تم تصميم نظام الاستنساخ المعياري MoClo لتسهيل إعادة استخدام الأجزاء المستنسخة في تراكيب مختلفة (الشكل 6). يعتمد على استخدام الأجزاء الأساسية التي يتم تجميعها معًا باستخدام استنساخ Golden Gate. يتم استنساخ الأجزاء الأساسية كوحدات نمطية من المستوى 0 ويتم تجميعها في نواقل استنساخ من المستوى 1 لعمل وحدات نسخ. ثم يتم تجميع بنيات المستوى 1 لعمل بنى متعددة الجينات من المستوى M و P. تحتوي الأجزاء الأساسية على تسلسل الترميز لعنصر وراثي أساسي محاط بعنصرين بسأقوم بتقييد المواقع في الاتجاه المعاكس (الشكل 7). يتطلب استنساخ الأجزاء الأساسية تضخيمًا من DNA أو cDNA كقالب. يتم استنساخ المنتج المضخم في ناقل متلقي باستخدام استنساخ Golden Gate. تتكون خطوات الاستنساخ من تحديد نوع الجزء الذي يحتوي على مواد أولية للتصميم بسأقوم بتقييد المواقع في نهايات الأجزاء ، وإزالة المواقع من التسلسلات الداخلية ، واستنساخ الأجزاء المضخمة في ناقل.

    مواد إضافية (انظر أيضًا البروتوكولين الأساسيين 1 و 2)

    • قالب cDNA أو DNA لـ PCR (هنا ، cDNA from أرابيدوبسيس)
    • متجه الاستنساخ العالمي المستوى 0 pAGM9121 (Addgene ، plasmid # 51833)

    1. حدد نوع وحدة المستوى 0 (جزء).

    يمكن أن تتكون الأجزاء من معززات ، وتسلسلات تشفير مع أو بدون كودون توقف ، وعلامات اندماج C- أو N- طرفية ، ونهايات (الشكل 7 أ). كل جزء يحيط به اثنان بسأنا مواقع في اتجاه معاكس (الشكل 7 ب). تسلسل 4-bp من بسمواقع الانقسام (مواقع الانصهار) محددة لكل نوع من الوحدات النمطية وتحدد الأجزاء التي يمكن دمجها معًا. على سبيل المثال ، يمكن دمج وحدة المروج مع TACT كموقع الانصهار 3 (Pro في الشكل 7 أ) فقط في تسلسل قائد غير مترجم مع نفس موقع الانصهار في الطرف 5 (5UTR2 في الشكل 7 أ). لكل نوع جزء ، يتوفر ناقل استنساخ محدد مع مواقع اندماج متوافقة. بدلاً من ذلك ، يمكن استنساخ جميع أنواع الأجزاء في متجه الاستنساخ العالمي 0 pAGM9121 (الشكلان 7 د و 8) كما هو موضح في هذا البروتوكول. قد تكون وحدات المستوى 0 أيضًا مركبات من عدة أجزاء أساسية. على سبيل المثال ، يمكن استنساخ التركيبات التي تحتوي على وحدة نسخ كاملة مباشرةً كوحدات نمطية من المستوى 0 بين مواقع الاندماج GGAG و CGCT. يمكن أيضًا استنساخ أنواع أخرى من العناصر الجينية ، مثل موقع إعادة تركيب الملتهمة أو منطقة ارتباط المصفوفة ، كوحدات نمطية من المستوى 0 بين مواقع الاندماج GGAG و CGCT.

    2. إدخال الطفرات الصامتة في التسلسل الجيني في السيليكو.

    يجب ألا تحتوي الأجزاء الأساسية على مواقع تقييد لأنزيمات IIS المستخدمة مع نظام MoClo (بسأنا، بي بي آيأنا واختياريا بي إس إمBI). تتم إزالة مواقع التقييد عن طريق إدخال طفرات النوكليوتيدات المفردة ، والتي يتم إجراؤها أولاً في السيليكو. يمكن دائمًا إزالة المواقع الداخلية في تسلسل التشفير باستخدام طفرة صامتة. تعد إزالة التسلسلات في مناطق المحفز أكثر صعوبة ، لأن التسلسلات المهمة لوظيفة المحفز ليست معروفة دائمًا. لذلك ، بعد تدجين متواليات المحفز ، سيكون من الضروري التحقق تجريبيًا في الكائن الحي المضيف من أن المروج لا يزال يعمل على النحو المنشود. تدجين أرابيدوبسيس يتم تقديم جين UGT78D2 (انضمام GenBank NM_121711) هنا كمثال. هذا الجين يحتوي على واحد بسأنا موقع اثنين بي بي آيأنا مواقع واحد بي إس إمموقع BI (الشكل 9 أ) ، والذي تمت إزالته بإدخال أربع طفرات صامتة (أحمر في الشكل 10).

    3. أضف موقعي الاندماج القياسيين المحيطين بالجزء.

    نظرًا لأن هذه الوحدة ستكون عبارة عن تسلسل تشفير مع رمز إيقاف (CDS1) ، تتم إضافة واحد A قبل كودون البدء لإعطاء AATG ، ويتم إضافة تسلسل GCTT بعد كود الإيقاف (تم تمييز كلا موقعي الاندماج باللون الأزرق في الشكل 10) .

    4. أضف تسلسلات للتوافق مع متجه الاستنساخ العالمي.

    في هذا المثال ، سيتم استنساخ الجزء في متجه الاستنساخ العالمي 0 pAGM9121. لذلك ، تتم إضافة CTCA و CGAG في بداية الجزء ونهايته لتوفير التوافق الضروري (الموضح باللون الأخضر في الشكل 10). ستصبح هذه التسلسلات جزءًا من بسأقوم بتقييد المواقع التي ستحيط بوحدة المستوى 0 النهائية.

    5. حدد مواقع الاندماج غير القياسية التي سيتم استخدامها لتجميع أجزاء PCR.

    هذه هي التسلسلات 4-nt التي سيتم استخدامها لتجميع نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل أثناء الاستنساخ. يجب أن تكون مختلفة عن بعضها البعض وعن مواقع الاندماج التي سيتم استخدامها في المتجه (CTCA و CTCG لمتجه الاستنساخ العالمي ، أو AATG و GCTT لمتجه الاستنساخ الخاص بـ CDS1). كما يجب أن تكون مختلفة عن التكملة العكسية لأي من مواقع الاندماج المختارة لتجنب ربط الشظايا غير المناسب. يتم تمييز التسلسلات المحددة باللون الأصفر في الشكل 10.

    6. تصميم البادئات بدءاً من جميع مواقع الاندماج القياسية وغير القياسية.

    بالنسبة لمواقع الاندماج في المواقع المحورة لإزالة مواقع التقييد ، تم تصميم الاشعال في كلا الاتجاهين. يجب أن تكون البادئات طويلة بما يكفي لدرجة حرارة انصهار مناسبة. يمكن حساب ذلك باستخدام أي من البرامج العديدة المتاحة عبر الإنترنت أو يمكن إجراؤه يدويًا.

    7. قم بإضافة تسلسل التعرف على إنزيم IIS من النوع.

    لأن بي بي آيأنا تستخدم للتجميع ، تسلسل tt جاجاك يضاف aa إلى جميع البادئات. يتم عرض تسلسل التمهيدي والمواقع في الشكل 9.

    8. تضخيم PCR الشظايا.

    تضخيم خمس شظايا من أرابيدوبسيس [كدنا] في تفاعلات منفصلة 50 ميكرولتر باستخدام أزواج التمهيدي Gtpr1-2 إلى Gtpr9-10 وبوليميراز التدقيق اللغوي. قم بتشغيل 5 ميكرولتر على هلام للتحقق من تضخيم كل جزء كما هو متوقع.

    9. عمود تنقية الشظايا.

    يجب تنقية الأجزاء المضخمة لإزالة البوليميراز المتبقي ، والبادئات ، و dNTPs ، ومعظم ثنائيات التمهيدي التي غالبًا ما تكون موجودة في التفاعل. إذا تم تضخيم جزء واحد ، فإن استخدام مجموعة تنقية الحمض النووي (على سبيل المثال ، مجموعة تنقية DNA Macherey Nagel) يكون كافياً. قد يكون الاستخراج الهلامي لشظايا PCR بالحجم الصحيح ضروريًا إذا تم تضخيم العديد من شظايا الحمض النووي.

