معلومة

فتيلة VPg لتكاثر فيروسات الحمض النووي الريبي

فتيلة VPg لتكاثر فيروسات الحمض النووي الريبي



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقوم بعمل عرض تقديمي حول تكرار SARS-CoV-2 لفئة الكيمياء الخاصة بي ، ووجدت أنه لتكرار RNA الخاص به ، يستخدم الفيروس بوليميريز RNA المعتمد على RNA ، والذي يتم تحضيره بواسطة VPg التمهيدي. نظرًا لأن العرض التقديمي مخصص لفصل الكيمياء ، وليس لصف البيولوجيا الجزيئية ، أود أن أعرف الكيمياء وراء الطريقة التي تعمل بها البادئات.

لقد حاولت البحث في المعلومات على الإنترنت ، لكن لم أتمكن من تحديد المعلومات التي أحتاجها.


على الرغم من أنه من المحتمل أن يتم استبعاد هذا السؤال من الموضوع باعتباره واجبات منزلية غير خاضعة للبحث ، إلا أنني أتخيل ألا يكون جميع القراء على دراية بأداة VPg التمهيدية لتكرار الحمض النووي الريبي الفيروسي. لذلك سوف أقترح بعض الجوانب الكيميائية لهذه العملية التي قد يتم تضمينها في العرض ، والتعليق على العملية نفسها.

بعض السمات الكيميائية لتكاثر الحمض النووي الريبي الفيروسي VPg

  1. التفاعل الكيميائي. هذا لا يختلف عن العديد من التفاعلات الأخرى التي تنطوي على بوليميراز الحمض النووي الريبي. إنه ينطوي على تفاعل NTP مع 3'OH من الريبوز على سلسلة RNA متنامية ، وتشكيل رابطة فسفودايستر ، وبالتالي تمديد السلسلة. يُطلق على سلسلة الحمض النووي الريبي المتنامية اسم التمهيدي لأنه مطلوب لبدء الإضافة في العديد من الحالات ، ولكن في حالة العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي أحادية الشريطة ، فإن البدء الفعلي لخيط جديد يستخدم مادة أولية مكونة من ببتيد صغير يمكن الوصول إليه باستخدام U تم إرفاق المخلفات. يتم تقديم المخططات البسيطة لهذه العملية بشكل عام لبوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي ويمكن العثور عليها في النصوص القياسية ، على سبيل المثال بيرج وآخرون. الشكل 5.22

  2. آلية التفاعل. يتم تحفيز هذا التفاعل بواسطة إنزيم يشارك في التفاعل. يتم تلخيص آلية التحفيز في مرفق EBI (حيث يمكن العثور على الرسوم البيانية) على النحو التالي:

تحفز بوليميرات الحمض النووي الريبي الهجوم المحب للنيوكليوزيد للنيوكليوزيد 5-ثلاثي الفوسفات المرتبط بواسطة 3'-hydroxyl من تمهيدي RNA ، مما يؤدي إلى دمج أحادي الفوسفات النوكليوزيد في الحمض النووي الريبي وإطلاق بيروفوسفات. يُعتقد أن هذا يحدث باستخدام تحفيز ثنائي المعدن. في RNA polymerase II ، يتم تنسيق اثنين من أيونات المغنيسيوم بواسطة أربعة أسبارتات (3'OH من RNA اقترح أيضًا التنسيق بشكل ضعيف مع Mg2+أ). ملغ2+يقترح A لخفض pكأ حول الهيدروكسيل المهاجم بينما Mg2+هناك B لتحقيق الاستقرار في الشحنات السالبة أثناء الحالة الانتقالية ...

  1. الديناميكا الحرارية للتفاعل. يعني كسر أحد روابط الفوسفوديستر وتشكيل أخرى أن التفاعل يكون إلى حد ما في حالة توازن (لا يوجد تغيير في طاقة جيبس ​​الحرة). أحد أسباب عدم انعكاسه هو أن البيروفوسفات الناتج يتحلل بالماء في الخلية إلى أورثو فوسفات ، وهو أمر لا رجعة فيه لأن تغير الطاقة الحرة في هذا التفاعل يُفقد كحرارة.

  2. ارتباط الهيدروجين بالقالب. يتضمن التفاعل نسخ حبلا قالب ، وأساس هذه الخصوصية هو ارتباط Watson-Crick الهيدروجين بين قاعدة القالب و NTP الوارد. ومع ذلك ، على وجه التحديد بالنسبة إلى VPg التمهيدي ، هناك رابطة هيدروجينية لبقايا U بنهاية حبلا القالب. (يجب أن يكون من السهل العثور على مخططات الرابطة الهيدروجينية للاتحاد الأفريقي.)