    10. قم بإعداد الاستنساخ في متجه المستوى العالمي 0 pAGM9121 كما هو موصوف (انظر البروتوكول الأساسي 1).

    11. تحويل في بكتريا قولونية واختيار مستعمرتين أبيضين. يمكن انتقاء المزيد من المستعمرات لاحقًا إذا كان تسلسل هذه الحيوانات لا يُظهر التسلسل الصحيح.

    12. فحص المستعمرات عن طريق هضم miniprep DNA مع بسأنا.

    13. ترتيب الحيوانات المستنسخة باستخدام البادئات المتجهة lev0seqf و lev0seqr (الشكل 9 ب).

    : توليد أجزاء قياسية كبيرة متوافقة مع الاستنساخ النمطي الهرمي (MoClo) باستخدام المستوى -1 متجهات

    بينما يمكن ترتيب الأجزاء الصغيرة (& lt1.2 كيلو بايت) باستخدام بادئات قياسية موجودة في متواليات ناقلات المرافقة ، لا يمكن تسلسل الأجزاء الكبيرة بالكامل من بادئات ناقلات. يجب تصميم بادئات تسلسلية إضافية داخل الجزء لتسلسل قسمه الأوسط. لتسهيل التسلسل دون الحاجة إلى بادئات تسلسلية مخصصة لكل جزء ، تتكون إستراتيجية بديلة من أجزاء جزء استنساخ (أجزاء فرعية) لا يزيد طولها عن 1-1.2 كيلو بايت ، وتسلسل الأجزاء الفرعية باستخدام بادئات متجهية ، ثم التجميع الأجزاء الفرعية المتسلسلة باستخدام تفاعل التجميع الثاني لعمل وحدة المستوى 0 النهائية (الشكل 11). يتم استنساخ الأجزاء الفرعية في متجه استنساخ عالمي المستوى -1 (pAGM1311 ، الشكل 12).

    مواد إضافية (انظر أيضًا البروتوكول الأساسي 4)

    1. حدد نوع الجزء ، وأدخل الطفرات الصامتة ، وأضف مواقع الاندماج القياسية ، وأضف تسلسلات للتوافق مع ناقل الاستنساخ العالمي كما هو موصوف (انظر البروتوكول الأساسي 4 ، الخطوات 1-4).

    2. حدد مواقع الاندماج غير القياسية التي سيتم استخدامها لتجميع أجزاء PCR.

    هذه هي متواليات 4-nt التي سيتم استخدامها لتجميع نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل أثناء الاستنساخ. يجب أن تكون مختلفة عن بعضها البعض وعن مواقع الاندماج التي سيتم استخدامها في المتجه (في هذه الحالة ، ACAT و TTGT للمستوى العالمي -1 متجه انظر الخطوة 5 أدناه). كما يجب أن تكون مختلفة عن التكملة العكسية لأي من مواقع الاندماج المختارة لتجنب ربط الشظايا غير المناسب. التسلسلات المختارة هي نفسها الموجودة في البروتوكول الأساسي 4 (المظللة باللون الأصفر في الشكل 10).

    3. تصميم الاشعال يبدأ في جميع مواقع الاندماج ، القياسية وغير القياسية ، كما هو موضح (انظر البروتوكول الأساسي 4 ، الخطوة 6).

    4. أضف تسلسل التعرف على إنزيم IIS من النوع.

    للاستنساخ في نواقل المستوى 1 ، بسأنا تستخدم للتجميع ، وبالتالي تسلسل tt ggtctc يضاف a إلى نهاية 5 لجميع البادئات.

    5. أضف متواليات للتوافق مع متجه الاستنساخ من المستوى العالمي -1.

    إن موقعي الاندماج لمتجه الاستنساخ العالمي هما ACAT و TTGT ، ويحتويان على جزء من a بي بي آيأنا موقع التقييد الذي سيحيط الجزء الفرعي بعد الاستنساخ (الشكل 12). لذلك ، يجب إضافة التسلسلات ACAT و ACAA (المكمل العكسي لـ TTGT) إلى البادئين اللذين يحددان مجموعة أجزاء PCR التي سيتم استنساخها معًا. تتم إضافة هذه التسلسلات على الفور 3 من بسأنا موقع وقبل موقع اندماج ناقلات المستوى 0 العالمي (CTCA أو CTCG). في هذا المثال ، سيتم استنساخ أول ثلاثة منتجات PCR معًا في المستوى العالمي –1 المتجه pAGM1311 ، وسيتم أيضًا استنساخ المنتجين الرابع والخامس معًا في pAGM1311. تظهر تسلسلات التمهيدي والمواقع للمستوى الأول –1 (Gtpr1 إلى 6 ′) والمستوى الثاني –1 البناء (Gtpr7 ′ إلى 10) في الشكل 11.

    6. تضخيم PCR الأجزاء (انظر البروتوكول الأساسي 4 ، الخطوة 8) باستخدام أزواج التمهيدي المناسبة (Gtpr1′-2 to Gtpr9′-10).

    7. العمود تنقية الأجزاء (البروتوكول الأساسي 4 ، الخطوة 9).

    8. قم بإعداد تفاعلين لاستنساخ Golden Gate كما هو موصوف (انظر البروتوكول الأساسي 1) باستخدام المستوى العالمي –1 ناقل pAGM1311. استنساخ المنتجات الثلاثة الأولى معًا في تفاعل واحد والنواتج الرابعة والخامسة في التفاعل الثاني (وحدات المستوى -1 في الشكل 11 أ).

    9. تحويل في بكتريا قولونية واختيار مستعمرتين أبيضين. يمكن انتقاء المزيد من المستعمرات لاحقًا إذا كان تسلسل هذه الحيوانات لا يوفر التسلسل الصحيح.

    10. فحص المستعمرات عن طريق هضم miniprep DNA مع بي بي آيأنا.

    11. استنساخ التسلسل باستخدام البادئات المتجهة Levm1seqF و Levm1seqR (الشكل 11 ب).

    12. قم بتجميع وحدات المستوى 0 من المستوى -1 الأجزاء الفرعية. قم بإعداد رد فعل استنساخ Golden Gate لتجميع المستنسخين المختارين من المستوى -1 في متجه الاستنساخ العالمي 0 pAGM9121 (انظر البروتوكول الأساسي 1).

    13. تحويل في بكتريا قولونية الخلايا.

    14. فحص المستعمرات عن طريق هضم miniprep DNA مع بسأنا.

    نظرًا لعدم استخدام PCR لإنشاء هذه التركيبات ، فإن التسلسل غير مطلوب.

    5: تجميع وحدات النسخ والإنشاءات المتعددة باستخدام متجهات MoClo من المستوى 1 و M و P

    يتم تجميع التركيبات متعددة الجينات باستخدام نظام MoClo بشكل هرمي (الشكل 6). تتمثل الخطوة الأولى في تجميع أجزاء المستوى 0 في متجهات الوجهة من المستوى 1 لإنشاء تراكيب تحتوي عادةً على وحدة نسخ. والثاني هو تجميع التركيبات متعددة الجينات والتي تتم في مراحل متناوبة باستخدام متجهات المستوى M و P. يمكن تجميع ما يصل إلى ست وحدات نسخ في متجه استنساخ من المستوى M لإنشاء بناء متعدد الجينات من المستوى M. بعد ذلك ، يمكن تجميع ما يصل إلى ستة تراكيب من المستوى M بشكل إضافي في متجه من المستوى P لإنشاء بناء مستوى P يحتوي على ما يصل إلى 36 وحدة نسخ. يمكن تجميع تركيبات المستوى P نفسها في متجهات المستوى M لعمل تراكيب أكبر. يمكن تكرار هذه العملية إلى أجل غير مسمى ، حتى تصبح التركيبات أكبر من أن يتم استنساخها كبلازميدات فيها بكتريا قولونية. استخدام التجميع من المستوى M و P. بسانا و بي بي آيأنا بالتناوب.

    مواد إضافية (انظر أيضًا البروتوكول الأساسي 1)

    • أجزاء المستوى 0
    • متجهات الوجهة من المستوى 1 و M و P من MoClo Toolkit (Addgene ، kit # 1000000044)

    قم بتجميع وحدات النسخ في متجهات المستوى 1

    1. حدد الأجزاء القياسية من المستوى 0.

    تتمثل الخطوة الأولى لتخطيط تجميع بنية متعددة الجينات في تحديد جميع الأجزاء الأساسية المطلوبة لكل وحدة نسخ. على سبيل المثال ، لإنشاء بنية تحتوي على أربع وحدات نسخ ، كل منها يتكون من ثلاثة أجزاء - بما في ذلك مروج مع 5′-UTR (pro + 5U) ، تسلسل تشفير (CDS1) ، و 3′-UTR مع فاصل (3U + Ter) —مجموع اثني عشر جزءًا مطلوبًا.

    يتم عرض قائمة بجميع أنواع الأجزاء في الشكل 7. الأجزاء غير المتوفرة بالفعل مستنسخة كما هو موصوف (انظر البروتوكول الأساسي 4). بعضها متاح بالفعل للنباتات (MoClo Plant Parts Kit ، Addgene ، kit # 1000000047) ، كلاميدوموناس (https://www.chlamycollection.org/product/moclo-toolkit/ Crozet et al.، 2018) والبكتيريا الزرقاء (http://www.addgene.org/browse/article/28196941/ Vasudevan et al.، 2019 ).

    2. حدد متجهات الوجهة من المستوى 1.

    يتوفر أربعة عشر متجهًا من المستوى 1: سبعة لاستنساخ وحدة النسخ في الاتجاه الأمامي في سبعة مواضع مختلفة في البناء النهائي ، وسبعة للاتجاه العكسي (الشكل 13 أ). كلها تحتوي على اثنين بسمواقع I ومواقع الاندماج GGAG و CGCT لتوفير التوافق مع وحدات المستوى 0. تحتوي أيضًا على اثنين بي بي آيمواقع استئصال وحدة النسخ المجمعة في الخطوة التالية من التجميع. ال بي بي آيتم تصميم مواقع الاندماج لتوفير التوافق من ناقل إلى آخر. في مثال حيث يتم استنساخ أربع وحدات نسخ في الاتجاه الأمامي ، يتم تحديد المتجهات للمواضع من 1 إلى 4 للاتجاه الأمامي (pL1F-1 و pL1F-2 و pL1F-3 و pL1F-4).

    ال بي بي آيموقع الاندماج في نهاية المتجه 7 (TGCC) هو نفس الموقع الموجود في بداية المتجه 1 ، مما يسمح باستنساخ أكثر من سبعة جينات في بنية متعددة الجينات عن طريق إعادة استخدام نفس النواقل السبعة إلى أجل غير مسمى. وهكذا ، يتم استنساخ وحدة النسخ الثامنة باستخدام المتجه 1 ، ويتم استنساخ وحدة النسخ التاسعة باستخدام المتجه 2 ، وهكذا (الشكل 13 ج).

    في المثال الوارد في الشكل 13 ج ، يتم استنساخ وحدتي نسخ في اتجاه عكسي ، وبالتالي يتم تحديد ناقلات الاستنساخ في الاتجاه العكسي. إن اختيار ما إذا كان ينبغي استنساخ وحدة النسخ في اتجاه واحد أم الآخر يتم تحديده فقط من خلال احتياجات المستخدم.

    3. تجميع بنيات المستوى 1.

    يتم تجميع الإنشاءات باستخدام أربعة تفاعلات استنساخ لـ Golden Gate ، كل منها يحتوي على الأجزاء الأساسية الثلاثة المختارة وناقل المستوى 1. يظهر مثال لاستنساخ وحدة النسخ الأولى في الشكل 14. يتم تنفيذ تفاعل الاستنساخ كما هو موصوف (انظر البروتوكول الأساسي 1). لأن نواقل المستوى 1 تحتوي على ملف لاكز شظية للفحص الأزرق والأبيض ، يتم اختيار مستعمرتين بيضاء. كما يحيط بوحدات النسخ المجمعة بي بي آيمواقع I ، يتم فحص miniprep DNA بواسطة بي بي آيأنا الهضم.


    كيف تقرأ نطاقات الرحلان الكهربائي الهلامية

    شارك في تأليف هذا المقال فريقنا المُدرَّب من المحررين والباحثين الذين قاموا بالتحقق من صحتها للتأكد من دقتها وشمولها. يراقب فريق إدارة المحتوى في wikiHow بعناية العمل الذي يقوم به فريق التحرير لدينا للتأكد من أن كل مقال مدعوم بأبحاث موثوقة ويلبي معايير الجودة العالية لدينا.

    هناك 12 مرجعًا تم الاستشهاد بها في هذه المقالة ، والتي يمكن العثور عليها في أسفل الصفحة.

    تمت مشاهدة هذا المقال 7،319 مرة.

    الرحلان الكهربائي للهلام هو نوع من التكنولوجيا الحيوية التي تفصل الجزيئات بناءً على حجمها لتفسير الحمض النووي للكائن الحي. يتم استخدام إنزيم لفصل خيط من الحمض النووي عن المصدر ويتم تعليق الحمض النووي في صبغة. ثم يتم وضع الصبغة على هلام سالب الشحنة على جانب واحد من الورقة. ينتقل الحمض النووي تلقائيًا عبر مجموعة من الخطوط الأفقية على الورقة للوصول إلى الهلام الموجب الشحنة على الجانب الآخر. يعتبر الفصل الكهربائي للهلام مفيدًا عند تحديد الارتباط بين نوعين أو أكثر أو عينات فردية. يمكن أن يساعد أيضًا في إنشاء بصمة DNA.


    المواد والأساليب

    نوع الكاشف (الأنواع) أو المواردتعيينالمصدر أو المرجعمعرفاتمعلومة اضافية
    البرمجيات ، الخوارزميةإصدار MATLAB 2015a و 2018a مجموعة أدوات معالجة الإشارات ، صندوق أدوات تركيب المنحنى ، مجموعة أدوات الإحصاء وتعلم الآلةThe MathWorks Inc ، 2020 ، ناتيك ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةالمعرف_المصدر: SCR_001622
    البرمجيات ، الخوارزميةAdobe Illustrator CS6 و CC 2018 Adobe Inc ، 2020 ، دبلن ، جمهورية أيرلنداالمعرف_المصدر: SCR_010279
    البرمجيات ، الخوارزميةFieldTrip 20170829Oostenveld et al.، 2011 Stolk et al.، 2018ID_source: SCR_004849http://www.fieldtriptoolbox.org/
    البرمجيات ، الخوارزميةEEGLAB_14_0_0bديلورم وماكيج ، 2004المعرف_المصدر: SCR_007292https://sccn.ucsd.edu/eeglab/index.php
    البرمجيات ، الخوارزميةFreeSurfer 5.3.0ديل وآخرون ، 1999 فيشل ، 2012المعرف_المصدر: SCR_001847https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/
    البرمجيات ، الخوارزميةLCMV بيمفورمرVan Veen et al.، 1997
    البرمجيات ، الخوارزميةIRASA (التحليل الطيفي التلقائي لاختزال غير منتظم)وين وليو ، 2016 ب
    البرمجيات ، الخوارزميةالتحليل الطيفي متعدد الأوراقPrerau وآخرون ، 2017
    البرمجيات ، الخوارزميةFOOOF (التذبذبات الملائمة وواحدة فوق F)Haller et al.، 2018https://pypi.org/project/fooof/
    البرمجيات ، الخوارزميةeBOSC (الكشف عن OSCillation الموسع الأفضل)Kosciessa et al.، 2020bhttps://github.com/jkosciessa/eBOSC
    البرمجيات ، الخوارزميةالمعلومات المتبادلةQuian Quiroga and Panzeri ، 2009http://prerau.bwh.harvard.edu/multitaper/
    البرمجيات ، الخوارزميةBioSig Toolbox - تحويل Logitشلوغل وبرونر ، 2008 المعرف_المصدر: SCR_008428
    البرمجيات ، الخوارزميةالنموذج الخطي العامسيجل وآخرون ، 2015
    البرمجيات ، الخوارزميةكشف الموجة البطيئةHelfrich et al.، 2018 Staresina et al.، 2015
    البرمجيات ، الخوارزميةمبادلة الكتلة العشوائية (إحصائيات)Canolty et al.، 2006 Aru et al.، 2015
    البرمجيات ، الخوارزميةالاتصالiPLV (قيمة قفل المرحلة التخيلية) - Nolte et al. ، 2004 rhoortho (ارتباط طاقة متناسق) - Hipp et al. ، 2012
    آخرغير متوفر