  3. الارتباط الكيميائي للبرايمر VPgUU. تضاف بقايا حمض اليوريليك إلى ببتيد VPg في مجموعة الهيدروكسيل لبقايا التيروزين في تفاعل يتم تحفيزه بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي الفيروسي. تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن العديد من بقايا الأحماض الأمينية للبروتينات خاملة كيميائيًا ، فإن الأحماض الأمينية الهيدروكسي لها إمكانات تفاعلية ، وعلى الأخص في كونها فسفرة.

نقطة أوسع للتفكير

أحد الأسئلة التي يثيرها هذا هو سبب الحاجة إلى بروتين - VPg - كعامل مساعد لبادئ الحمض النووي. ستكشف القراءة الإضافية عن هذا الموضوع أن هذا البروتين يتفاعل فعليًا مع أجزاء مختلفة من الحمض النووي الريبي الفيروسي أثناء الحصول على بقايا Uridylate واختيار AA حيث يجب أن يرتبط. التفاعلات الكيميائية مع الحمض النووي الريبي والبروتينات الأخرى هنا هي التفاعلات غير التساهمية الضعيفة - الروابط الهيدروجينية ، تفاعلات فان دير وولز وبعض التفاعلات الأيونية - التي هي نموذجية للبروتينات. بدلاً من أن يكون ضعفهم سببًا لاعتبارهم غير مهمين ، فإن مثل هذه التفاعلات ضرورية لكيمياء الحياة لأن ضعفهم الشديد يعني أنهم يستطيعون ذلك. أن تكون مكسورة وكذلك مصنوعة. التفاعلات قابلة للعكس ، مما يؤدي إلى ذاته خاصية ديناميكية تجسد الحياة. هم جديرون باهتمام الصيدلي.


يمكن أن يحدث تخليق الحمض النووي بطريقتين ، باستخدام قالب أو بدونه. في معظم الأنظمة البيولوجية ، يكون تركيب القوالب هو الذي يحدث لأنه الطريقة الوحيدة لتكرار المعلومات الجينومية. بالنسبة لتخليق الحمض النووي القائم على القالب في الأنظمة البيولوجية (كونه من DNA أو RNA) ، يمكن للأنزيمات التي تقوم بالتفاعلات استخدام مادة مفردة تقطعت بهم السبل (في حالة فيروس ssDNA أو فيروس ssRNA) ومع ذلك فإنها لا تزال بحاجة إلى منطقة صغيرة من الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل الربط والبدء في البلمرة ، وإلا يمكن أن يبدأ التوليف في أي مكان في خيط القالب والذي لن يكون مفيدًا بشكل خاص ، ومن ثم ترتبط البادئات والبوليميرات بالمنطقة المزدوجة التي تقطعت بهم السبل وتبدأ البلمرة دائمًا بإضافة نيوكليوتيدات جديدة إلى الطرف 3 'من حبلا التمهيدي التي تعتبر مكملة للنيوكليوتيدات في خيط القالب. عادةً لا يحدث تخليق جزيئات RNA جديدة في الخلايا الحية مع قالب RNA (لا يوجد عادةً بوليميريز RNA معتمد على RNA ، وهناك استثناءات ولكنها عادةً ما تكون نتيجة لعدوى فيروسية سابقة) ، ولكن فقط باستخدام قالب DNA للإنتاج الرسول / النقل / الحمض النووي الريبي الريبوزومي. في حالة فيروس COVID و othe + strand RNA ، يجب على الفيروس ترميز RNA polymerase وأيضًا إنتاج مادة أولية من شأنها إنشاء منطقة مزدوجة تقطعت بهم السبل تسمح بتوليف RNA.


مجمعات النسخ المتماثل لفيروسات الحمض النووي الريبي

حقوق النشر: © 2010 تاو ، يي. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ بأي وسيلة ، بشرط ذكر المؤلف الأصلي والمصدر.

التمويل: لم يتلق المؤلفون أي تمويل محدد لهذه المخطوطة.

تضارب المصالح: وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.

غالبية الفيروسات التي تصيب الحيوانات والنباتات اليوم هي فيروسات RNA [1]. هناك فيروسات RNA مزدوجة السلسلة (ds) مع جينومات الرنا المزدوج الجديلة ، بالإضافة إلى فيروسات الحمض النووي الريبي (+) و (-) التي يكون جينوماتها من الحمض النووي الريبي أحادي الجديلة (ss) ذات قطبية موجبة أو سالبة. تحتوي فيروسات الحمض النووي الريبي على جينومات صغيرة نادرًا ما يتجاوز حجمها 30 كيلو بايت ، ويتم استخدام جزء كبير من جينوماتها لتشفير البروتينات المشاركة في تكاثر الحمض النووي الريبي الفيروسي. يتم تحفيز تخليق الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي (RdRp) ، والذي يفتقر إلى أي نشاط تدقيق. على الرغم من أن تفاصيل تكاثر الحمض النووي الريبي تختلف اختلافًا كبيرًا بين الفيروسات ، إلا أن المبادئ المشتركة موجودة بوضوح في تنظيم آلية النسخ المتماثل لفيروسات الحمض النووي الريبي المختلفة.