    مشاركون

    لقد جمعنا أربع مجموعات بيانات مستقلة لهذه الدراسة لتقييم الأساس الفسيولوجي العصبي لحالات انخفاض الإثارة ، أي التخدير العام والنوم. سجلنا إما تخطيط كهربية فروة الرأس غير الغازية (EEG) أو تخطيط كهربية الدماغ داخل الجمجمة (تخطيط كهربية القلب ECoG) باستخدام الشبكة تحت الجافية والأقطاب الكهربائية الشريطية وأقطاب العمق الموضوعة بشكل تجسيمي (SEEG للتغطية ، انظر الشكل 1 - ملحق الشكل 1).

    تخدير

    تم إجراء دراسات التخطيط الكهربائي للدماغ والتخدير داخل الجمجمة في مستشفى جامعة أوسلو. قدم جميع المشاركين أو أولياء أمورهم موافقة خطية مستنيرة وفقًا لإرشادات لجنة الأخلاقيات المحلية (اللجان الإقليمية لأخلاقيات البحث الطبي والصحي في أوسلو رقم القضية 2012/2015 والتمديد 2012 / 2015–8) وإعلان هلسنكي.

    دراسة 1 - تخدير فروة الرأس EEG

    شارك عشرة مرضى (امرأتان) يخضعون لاستئصال القرص العنقي الأمامي والاندماج في الدراسة الأولى وتلقوا تخديرًا كليًا في الوريد باستخدام الريميفنتانيل والبروبوفول. كان لديهم حالة الجمعية الأمريكية للتخدير من I إلى III ، وكانوا بين 46 و 64 سنة (53.3 ± 5.7 سنة يعني ± SD) وبخلاف ذلك يتمتعون بصحة جيدة. تم تسجيل البيانات من تحريض التخدير إلى الانتعاش من 25 قناة EEG وفقًا للتخطيط 10-20 (EEG Amplifier ، Pleasanton ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع صف إضافي من الأقطاب الكهربائية (F9 ، F10 ، T9 ، T10 ، P9 ، P10 ) بمعدل رقمنة 512 هرتز ، أو في حالة مريض واحد بسرعة 256 هرتز. تم وضع القطب للإشارة في CP1. لم يتم تسجيل ثلاثة مرضى طوال الفترة الزمنية المخطط لها - بدأ تسجيل واحد فقط بعد التحريض ، بينما تم إيقاف اثنين قبل الشفاء (Juel et al. ، 2018).

    دراسة 2 - التخدير داخل الجمجمة EEG

    شارك ما مجموعه 12 مريضا (ثلاث إناث) يعانون من الصرع المستعصية في الدراسة 2. تراوحت أعمارهم بين 8 و 52 سنة (26.6 ± 13.2 سنة يعني ± SD). تم جمع البيانات أثناء استكشاف الأقطاب الكهربائية داخل الجمجمة من تحريض التخدير حتى نقطة إزالتها. تلقى جميع المرضى تخديرًا كليًا في الوريد باستخدام البروبوفول والريميفنتانيل في مستشفى جامعة أوسلو. تم إعادة جميع المرضى إلى الأدوية المعتادة المضادة للصرع قبل الإجراء. تم تسجيل البيانات على نظام Natus NicoletOne بسعة 128 قناة ومعدل رقمنة 1024 هرتز لما يصل إلى 64 أو 512 هرتز لما يصل إلى 128 قناة.

    إدارة التخدير

    تلقى جميع المرضى دواءً تمهيديًا من 3.75 إلى 7.5 ملغ من الميدازولام (دورميكوم ، بازل ، سويسرا) ، تلقت مجموعة تخدير فروة الرأس EEG (الدراسة 1) 1 غرامًا إضافيًا من الباراسيتامول الفموي (باراسيت ، ويفا ، أوسلو ، النرويج) بالإضافة إلى 10 ملغ من الأوكسيكودون. أقراص (OxyContin ، دبلن ، أيرلندا) للتحكم في الألم بعد الجراحة. تم إعطاء Propofol (Propolipid ، Fresenius Kabi ، Uppsala ، السويد) و remifentanil (Ultiva ، GlaxoSmithKline ، بارما ، إيطاليا) بواسطة مضخات التسريب التي يتحكم فيها الكمبيوتر (B Braun Perfusor Space ، Melsungen ، ألمانيا) باستخدام برنامج التسريب المستهدف (TCI) (شنايدر للبروبوفول ومينتو للريميفنتانيل) من أجل تحقيق تركيزات البلازما الكافية للتخدير والتسكين. قبل بدء التخدير ، تلقى جميع المرضى تسريبًا من رينجرز أسيتات (5 مل / كجم) لمنع انخفاض ضغط الدم أثناء تحريض التخدير ، بالإضافة إلى 3-5 مل 1٪ ليدوكائين عن طريق الوريد لمنع الألم أثناء حقن البروبوفول. تم تزويد جميع المرضى بالأكسجين مسبقًا بالأكسجين بنسبة 100 ٪ وتلقوا سيساتراكوريوم المرخي للعضلات غير المزيلة للاستقطاب للتنبيب (نيمبكس ، جلاكسو سميث كلاين ، أوسلو ، النرويج). بعد التنبيب ، تم تقليل جزء الأكسجين الشهيق إلى 40 ٪ من أكسيد النيتريك.

    نايم

    دراسة 3 - فروة الرأس أثناء النوم EEG

    أجريت الدراسة الثالثة في جامعة كاليفورنيا في بيركلي. تم إبلاغ جميع المشاركين وتقديم موافقة خطية وفقًا للجنة الأخلاقيات المحلية (رقم بروتوكول لجنة بيركلي لحماية الأشخاص البشريين 2010-01-595). قمنا بتحليل التسجيلات من 20 مشاركًا صحيًا شابًا (20.4 ± 2.0 سنة ، يعني ± 12 أنثى). تم تسجيل تخطيط النوم خلال فترة 8 ساعات وكذلك خلال 5 دقائق من الراحة الهادئة مع إغلاق العينين قبل النوم وبعده. تم تسجيل البيانات على نظام Grass Technologies Comet XL (Astro-Med ، Inc ، West Warwick ، ​​RI) مع 19 قناة EEG باستخدام الإعداد القياسي 10-20 بالإضافة إلى ثلاثة تخطيط كهربية العضل (EMG) وأربعة تخطيط كهربائي للعين (EOG) ) أقطاب كهربائية في كانثي الخارجي. تمت الإشارة إلى EEG إلى الخشاءات الثنائية المرتبطة وتم رقمنتها عند 400 هرتز (0.1 إلى 100 هرتز Helfrich et al. ، 2018 Mander et al. ، 2015 Mander et al. ، 2014 Mander et al. ، 2013). تم إجراء مراحل النوم من قبل موظفين مدربين (BM) ووفقًا للإرشادات الحديثة (Iber et al. ، 2007).

    دراسة 4 - النوم داخل الجمجمة EEG

    أجريت الدراسة الرابعة في جامعة كاليفورنيا في المركز الطبي إيرفين. تم تضمين عشرة مرضى الصرع (ست إناث) يخضعون لتوطين ما قبل الجراحة الغازية لتركيز نوباتهم في هذه الدراسة. قدم جميع المرضى موافقة مستنيرة وفقًا للجان الأخلاقيات المحلية بجامعة كاليفورنيا في بيركلي وفي إيرفين (جامعة كاليفورنيا في بيركلي ، رقم بروتوكول لجنة حماية الأشخاص البشريين 2010-01-520 ، بروتوكول مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في إيرفين رقم 2014-1522 ، يعتمد UCB على UCI Reliance Number 1817) وقدم موافقتهم الكتابية قبل جمع البيانات. تراوحت أعمارهم بين 22 و 55 سنة (33.1 ± 11.5 سنة تعني ± SD). تم تحديد موضع القطب فقط من خلال المعايير السريرية (Ad-Tech ، SEEG: تباعد 5 مم بين الأقطاب الكهربائية Integra ، الشبكات: 1 سم ، 5 أو 4 مم تباعد). تم تسجيل البيانات باستخدام نظام تسجيل Nihon Kohden (مكبر صوت 256 قناة ، طراز JE120A) ، تمت ترشيحه تناظريًا فوق 0.01 هرتز وأخذ عينات رقميًا عند 5 كيلو هرتز. لتسهيل مراحل النوم ذات المعيار الذهبي ، تم تسجيل تخطيط كهربية القلب ، تخطيط كهربية القلب (ECG) من خمسة خيوط متزامنة وتخطيط كهربية القلب (EEG) بواسطة أقطاب نموذجية من الإعداد 10-20 اعتمادًا على توطين الأقطاب الكهربائية داخل الجمجمة ولكنها تتكون في الغالب من Fz و Cz و C3 و C4 وأوز. تم اشتقاق إشارة EMG بديلة من ECG و EEG عن طريق الترشيح عالي التمرير فوق 40 هرتز. تم إجراء مراحل النوم من قبل موظفين مدربين (BM) وفقًا للإرشادات الحديثة (Iber et al. ، 2007).

    معالجة البيانات

    دراسة 1 - تخدير فروة الرأس EEG

    تم استيراد البيانات إلى FieldTrip (Oostenveld et al. ، 2011) وتاريخها في 10 قطاعات. تحليل مكون مستقل (فاستيكا Hyvärinen ، 1999) لتنظيف البيانات من القطع الأثرية المنتظمة مثل ECG. تم إجراء مزيد من تنظيف البيانات يدويًا بعد فحصها بواسطة طبيب أعصاب (R.T.K.) وطبيب تخدير (JDL). في المتوسط ​​، كان لدى المرضى 1183 ± 81.42 حقبة مدتها عشر ثوانٍ منها 196 ± 103.19 كانت صاخبة (15.81 ± 3.15٪). لم يتم استبعاد أو إقحام أي قنوات. تمت الإشارة إلى البيانات باستخدام المتوسط ​​الشائع ، وتم الإهانة والتجاهل. تم تعريف فترات الاستيقاظ على أنها وقت قبل التحريض وبعد التخدير عندما استجاب المرضى بشكل موثوق للأوامر الشفهية لموظفي الدراسة. تم تعريف فترات التخدير على أنها الوقت بعد التحريض حتى إنهاء تطبيق البروبوفول.

    دراسة 2 - التخدير داخل الجمجمة EEG

    تم تسجيل البيانات بمعدل ترقيم 512 هرتز في ثمانية مرضى. تم تسجيل أربعة مرضى إضافيين بمعدل رقمنة 1024 هرتز ، وتم تقليل عينات مجموعات البيانات هذه إلى 512 هرتز. تم بعد ذلك استيراد البيانات إلى FieldTrip (Oostenveld et al. ، 2011) ، وتم تقسيمها إلى مقاطع مدتها عشر ثوانٍ وفحصها بواسطة طبيب أعصاب (R.T.K.) لمعرفة نشاط الصرع ثم تنظيفها يدويًا من آثار الصرع وغيرها من الآثار غير العصبية. تم تعريف حالة اليقظة على أنها وقت قبل بدء البروبوفول ، وتم تعريف التخدير على أنه الوقت بعد فقدان الوعي (عدم الاستجابة للأوامر الشفهية التي تم تقييمها من قبل موظفي الدراسة وطبيب التخدير). بعد دمج التصوير بالرنين المغناطيسي الذي يزن T1 قبل الزرع وفحص التصوير المقطعي بالكمبيوتر (CT) بعد الزرع ، تم تحديد الأقطاب الكهربائية تلقائيًا بواسطة أطلس دماغ متاح بشكل مفتوح (Freesurfer Fischl ، 2012) باستخدام مربع أدوات FieldTrip (Stolk et al. ، 2018) ويتم التحقق من صحتها من خلال الفحص اليدوي المستقل من قبل اثنين من أطباء الأعصاب (RTKRFH). تم التخلص من الاتصالات في المادة البيضاء أو الآفات. ثم تمت الإشارة إلى الإشارات المتبقية ثنائية القطب إلى جارها الجانبي ، وتم الإهانة منها وإبطال مفعولها.

    دراسة 3 - فروة الرأس أثناء النوم EEG

    تمت الإشارة إلى EEG إلى الخشاءات الثنائية المرتبطة وتم استيراد البيانات إلى EEGLAB (Delorme and Makeig ، 2004) وتم تقسيمها إلى قطاعات 5. تم فحص العهود التي تحتوي على قطع أثرية (مثل وميض العين أو الحركة) يدويًا ورفضها بواسطة مسجل مدرب (BM). لم يتم إهمال أو إقحام أي من القنوات. في المتوسط ​​، كان لدى المشاركين 5748.9 ± 10.01 من هذه العهود الخمس الثانية و 946.95 ± 542.68 منهم تم رفضهم (16.44 ± 2.98٪) ، مقارنةً بتسجيلات التخدير في فروة الرأس EEG. تم الإبلاغ عن البيانات من المشاركين في النوم الصحي من قبل وتم تنظيفها بطريقة قابلة للمقارنة (Helfrich et al.، 2018 Mander et al.، 2015 Mander et al.، 2014 Mander et al.، 2013). لمزيد من التحليل في MATLAB (إصدار MATLAB R2018b ، The MathWorks ، Inc ، ناتيك ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة) ، تم بعد ذلك استيراد البيانات إلى FieldTrip (Oostenveld et al. ، 2011).

    دراسة 4 - النوم داخل الجمجمة EEG

    تم استيراد البيانات إلى FieldTrip (Oostenveld et al. ، 2011) ، وتم تصغيرها إلى 500 هرتز وتقسيمها إلى مقاطع 30 ثانية لتحليل البيانات اللاحقة. تم إجراء التوطين التشريحي عن طريق دمج فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) قبل الزرع باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي بعد الزرع ووضع العلامات التلقائية واليدوية على موضع القطب الكهربائي (Stolk et al. ، 2018). كما ذكر أعلاه ، تم التخلص من المادة البيضاء المصابة بالصرع والقنوات ذات المشغولات اليدوية الأخرى. تم الرجوع إلى البيانات ذات القطبين ، والإهانة والابتعاد.

    التحليل الطيفي

    (1) للحصول على متوسط ​​أطياف القدرة ، بعد إزالة القطع الأثرية ، تم تقسيم البيانات إلى مقاطع مدتها عشر ثوان للتخدير و 30 مقاطع للنوم. (2) تم إنجاز تحليل الوقت والتردد باستخدام تحويل فورييه السريع (مطمفت، FieldTrip (Oostenveld et al. ، 2011) من 0.5 هرتز إلى 45 هرتز في خطوات 0.5 هرتز. اقتصر التحليل على 45 هرتز بسبب ضوضاء الخط عند 50 هرتز في تسجيلات أوسلو ثم تم اعتماده في جميع الدراسات المتتالية من أجل الاتساق. للحصول على تقديرات طيفية موثوقة ، استخدمنا نهجًا متعدد الأوراق (Prerau et al. ، 2017) استنادًا إلى تسلسل متسلسل منفصل منفصل (dpss التخدير: 9 تناقص التدريجي لمقاطع 10 ثوانٍ ، بدون تداخل ، تجانس تردد من سكون ± 0.5 هرتز: 29 تناقص التدريجي لشرائح 30 ثانية ، بدون تداخل ، تجانس تردد ± 0.5 هرتز). (3) تم حساب متوسط ​​طيف الطاقة لكل حالة على جميع عينات الحالة (الاستيقاظ والتخدير أو الراحة ، والاستيقاظ ، ونوم حركة العين غير السريعة ، ومرحلة النوم 3 (N3) ، ونوم حركة العين السريعة (REM)) ، والقنوات والموضوعات (الشكل 1 ب ، ج والشكل 2 ب ، ج). لمقارنة أفضل ، تصورنا التأثير على مستوى فروة الرأس. للدراسة 2 لم تكن التسجيلات المتزامنة لـ EEG متاحة.