لماذا تمت دراسة تكرار فيروس شلل الأطفال لأكثر من 50 عامًا

فيروس شلل الأطفال هو العامل المسبب للمرض لشلل الأطفال ، وهو شلل رخو حاد يصيب 1٪ -2٪ من المرضى المصابين ، وفي حالات نادرة ، يتسبب في الوفاة بشلل العضلات التي تتحكم في الحلق أو التنفس. من السمات البارزة للعدوى الإعاقات مدى الحياة التي قد تؤثر على الناجين من المرض الحاد. كان هذا الفيروس (ثلاثة أنماط مصلية) الذي ينتقل عن طريق البراز - الفموي والشفوي - أحد أكثر مسببات الأمراض رعباً في البلدان الصناعية خلال القرن العشرين ، حيث أثر على مئات الآلاف من الأطفال كل عام ، عن طريق تفشي المرض خلال أشهر الصيف الدافئة. على الرغم من وجود لقاحات عالية الفعالية للسيطرة على شلل الأطفال ، إلا أنه لا يزال مستوطنًا في عدد قليل من البلدان ، والتي يستمر انتشارها وتفشيها في جميع أنحاء العالم. منذ اكتشاف فيروس شلل الأطفال في عام 1908 ، تمت دراسته بشكل مكثف لفهم هذا العامل الممرض الهائل والتحكم فيه بشكل أفضل. ومع ذلك ، فإن تاريخ فيروس شلل الأطفال لا يقتصر على مكافحة المرض. لعبت دراسات تكرار فيروس شلل الأطفال أيضًا أدوارًا مهمة في تطوير علم الفيروسات الحديث منذ أن كان علماء شلل الأطفال ، وبشكل عام ، علماء الفيروسات البيكورنافية روادًا في العديد من مجالات علم الفيروسات الجزيئي. كان فيروس شلل الأطفال ، على سبيل المثال ، أول فيروس RNA حيواني يتم تحديد تسلسله الجينومي الكامل ، وأول فيروس حيواني RNA تم تكوين استنساخ معدي له ، بالإضافة إلى فيروس الأنف ذي الصلة ، كان أول فيروس بشري له أبعاده الثلاثية. هيكل تم حله عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية. في الواقع ، تميز تاريخ أكثر من نصف قرن من دراسات تكرار فيروس شلل الأطفال باكتشافات رئيسية ، تم تلخيص العديد منها هنا وتوضيحه في الشكل 1.

الاختصارات والرموز: بروتينات مستقبلات ثلاثية الأبعاد ثلاثية الأبعاد (أسطوانات رمادية تغطي غشاء البلازما) RNA ، حمض الريبونوكليك VPg ، بروتين فيروسي ، ريبوسومات (بيضاوية حمراء) مرتبطة بالجينوم (أشكال بيضاوية زرقاء متوسطة مرتبطة بـ RNA الفيروسي) + حبلا RNA ، إيجابي - الحمض النووي الريبي الجينومي المعنى (الخط الأزرق الأفقي أو المتموج) - الرنا الريبي ، الحمض النووي الريبي المضاد ذي المعنى السلبي (الخط الأحمر الأفقي أو المتموج) ثلاثي الأبعاد ، بوليميريز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي الفيروسي (الأشكال الوردية) الحويصلات الغشائية (أشكال بيضاوية زرقاء فاتحة) ، Nups ، النيوكليوبورين (أشكال بيضاوية برتقالية مستطيلة الشكل).


مقدمة

يعد فيروس نوروفيروس البشري (HuNV) حاليًا سببًا رئيسيًا لالتهاب المعدة والأمعاء الحاد لدى البالغين ومن المتوقع أن يصبح السبب الرئيسي للإسهال في جميع الفئات العمرية في جميع أنحاء العالم (باتيل وآخرون ، 2008 بوك وغرين ، 2012). يمكن لـ HuNV إنشاء عدوى مزمنة ويصبح مهددًا للحياة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة (Bok and Green ، 2012). ومع ذلك ، لا يتوفر أي مضاد فيروسات أو لقاح فعال ضد HuNV حتى الآن ، ويرجع ذلك أساسًا إلى عدم وجود فعال في المختبر و في الجسم الحي نظام العدوى من HuNV. تقدم التطورات الأخيرة لخطوط الخلايا البائية الخالدة ، والنظام العضوي المشتق من الخلايا الجذعية ، والفئران التي تعاني من نقص BALB / c Rag - & # x03B3c لعدوى HuNV نماذج جديدة لدراسة HuNV (Taube et al.، 2013 Jones et al. ، 2014 الطيبي وآخرون ، 2016). منذ عزله عن الفئران التي تعاني من نقص المناعة (Wobus et al. ، 2004) ، كان الفئران NoV (MNV) بمثابة نموذج بديل فعال (Karst et al. ، 2003 Wobus et al. ، 2006) لتوضيح الآلية الجزيئية لتكرار النوروفيروس. والتسبب.