    من أجل تحليل التحكم لتأثير طول المقطع وعدد التناقص التدريجي على تقدير المنحدر الطيفي ، تم تقسيم تسجيلات EEG الخاصة بالتخدير إلى مقاطع 30 ثانية ، بينما تم تقسيم النوم إلى شرائح 10 ثوانٍ. تم إجراء تحليل التردد الزمني مرة أخرى باستخدام FieldTrip مطمفت مع تجانس تردد ± 0.5 هرتز و dpss التناقص التدريجي ينتج عنه 29 للتخدير و 9 للنوم. لاحظ أن عدد التناقص التدريجي هو نتيجة مباشرة لاختيار طول المقطع وتجانس التردد (Prerau et al. ، 2017):

    مقارنة بين الأوراق المتعددة ، والمستدقة المفردة ، والرسم الدوري ، وطريقة ويلش

    لمقارنة نسب الإشارة إلى الضوضاء لحسابات القدرة المختلفة (الشكل 2 - ملحق الشكل 6) ، تم حساب التحلل الطيفي متعدد الأوراق (Prerau et al. ، 2017) على النحو المبين أعلاه. لجميع العمليات الحسابية الإضافية ، تم تقسيم بيانات النوم إلى شرائح 30 ثانية.

    بالنسبة لتحليل الاستدقاق الفردي ، تم حساب القدرة باستخدام تحويل فورييه السريع مطمفت من FieldTrip (Oostenveld et al. ، 2011) مع عدم وجود تداخل بعد تطبيق Hanning تفتق. تم الحصول على التقديرات الطيفية بين 0.5 و 45 هرتز في خطوات 0.5 هرتز.

    لحساب مخطط الدورة الشهرية ، استخدمنا MATLAB الدورة الشهرية م الوظيفة (MATLAB و Signal Processing Toolbox Release R2018b ، MathWorks ، Inc ، الولايات المتحدة الأمريكية) والنافذة المستطيلة الافتراضية وعدد النقاط كما هو محدد بواسطة معدل أخذ العينات البالغ 400 هرتز. للحصول على نفس العدد من الملاحظات كما هو الحال في النهجين المتعدد والمفرد التدريجي ، تم اختيار الترددات الأقرب إلى تلك المختارة في نهج التدرج المتعدد والمفرد أعلاه (0.5 إلى 45 هرتز في خطوات 0.5 هرتز) لمزيد من التحليل .

    بالنسبة لطريقة ويلش ، تم حساب الطاقة بحجم نافذة 30 ثانية ولا يوجد تداخل ينتج عنه نافذة هامنج واحدة تستخدم MATLAB’s pwelch.m الوظيفة (MATLAB و Signal Processing Toolbox Release R2018b ، MathWorks ، Inc ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحديد عدد النقاط بواسطة معدل أخذ العينات. مرة أخرى ، تم اختيار الترددات الأقرب إلى نهج الاستدقاق المتعدد / الأحادي لمزيد من التحليل لتمكين المقارنة المباشرة لنسب الإشارة إلى الضوضاء (SNR).

    تم حساب SNR بقسمة متوسط ​​القدرة لكل تردد في كل قناة على الانحراف المعياري لهذا التردد والقناة.

    تقدير المنحدر الطيفي

    حسبنا الميل الطيفي عن طريق تركيب خط انحدار خطي على طيف الطاقة في سجل الدخول المسافة بين 30 و 45 هرتز ، حيث تبين سابقًا أن هذا النطاق يرتبط بشكل أفضل بالتغيرات في الإثارة في القوارض والقرود ، وكذلك مع نسب تثبيط الإثارة المختلفة في عمليات المحاكاة (Gao et al. ، 2017). تماشياً مع التقارير السابقة ، استبعدنا الترددات المنخفضة التي تحتوي على نشاط تذبذب قوي ، والذي قد يشوه التوافق الخطي وكذلك النطاق الذي يزيد عن 50 هرتز ، وهو ما يربكه ضوضاء الخطين (50 هرتز في أوروبا ، 60 هرتز في الولايات المتحدة) ) وكذلك القطع الأثرية للعضلات ذات النطاق العريض.

    ثم قمنا بتكييف هذا النطاق مع حساب المنحدر في الدراسات الأخرى لأسباب تتعلق بالاتساق. لحساب تقدير زمني تم حله للمنحدر الطيفي ، قمنا بحساب أفضل خط مناسب للقطاعات العشرة (التخدير) أو 30 (السكون) من أطياف القدرة متعددة المستدارات (انظر أعلاه) في سجل الدخول الفضاء باستخدام تركيب منحنى متعدد الحدود (بولي فيت م ، MATLAB و Curve Fitting Toolbox Release R2015a ، The MathWorks ، Inc ، ناتيك ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة). أظهر موضوع واحد في الدراسة 3 (النوم EEG) مستوى ضوضاء مفرطًا أثناء اليقظة ، لذلك ، كان لا بد من استبعاد بياناته من جميع مقارنات المنحدرات إلى اليقظة.

    تحليلات التحكم في تقدير المنحدر الطيفي

    لتقييم الترددات المركزية المختلفة للانحدار الخطي ، تم تقدير المنحدر الطيفي من تسجيلات النوم داخل الجمجمة (الدراسة 4) كدالة للترددات المركزية المختلفة (± 10 هرتز حول التردد المركزي بدءًا من 20 حتى 150 هرتز) وتناسب مختلف أطوال (من 30 هرتز فصاعدًا مع زيادة 10 هرتز في طول الملاءمة حتى 100 هرتز) باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح أعلاه (الشكل 2 - ملحق الشكل 5).

    علاوة على ذلك ، تم تقدير المنحدر الطيفي من الترددات المنخفضة في تسجيلات مختلفة: (1) تخدير فروة الرأس EEG (الدراسة 1) في نطاق 1 إلى 40 هرتز كما تم الإبلاغ سابقًا (كولومبو وآخرون ، 2019) و (2) في فروة الرأس أثناء النوم (EEG) ( دراسة 3) من 1 إلى 5 هرتز بطول متزايد إضافي قدره 5 هرتز لكل نوبة بعد خصم المكونات التذبذبية من طيف القدرة عن طريق إعادة التشكيل غير المنتظم (IRASA Wen and Liu، 2016a Figure 2 - ملحق الشكل 5c). كان الأساس المنطقي لاستخدام هذه الطريقة هو استبعاد التذبذبات القوية منخفضة التردد ، مثل الموجات البطيئة ، والتي يمكن أن تشوه تقدير المنحدر.

    علاوة على ذلك ، قمنا بتقدير المنحدر الطيفي من نطاق 30 إلى 45 هرتز باستخدام خوارزميتين إضافيتين ، حزمة FOOOF (Haller et al. ، 2018) وخوارزمية eBOSC (Kosciessa et al. ، 2020a) في كل من التخدير وفروة الرأس أثناء النوم EEG (دراسة) 1 و 3). بينما ينفذ eBOSC انحدارًا خطيًا في سجل الدخول الفضاء باستخدام MATLAB's روبست فيت م، يقوم FOOOF بتقدير كل من الجزء التذبذب وغير الدوري من طيف الطاقة مع نموذج مناسب: أولاً يتم إجراء ملاءمة أسية لطيف الطاقة في شبه سجل الفضاء ، ثم يتم طرح هذا الملاءمة من الكثافة الطيفية للقدرة (PSD). يتم التعامل مع الإشارة المتبقية على أنها مزيج من التذبذبات والضوضاء وتتناسب بشكل متكرر مع نوبات غاوسية متعددة لاكتشاف القمم التذبذبية المحتملة حتى الوصول إلى أرضية الضوضاء. ثم يتم التحقق من صحة القمم المكتشفة مقابل إشارة التذبذب / الضوضاء المختلطة وطرحها من PSD الأصلي. يتم بعد ذلك احتواء الإشارة المتبقية الجديدة مرة أخرى للحصول على تقدير أفضل للإشارة غير الدورية. يتم بعد ذلك دمج كل من النوبات متعددة الجاوس والملاءمة غير الدورية المحسّنة في نموذج (قارن بالشكل 3 (هالر وآخرون ، 2018). عندما لا تحتوي PSD على انحناء ، يُسمى أيضًا الركبة ، في الإشارة غير الدورية ، ثم الخوارزمية تعادل تركيب خط في سجل الدخول الفضاء (هالر وآخرون ، 2018).

    المعلومات المتبادلة

    المعلومات المتبادلة (MI) هي مقياس نظري للمعلومات ، والذي يحدد الاعتماد المتبادل للإشارتين ، وتحديداً كمية المعلومات المكتسبة حول متغير واحد عند مراقبة الآخر (Quian Quiroga and Panzeri ، 2009). هذا مفيد بشكل خاص للإشارات غير الخطية المحظورة. تم تعريف المعلومات المتبادلة بين الإشارتين X و Y على أنها

    حيث p (x ، y) تصور دالة الاحتمال المشترك و p (x) و p (y) تشير إلى احتمالات الفئة. تم تطبيع الاحتمالات من خلال مجموعها. لتحليل MI (الشكل 2 ب ، الشكل 2 - مكملات الشكل 2 و 5 و 8 و 10) ، قمنا بتقسيم المنحدر الذي تم حله بمرور الوقت إلى مقاطع 30 ثانية (تم تنظيم التنويم المغناطيسي في فترات 30 ثانية) وقمنا بتقسيمه إلى خمس صناديق (استيقظ) ، REM ، N1 ، N2 ، N3) باستخدام تقدير م وظيفة MATLAB Signal Processing Toolbox Release R2015a (MathWorks Inc ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حساب المعلومات المتبادلة باستخدام معلومات متبادلة وظيفة من MATLAB Central File Exchange (Dwinell ، 2010).

    تحليل Beamformer

    حددنا مصدر فرق المنحدر بين اليقظة والنوم في مخطط كهربية الدماغ لفروة الرأس (الدراسة 3 ، n = 19 كان لا بد من استبعاد مريض واحد بسبب تجارب الاستيقاظ غير الكافية الشكل 2 - ملحق الشكل 3). تمت إعادة بناء المصادر القشرية لبيانات EEG على مستوى المستشعر باستخدام نهج تشكيل الحزم LCMV (الحد الأدنى للقيود الخطية) (Van Veen et al. ، 1997) لتقدير السلسلة الزمنية لكل فوكسل على الشبكة. تم استخدام قالب T1 قياسي للتصوير بالرنين المغناطيسي ونموذج رأس BEM (طريقة عنصر الحدود) من مربع أدوات FieldTrip (Oostenveld et al. ، 2011) لإنشاء شبكة قالب ثلاثية الأبعاد بمسافة 1 سم في مساحة MNI القياسية. تم اشتقاق موقع القطب الكهربي من قالب قياسي 10/20 من مربع أدوات FieldTrip (Oostenveld et al. ، 2011). قبل الإسقاط المصدر ، كانت بيانات مستوى المستشعر عبارة عن متوسط ​​مرجعي مشترك وتم تقسيمها إلى مقاطع 30 ثانية. لتقليل الحمل الحسابي ، اخترنا مقطع بيانات ثانيتين من مركز كل حقبة لإنشاء مصفوفة التغاير. تم بعد ذلك حساب المرشح المكاني LCMV باستخدام مصفوفة التغاير لبيانات EEG على مستوى المستشعر مع تنظيم 5 ٪. تم إنشاء المرشحات المكانية لكل موقع من مواقع الشبكة بشكل منفصل لقمع النشاط من جميع المصادر الأخرى إلى أقصى حد. ثم خضعت الدورات الزمنية الناتجة في فضاء المصدر لتحليل طيفي باستخدام تحويل فورييه بعد تطبيق نافذة هانينج. ثم تم تقدير انحدار PSD لكل مقطع باستخدام الانحدار الخطي في النطاق من 30 إلى 45 هرتز كما هو موضح من قبل. تم طرح قيم الانحدار المتوسطة أثناء النوم من متوسط ​​الانحدار أثناء الاستيقاظ عند كل فوكسل في مساحة المصدر ثم استيفاء المصدر على دماغ قالب قياسي في مساحة MNI.

    لقد استخدمنا نهجًا قائمًا على مناطق الاهتمام (ROI) يركز على المناطق الفرعية لقشرة الفص الجبهي (PFC) نظرًا لأن توطين مصدر موثوق لنشاط الفص الصدغي الإنسي (MTL) باستخدام 19 قناة لا يزال يمثل تحديًا. تمشيا مع نتائجنا من دراسة النوم داخل الجمجمة (الدراسة 4 ، الشكل 2C والشكل 2 - ملحق الشكل 4) ، قمنا بتعريف mPFC و PFC الظهراني (dlPFC) كعائد على الاستثمار. لتحديد عائد الاستثمار على مستوى المصدر ، استخدمنا أطلس العلامات التشريحية الآلية (AAL) كما هو مطبق في FieldTrip (Oostenveld et al. ، 2011). يشمل ROI mPFC المناطق التالية: 23 و 24 - "Frontal_Sup_Medial_L و R" و 25 و 26 - "Frontal_Med_Orb_L و R" و 27 و 28 - "Rectus_L و R" و 31 و 32 - Cingulum_Ant_L و R ". يتكون ROI dlPFC من ملصقات أنسجة أطلس التالية: 3 و 4 - 'Frontal_Sup_L و R' ، 7 و 8 - 'Frontal_Mid_L و R' ، 11 و 12 - 'Frontal_Inf_Oper_L and R' ، 13 و 14 - 'Frontal_Inf_Tri_L and R' و 15 و 16 "Frontal_Inf_Orb_L و R".

    تحليل التصنيف

    استخدمنا تحليل تمييزي خطي (LDA) لتقييم ما إذا كانت قوة الموجة البطيئة أو المنحدر الطيفي مؤشراً أفضل لليقظة أو النوم (الشكل 1 - ملحق الشكل 4 ، الشكل 3 أ - ج). استخدمنا نهج التحقق من صحة النموذج الذي تم إجراؤه على نموذج واحد والذي تكرر 50 مرة بعد أخذ عينات عشوائية من عدد متساوٍ من تجارب النوم وحركة العين السريعة لموازنة عدد العينات (تصنيف م، MATLAB و Statistics and Machine Learning Toolbox Release R2015a ، MathWorks Inc ، الولايات المتحدة الأمريكية). ثم تم إخراج كل عينة من توزيع عينات فرعية من مجموعة بيانات التدريب مرة واحدة. تم تدريب مصنف LDA على العينات المتبقية واختباره على عينة الاختبار المتبقية. ثم تم تقييم أداء المصنف كنسبة مئوية صحيحة. كان لا بد من استبعاد اثنين من 20 مشاركًا في EEG أثناء النوم بسبب عدم كفاية عدد تجارب الاستيقاظ. تم تحويل أداء LDA (لوجيت م من BioSig Toolbox (Schlogl and Brunner ، 2008) ومتوسط ​​عبر القنوات قبل المقارنة الإحصائية.

    النموذج الخطي العام متعدد المتغيرات

    من أجل نمذجة المساهمات الفريدة بالإضافة إلى التفاعل بين قوة الموجة البطيئة (& lt1.25 هرتز) والمنحدر الطيفي في التنبؤ بحالات الإثارة ، قمنا أولاً بقياس كل من المعلمتين عن طريق درجة z ثم حسبنا خطي عام نموذج باستخدام MATLAB فيتلم م الوظيفة (MATLAB و Statistics and Machine Learning Toolbox Release R2018b ، MathWorks Inc ، الولايات المتحدة الأمريكية). أتاحت هذه الطريقة إمكانية نمذجة كل من التأثيرات الرئيسية بالإضافة إلى التفاعل بين المتنبئين (الشكل 3d-f). بشكل حاسم ، استخدمنا تصميمًا غير متوازن ، والذي يعامد ضمنيًا مساهمة العوامل المختلفة ، وبالتالي ، يقطر التباين الموضح الفريد غير المتداخل (Siegel et al. ، 2015) ، والذي تم قياسه لاحقًا عن طريق حجم التأثير (eta تربيع).