نوروفيروس (NoV) هو فيروس RNA أحادي الشريطة (+ RNA) إيجابي الحس وينتمي إلى Caliciviridae أسرة. يحتوي جينوم & # x223C7.6 kb + RNA الخاص بـ NoV على ثلاثة إطارات قراءة مفتوحة (ORFs) (Hardy ، 2005) ، مع ORF4 إضافي لـ MNV (McFadden et al. ، 2011). يشفر ORF1 بروتين متعدد ينقسم إلى بروتينات غير هيكلية ، بما في ذلك الجينوم المرتبط ببروتين الفيريون (VPg) وبوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي (RdRp) (Sosnovtsev et al. ، 2006). يقوم RdRp بتضخيم الجينوم الفيروسي باستخدام ثلاثي فوسفات الريبونوكليوتيد (rNTPs) كركائز منخفضة الدقة بسبب عدم وجود آلية فعالة للتدقيق اللغوي. يمكن أن يكون بدء تخليق الحمض النووي الريبي بواسطة RdRp على قالب RNA إما معتمدًا على التمهيدي أو مستقل في Caliciviridae, Picornaviridae، و Potyviridae (جرين ، 2007 Goodfellow ، 2011 Jiang and Laliberte ، 2011). في الحالة الأولى ، يعمل VPg كأساس لهذه الفيروسات ، حيث يوفر مجموعات هيدروكسيل مجانية من بقايا التيروزين أو السيرين. يلعب VPg المرتبط تساهميًا بالنهاية 5 & # x2032 للـ RNAs الفيروسي أدوارًا مهمة في ترجمة البروتين الفيروسي وتكرار الجينوم (Burroughs and Brown ، 1978 Herbert et al. ، 1997 Goodfellow ، 2011 Jiang and Laliberte ، 2011).

VPg هو بروتين شبيه بالكريات المنصهرة المضطرب جوهريًا وله وظائف متعددة. إنه شديد التنوع في التسلسل والحجم ، ويتراوح من 2 إلى 90 كيلو دالتون ، ينتمي أكبرها Birnaviridae تمتلك dsRNAs مجزأة مع RdRp المرتبط بـ VPg (Calvert et al. ، 1991). الحمض النووي الريبي الجيني لفيروس calicivirus السنوري ، وهو عضو في Caliciviridae، ليس معديًا بعد الانقسام البروتيني لـ VPg (Herbert et al. ، 1997). ثبت أن VPg يرتبط بـ RdRp المماثل في الفيروس المعوي 71 (EV71) ، وفيروس الحمى القلاعية (FMDV) ، وفيروس كوكساكي (CV) (Ferrer-Orta et al. ، 2006 Gruez et al. ، 2008 Chen et al. ، 2013 ) ، الذي لا يشترك فيه VPg من caliviruses في التماثل التسلسلي. لا يوجد هيكل معقد لـ RdRp-VPg متوفر حتى الآن ولا يزال دور تفاعل RdRp & # x2013VPg في النسخ المتماثل لـ NoV غير معروف.

في هذه الدراسة ، قمنا بتمييز بعض الخصائص البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية لمركب MNV RdRp-VPg (1-73). تسبب MNV VPg في تكوين ألياف متعددة أو ليفية أنبوبية عالية المستوى من RdRp وعزز نشاط RdRp. تم حظر تكرار طفرات MNV مع RdRps المعيب في ربط VPg تمامًا في نظام ثقافة الخلية. علاوة على ذلك ، قدم التركيب البلوري للمجمع دليلًا على أن التفاعل بين VPg و RdRp يلعب دورًا حاسمًا في تكرار النوروفيروس من خلال التكوين المتعدد الرتبة الأعلى لجزيئات RdRp.