    تقدير الانحدار الطيفي أثناء الموجة البطيئة

    تم اكتشاف أحداث الموجة البطيئة (الشكل 4 ، الشكل 2 - ملحق الشكل 10) لكل قناة بناءً على الخوارزميات المعمول بها (Helfrich et al. ، 2018 Staresina et al. ، 2015): تم ترشيح ممر الموجة الأولية بين 0.16 و 1.25 هرتز ولم يتم الكشف عن أي معابر. ثم تم اختيار الأحداث باستخدام وقت (مدة 0.8 إلى 2 ثانية) ومعيار السعة (75٪ المئوية). ثم تم تحديد البيانات الأولية بالنسبة إلى قاع الموجة البطيئة (± 2.5 ثانية). تم حساب تحلل التردد الزمني في نوافذ زمنية تبلغ 500 مللي ثانية مع تداخل 250 مللي ثانية باستخدام FieldTrip (Oostenveld et al. ، 2011) (مطمفت، تجانس تردد ± 2 هرتز واستدقاق dpss واحد). تم حساب المنحدر الطيفي بأفضل خط ملائم في هذه النوافذ الزمنية سجل الدخول مسافة بين 30 و 45 هرتز باستخدام تركيب منحنى متعدد الحدود (بولي فيت م ، MATLAB و Curve Fitting Toolbox Release R2015a ، MathWorks Inc ، الولايات المتحدة الأمريكية).

    الاختبار الإحصائي

    تمت مقارنة المنحدر الطيفي لحالة اليقظة والتخدير باستخدام اختبار الطالب t للعينات المقترنة (الشكل 1 ب ، ج). ثم تمت مقارنة قيم t التي تمت ملاحظتها مقابل توزيع بديل بعد إعادة حساب إحصائية الاختبار 10000 مرة باستخدام تسميات مختلطة عشوائيًا (تسمى التقليب اختبار تي في المخطوطة). تم تصحيح اختبارات Bonferroni اللاحقة لإجراء مقارنات متعددة.

    لمقارنة ثلاث حالات (مستيقظ ، NREM و REM) ، استخدمنا Greenhouse-Geisser المصحح في اتجاه واحد لتحليل المقاييس المتكررة للتباين (الشكل 2 ب و ج RM-ANOVA). اعتمدنا نهجًا مشابهًا لـ التقليب اختبار تي، حيث تمت مقارنة إخراج RM-ANOVA الأصلي بالتوزيع العشوائي بعد التقليب العشوائي لتسميات الشرط 10000 مرة (اختبار التقليب ANOVA للتدابير المتكررة). تم حساب حجم التأثير باستخدام Cohen's d.

    لتقييم المدى المكاني للتأثيرات المرصودة في EEG ، قمنا بحساب اختبارات التقليب القائمة على الكتلة لتصحيح المقارنات المتعددة كما هو مطبق في FieldTrip (Oostenveld et al. ، 2011) (طريقة مونت كارلو تعظم المعيار 1000 تكرار). تم الحصول على توزيع التقليب عن طريق خلط تسميات الحالة عشوائيًا ثم مقارنتها بالتوزيع الفعلي للحصول على تقدير الأهمية. تتشكل المجموعات المكانية عن طريق عتبة اختبارات t المستقلة لاختلافات المنحدرات بين الاستيقاظ والتخدير (الشكل 1 ب) أو الاستيقاظ والنوم (الشكل 2 ب) بقيمة p & lt 0.05. تم تصحيح جميع النتائج من Bonferroni لمقارنات متعددة. من أجل التحكم في مخطط كهربية العضل باعتباره ارتباكًا محتملاً في مخطط كهربية الدماغ أثناء النوم (الدراسة 3) ، استخدمنا ارتباطًا جزئيًا (سبيرمان) أدى إلى فصل منحدر مخطط كهربية العضل عن الارتباط قبل حساب اختبار التقليب القائم على الكتلة (الشكل 2 - الشكل الملحق 2 ب). تم تحويل معاملات الارتباط (قيم r) إلى قيم t باستخدام الصيغة التالية (N = عدد الموضوعات):

    للتقييم الإحصائي للمعلومات المتبادلة (MI) ، استخدمنا اختبار بديل (الشكل 2 ب ، الشكل 2 - ملحق الشكل 2 أ). للحصول على توزيع بديل من البيانات المرصودة ، استخدمنا إجراء تبديل عشوائي للكتل (Aru et al. ، 2015 Canolty et al. ، 2006). كان عدد التكرارات مساويًا لعدد مراحل النوم المتاحة. في كل تكرار ، أعدنا حساب MI لهذه التنوعات المنومة بتبديل الكتل مع المنحدر المحدد للوقت الذي تم حله لإنشاء توزيع بديل يمكننا من خلاله مقارنة ملاحظتنا الأصلية. لمقارنة النتائج عبر الموضوعات ، قمنا بتسجيل القيم عن طريق طرح متوسط ​​التوزيع البديل من MI المرصود والقسمة على الانحراف المعياري للتوزيع البديل. لاحظ أن z = 1.96 يعكس قيمة p ثنائية الذيل غير مصححة تبلغ 0.05 ، بينما تشير الدرجة z لـ & gt2.8 إلى قيمة p مهمة مصححة من Bonferroni (p & lt0.05 / 19 قناة = 0.0026). تم تحويل قيم z إلى قيم p للتصوير الطبوغرافي (الشكل 2 ب الشكل 2 - ملحق الشكل 2 أ) بناءً على دالة التوزيع التراكمي العادية (ثنائية الذيل).

    الاتصال

    لتحليل الاتصال الأمامي الجداري (الشكل 2 - ملحق الشكل 10) ، نختار القطب الكهربائي Fz و Pz في تسجيلات EEG الخاصة بالنوم (الدراسة 3 n = 20) لحساب حجم التماسك التربيعي من ترددات من 0.1 إلى 64 هرتز في 0.1 خطوات هرتز باستخدام ملف mscohere.m وظيفة من MATLAB Signal Processing Toolbox (الإصدار R2015a ، MathWorks ، Inc ، الولايات المتحدة الأمريكية) كما هو موضح سابقًا (Pal et al. ، 2016 Pal et al. ، 2015). لاحظ أن تقديرات التماسك تعكس تغيرات الطاقة وكذلك التغييرات في تزامن الطور. لذلك ، قمنا أيضًا بحساب قيمة قفل الطور (PLV) وارتباطات السعة (rho) لفصل تأثيرات الطور والطاقة ، على التوالي. لخصم تأثيرات انتشار الحجم ، قمنا بحساب PLV التخيلي (Nolte et al. ، 2004) (iPLV) وارتباطات الطاقة المتعامدة (Hipp et al. ، 2012) (rhoortho).

    قمنا بعد ذلك بقياس المعلومات المتبادلة (MI انظر أعلاه) لمقارنة مدى جودة التقاط النتائج للتغييرات بين مراحل النوم المختلفة خلال الليل (Quian Quiroga and Panzeri ، 2009). بالنسبة لهذا التحليل ، استخدمنا فقط قيم الانحدار للإلكترود Fz (كما كنا نحسب المقاييس الأخرى في Fz-Pz) وحددنا ثيتا من 4 إلى 10 هرتز التناظرية إلى Pal et al. ، 2016 Pal et al. ، 2015.



تعليقات:

  1. Fitz James

    بالتاكيد. أنا أتفق معك.

  2. Akil

    هل هناك فقط بريق لامع أو تغطية شاملة على جدول الأعمال؟ ثم لدي الكثير من الأفكار ، لكنني لا أعرف كيفية تصورها ...

  3. Thurle

    برأيي أنك أخطأت. دعنا نناقش. اكتب لي في رئيس الوزراء ، سوف نتحدث.

  4. Kagazshura

    يخرج الدعائم ، من نوع ما

  5. Kazil

    سأكون مريضا مع أولئك الموجودين في السرير.

  6. Pickford

    I think you will allow the mistake. I offer to discuss it. Write to me in PM.



اكتب رسالة