نتائج

توصيف التركيبات المشتقة من TaV ORF

تم التعبير عن TaV ORF1 كامل الطول (140 كيلو دالتون) في ذيل N-terminal الذي يحتوي على علامة hexa-histidine (TaV rORF1 الشكل 1A) في خلايا حشرية Hi5 المصابة بفيروس باكول مؤتلف ، rBV-TaV ORF1. بعد التعبير ، تم شق البروتين المؤتلف بسرعة لتحرير جزء بروتين 75 كيلو دالتون (الشكل 1 ب) [13]. أظهر قياس الطيف الكتلي (MALDI-TOF / TOF) أن هذا البولي ببتيد يؤوي أول 674 بقايا من البروتين المؤتلف ، بما في ذلك مجال RdRP بالكامل (TaV).بول من هنا في الشكل 1 أ). أظهرت خطوة التنقية النهائية ، كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، أن TaVبول هو ديمر في المحلول (الشكل 1 ج). تم استخدام هذا البناء لكل من التحليلات البلورية والتوصيف الوظيفي لنشاط RdRP. بالإضافة إلى ذلك ، يبني بروتين آخر ، يؤوي طفرات في زخارف الموقع النشط C TaVبول(D351A / D352A) و B TaVبول(T443A / T444A) وفي موقعي nucleotidylation المفترضين ، TaVبول(S4A) و TaVبول(T157A) ، أو الحذف عند الطرف N و / أو C للبروتين ، TaV rORF1 (Δ27) ، TaVبول(Δ27-Δ657) و TaVبول(Δ611-617) ، تم التعبير عنها أيضًا وتنقيتها (الشكل 1 أ). من المهم ملاحظة أن الجين المتحور TaV rORF1 (Δ27) أدى إلى متغير بروتين لا يخضع لتدهور بروتيني كبير في خلايا الحشرات ، مما يسمح بتنقية البولي ببتيد بأكمله (الشكل 1 ب). اللافت للنظر ، يبدو أن هذا البروتين هو مونومر في محلول كما هو محدد بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي (الشكل 1C). النسخة المقطوعة TaVبول(Δ27-Δ657) هو أيضًا مونومر (الشكل 1C). تم الحصول على كمية صغيرة من TaV rORF1 المنقى كامل الطول واستخدمت في فحوصات النشاط اللاحقة.

(أ) الكارتون يصور بشكل تخطيطي تركيبات البروتين المستخدمة في هذا التقرير. يشير الخط الأحمر إلى الجزء المتبلور الذي يحتوي على مجال RdRP (TaVبول). يشار إلى علامة polyhistidine ، الموجودة في الطرف N لكل بروتين مؤتلف ، في الأعلى. يشار إلى مواقف الأحماض الأمينية المستبدلة في نسخ البروتين الطافرة على أنها "*". (ب) Comassie SDS-PAGE الملطخة باللون الأزرق المطابق لـ TaV المنقىبول و TaV rORF1 (Δ27) يبني. يتوافق حارة M مع محددات الكتلة الجزيئية (كيلو دالتون). (C) كروماتوغرافيا تحليلية على عمود Superdex 200 5/150 معاير من TaV المنقىبول (أزرق) ، TaV rORF1 (27) (أحمر) ، و TaVبول(Δ27-Δ657) (أخضر).

في المختبر نشاط البوليميراز لـ TaV rORF1 و TaVبول

ال في المختبر أنشطة توليف الحمض النووي الريبي لـ TaV rORF1 كامل الطول ومجال RdRP الخاص به TaVبول تم تحليلها لأول مرة باستخدام قالب ssRNA المشتق من المنطقة غير المترجمة 3 (UTR) من جينوم TaV [4] ، مما يدل على أن كلا التركيبات قادرة على توليف الرنا المزدوج الجديلة من قالب ssRNA في غياب التمهيدي ، في رد فعل يعتمد على Mg 2+ كأيون حفاز (الشكل 2). نشاط RdRP لـ TaVبول تم اختباره أيضًا في وجود جهاز تمهيدي قصير من الحمض النووي الريبي (8-nts) مكملًا للتسلسل الداخلي لـ TaV 3’-UTR ، مما يُظهر مستويات مكافئة من تخليق الحمض النووي الريبي (الشكل 2 أ). بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام قوالب ssRNA للتسلسلات غير المتجانسة تمامًا (مثل 3’-UTR لجينوم فيروس العُقد الشكل 2 أ) يشير إلى أنه ، على الأقل في المختبر، لا يتطلب إنزيم TaV تسلسلات قالب محددة أو هياكل ثانوية للبلمرة. كما لوحظ نشاط بلمرة RNA على قوالب RNA القصيرة (من 6 إلى 25 نيوكليوتيدات) التي تؤوي متواليات غير مرتبطة أو مشتقة من TaV 3’-UTR (الشكل 2 ب). هذه البيانات توضح ذلك ، على الرغم من TaVبول قادر على القيام به من جديد توليف RNA على قوالب صغيرة غير محددة ، يبدو أن وجود الجوانين في 3’ نهاية القالب ضروري لبدء التفاعل.

الممثل للتصوير الشعاعي الذاتي في المختبر تم تحليل فحوصات نشاط TaV RdRP في 7٪ من المواد الهلامية من مادة الأكريلاميد TBE. (أ) اللوحة اليسرى ، الممر الأول ، قالب ssRNA المسمى بخطوط α- 32 P GTP الثانية والثالثة ، أنشطة RdRP لـ TaV rORF1 و TaVبول، على التوالي ، باستخدام قالب ssRNA الطويل الذي لم يتم تسميته مسبقًا 311 nts والذي يتوافق مع TaV 3’-UTR. اللوحة اليمنى ، نشاط بلمرة TaVبول تم إجراؤه في: 1) عدم وجود قالب (الممر الأول) ، 2) وجود قالب TaV 3'-UTR (الممر الثاني) ، 3) وجود TaV 3'-UTR مهجنًا إلى مادة أولغنوكليوتيد قصيرة مكملة لقالب داخلي تسلسل (الممر الثالث) و ، 4) وجود قالب فيروسي غير مرتبط (3'-UTR من الممر الرابع لفيروس العقدة SJNNV). (ب) نشاط البلمرة من TaVبول على قوالب قصيرة ssRNA. مشتق قليل النوكليوتيدات بطول 6 و 12 و 16 نت (يسار) من TaV 3’-UTR و 13- و 25-nts في الطول (يمين) تحتوي على تسلسلات غير مرتبطة بـ TaV. تم إجراء التحكم السلبي (-) في غياب الحمض النووي الريبي. (C) تم استخدام أيونات مختلفة (Mg 2+ ، Mn 2+ ، Zn 2+ ، Co 2+ ، Ca 2+) وتركيزات تتراوح من 1 إلى 25 ملي مولار في تجارب البلمرة التي أجريت في ظل الظروف المثلى (انظر الطرق و S1 الشكل. ). تم إجراء تحكم سالب (-) باستخدام خليط تفاعل يفتقر إلى أيونات معدنية.

مثل باقي البوليمرات المعروفة ، نشاط RdRP لـ TaVبول يعتمد بشكل صارم على أيونات المعادن مثل Mg 2+ و Mn 2+ (الشكل 1C). كما تم وصفه من قبل [14-16] ، فإن العامل المساعد Mn +2 يعزز بقوة تخليق الحمض النووي الريبي. على عكس ما لوحظ في IBDV RdRP غير الكنسي [17] ، لوحظ فقط النشاط المتبقي في وجود 1 ملي مولار من ثاني أكسيد الكربون 2+ (الشكل 1 ج). علاوة على ذلك ، استبدال إما Mg 2+ أو Mn 2+ بواسطة الكاتيونات ثنائية التكافؤ الأخرى ، أيCa 2+ أو Zn 2+ ، يمارسان تأثيرًا مثبطًا واضحًا على تخليق الحمض النووي الريبي (الشكل 1C). تم إجراء تحليل حركية البلمرة في ظل الظروف المثلى لهذا الإنزيم (1.3 مم RdRP في 50 ملي مولار درجة الحموضة 6 و 150 ملي كلوريد الصوديوم و 5 ملي مولار من كلوريد الصوديوم2 عند 35 درجة مئوية ، يظهر الشكل S1 الشكل) ملفًا جانبيًا سينيًا مع خطوة أولية لتخليق RNA منخفض وحالة نهائية للتشبع (S2 الشكل).

هيكل TaVبول

هيكل TaVبول بواسطة طرق SAD من البلورات المشتركة المشتقة من Lu 3+ إلى دقة 3.0 (الجدول 1) [13]. ثم تم استخدام البيانات الأصلية لإكمال النموذج وصقله إلى دقة نهائية تبلغ 2.15 (الجدول 1). تشتمل الوحدة البلورية غير المتماثلة على ثنائي بوليميراز معبأ بإحكام يحتوي على 1326 وحدة بنائية: من P10 إلى K672 للجزيء A ومن P10 إلى E674 للجزيء B. تكون المونومرات A و B متطابقة تقريبًا ، مع انحراف جذر متوسط ​​التربيع يبلغ 0.27 Å لتراكب الكل بقايا. يتكون كل مونومر من قلب RdRP كروي (بقايا 41-648) وذراعان طرفيان (البقايا 10-40 و 649-674) يمتدان خارج اللب ويشاركان في عدد من التفاعلات بين الجزيئات التي تعمل على استقرار البنية الخافتة (الشكل 3). يعتمد قلب RdRP العمارة الكلاسيكية المغلقة "اليمنى" التي تتكون من أصابع (حلزونات α3-α13 و α15-α16 من الأحماض الأمينية 41-303 و 375-443) ، النخيل (α14 ، β6-β8304–374 و α17-α18 ، β9-β10 444-519) ، والإبهام (α19-α24 520-649) المجالات الفرعية ، التي تطوق الأشكال السبعة المحفوظة (من A إلى G) المطلوبة للتعرف على الركيزة والحفز (الشكل 4 أ). كما هو متوقع من تنبؤات المعلوماتية الحيوية السابقة [3،4] ، تُظهر المقارنات الهيكلية باستخدام دالي [18] أوجه تشابه مهمة بين TaVبول و birnavirus polymerases. تم الحصول على أعلى النتائج باستخدام IPNV (PDB id 2YIB) و IBDV (PDB id 2QJ1) RdRPs التي أظهرت درجات Z من 25.4 و 21.9 وانحرافات r.m.s من 3.1 و 2.9 لتراكب 523 و 524 من البقايا ، على التوالي. علاوة على ذلك ، لوحظت أيضًا أوجه تشابه غير متوقعة ومذهلة عند TaV بشكل عامبول تمت مقارنة الهندسة المعمارية بتلك الخاصة بأعضاء مختلفين في فلافيفيريدي عائلة ، مع درجات Z من 16.1 (معرف فيروس التهاب الدماغ الياباني PDB 4K6M) ، 13.8 (معرف DV PDB 4V0R) و 13.8 (HCV PDB id 2XIZ) مع انحرافات جذر متوسط ​​التربيع من 3.3 و 3.3 و 3.4 لتركيب 448 و 444 و 330 بقايا ، على التوالي. تم الحصول على نتائج مماثلة عندما تم فرض المجالات الفرعية الفردية (S3 الشكل).

(أ) يتم عرض جزيئين من الوحدة غير المتماثلة البلورية على شكل شرائط باللون الأزرق والقمح ، على التوالي. تحافظ الأحماض الأمينية في طرفي N و C على البنية القاتمة للإنزيم. يظهر الجزء السفلي في المختبر فحوصات البلمرة التي تثبت أن حذف أول 27 من مخلفات الأحماض الأمينية الطرفية N يعزز النشاط الإنزيمي. (B) لقطة مقرّبة للتفاعلات التي تم إنشاؤها بين الطرف N للجزيء B (الأزرق) مع التجويف المركزي للجزيء A (القمح). تكون بقايا البروتين التسعة الأولى مضطربة وغير مرئية في كثافة الإلكترون. يقع أول بقايا مرئية ، P10 ، في 18 من الموقع النشط. (C) لقطة مقرّبة للتفاعلات التي تم إنشاؤها بين الطرف C للجزيء B مع مجال أصابع الجزيء A. في اللوحتين B و C ، يتم تصوير السلاسل الجانبية للمخلفات المتضمنة في التفاعلات بين الجزيئات على أنها عصي وتم تصنيفها بوضوح. نظرًا لوجود التماثل غير البلوري (ncs) ، فإن التفاعلات الثنائية بين النهايتين N و C للجزيء A مع الجزيء B وتلك الخاصة بالنهاية N و C للجزيء B مع الجزيء A متطابقة.

(أ) رسم تخطيطي لشريط إنزيم TaV يُظهر بنية اليد اليمنى النموذجية المغلقة والتي تحيط بالزخارف السبعة المحفوظة (A ، الأحمر B ، الأخضر C ، البرتقالي D ، البنفسجي E ، الأصفر F ، السماوي G ، الوردي). يتم تمييز العناصر الهيكلية الثانوية وكذلك النهايات الطرفية N و C للإنزيم. يتم تمييز الحلقة الطويلة λ6 التي تسد جزئيًا التجويف المركزي للإنزيم باللون الأزرق الداكن. تظهر بقايا حامض الأسبارتيك في الشكل C (D351 و D352) والشكل A (D369 و D374) كعصي. يصور المخطط (اللوحة السفلية) التنظيم المخفف لمجال نخيل TaV. (ب) لقطة مقرّبة للحلقة λ6 مع السلاسل الجانبية العطرية ، Y611 و F613 ، كما هي موضحة كعصي ومعلمة. هياكل الحلقات المكافئة في عضوين متميزين من Flaviridae الأسرة ، HCV (أخضر) و DV (برتقالي) متراكبة. توجد بقايا ربط التمهيدي HCV Y448 ، المسؤولة عن التفاعل مع النيوكليوتيد الأول المضاف إلى سلسلة RNA المُصنَّعة حديثًا [19] بالقرب من F613 في TaV و H798 في DV. (ج) تصوير اشعة أوتوماتيكي لـ في المختبر نشاط TaV RdRP ، الذي تم تحليله في 7٪ من المواد الهلامية من مادة الأكريلاميد TBE ، والذي يوضح أن الطفرات في بقايا الحافز C D351 و D352 تلغي تخليق الحمض النووي الريبي (أعلى) ، وأن التخلص من طرف 6 (المخلفات 611-617) يعزز بلمرة الحمض النووي الريبي (أسفل).

توجد إشارة VPg المفترضة (المخلفات 153–165) في السبابة (التسمية الكهروضوئية [20]) ، وتغطي اتصال α5-α6 والطرف α6 N (الشكل 4 أ). يبدو أن بنية هذا الشكل مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بنظيره في فيروس البيرنا (الشكل 5 أ) [9-11]. في بداية هذا الحافز ، تساهم ثلاث حلزونات (α3-α5) أيضًا في عبور السبابة للمجال الفرعي لراحة اليد للتفاعل مع الإبهام وإغلاق هيكل اليد اليمنى (S4 الشكل). أخيرًا ، يتم ربط α3 بحلقة طويلة إلى حلزونات N-terminal α2 و α1 التي تمتد خارج لب البوليميريز. لوحظت اختلافات هيكلية كبيرة في هذه المنطقة الطرفية N عند مقارنة فيروس birnavirus و permutatetravirus (الشكل 5 أ). تم تحليل نشاط الارتباط الذاتي للنيوكليوتيدات لأنزيم TaV في المختبر باستخدام كل من TaVبول و TaV rORF1 يبني في وجود قالب ssRNA المشتق من TaV الموصوف أعلاه. nucleotidilation التلقائي من TaVبول (الشكل 5 ب). بالإضافة إلى ذلك ، TaVبول(T157A) و TaVبول(S4A) ، حيث تم استبدال بقايا الارتباط النووي المتوقعة [4 ، 11] بألانين ، والحفاظ على مستويات تخليق الحمض النووي الريبي مماثلة لتلك التي تم اكتشافها باستخدام إنزيم النوع البري في في المختبر فحوصات البلمرة (S5 الشكل). فقط TaV rORF1 كامل الطول يحتفظ بالإشارة المشعة α- 32 P GTP (الشكل 5 ب). على الرغم من أن هناك حاجة إلى مزيد من التجارب لرسم خريطة دقيقة لموقع guanylation ، تشير هذه الملاحظة إلى أن محطة TaV ORF1 C ضرورية للنيوكليوتيدات الذاتية.

(أ) التراكب الهيكلي لنهاية TaV polymerase N (الذهب) مع المخلفات المكافئة في IBDV RdRP (الأخضر). يتم عرض المخلفات المحفوظة بدقة داخل توقيع VPg على شكل أعواد ويتم تمييزها. (ب) أوتوراديوغرافيا في المختبر أنشطة guanlylation الذاتية من TaVبول وحللت TaV rORF1 11٪ SDS-PAGE (أعلى). تم تلوين المواد الهلامية أيضًا باللون الأزرق Coomassie لتقييم تحميل البروتين (أسفل). يشار إلى موضع علامات الكتلة الجزيئية (M) (كيلو دالتون) في الجل السفلي.

التقليب C-A-B من TaVبول النخيل ، مع شكل GDD (البقايا 350-352) ، الموجود في دبوس الشعر β6-7 ، والعنصر A البقايا D369 و D374 ، الموجودة في نهاية الشريط β8 ، متوافقة مكانيًا مع التنظيم الكنسي للموقع النشط (الشكل 4 ا). تم العثور على معماريات النخيل المماثلة في هياكل RdRP لفيروسات بيرنا [9-11].

الإبهام الحلزوني لـ TaVبول أكبر من مجالات الإبهام في ssRNA RdRPs الأخرى المعروفة ببدء النسخ المتماثل بطريقة تعتمد على التمهيدي مثل polymerases picorna- و calicivirus [2،21]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن TaVبول يمتلك الإبهام حلقة طويلة (λ6 بقايا 591-625) ، بارزة في التجويف المركزي المكافئ هيكليًا للحلقات الأولية للفيروسات المصفرة والعاثية ϕ6 [21-24] (الشكل 4 ب). تظهر المقارنات الهيكلية أن الحلقة λ6 ، التي تربط الحلزونات α20 و α22 ، تنشأ من نفس الجزء من المجال الفرعي للإبهام كما هو الحال بالنسبة لفيروسات flaviriruses DV و West Nile Virus (WNV) ولكنها أكبر وتحتوي على عنصرين هيكليين ثانويين في نهايتها N: قصير α21- ودورة واحدة 310 η8- حلزونات (الشكل 4 أ و 4 ب). يتم تثبيت موضع هذا العنصر من خلال التفاعلات التي تم تحديدها بين وحدات بنائية مختلفة لـ α21 والتي تلامس الحلزون α1 عند طرف البوليميراز N ، وبين طرف الحلقة (المخلفات 613-616) مع البقايا 301-304 و 317-320 داخل اللولب α12 والحلقة α12-α13 ، على التوالي.

لمزيد من التحقيق في دور الحلقة λ6 في نشاط TaV RdRP ، أنشأنا متحولة حذف ، TaVبول(Δ611–617) ، من المتوقع أن يعرض موقعًا نشطًا مفتوحًا ، يفتقر إلى منصة التهيئة المفترضة التي تدعم التمهيدي rNTP أثناء من جديد البدء ولكن هذا بدوره قد يفضل تكييف الرنا المزدوج الجديلة حديثًا أثناء الاستطالة. ثم تم اختبار نشاط استطالة RNA باستخدام قالب RNA المشتق من TaV 3’-UTR. أظهر تحليل نواتج التفاعل على المواد الهلامية بولي أكريلاميد تغيير طبيعة المواد الهلامية زيادة نشاط TaVبول(Δ611-617) متحولة في هذا القالب عند مقارنتها بالإنزيم الأصلي (الشكل 4C). لوحظت أيضًا أنشطة متزايدة قابلة للمقارنة بعد عمليات حذف مماثلة داخل حلقات فتيلة مكافئة لـ HCV و DV RdRPs [25،26]. نظرًا لأن قالب ssRNA الطويل المستخدم في هذه الاختبارات قادر على تكوين شوكة من خلال التكامل الأساسي الذي يمكن وضعه في التجويف المركزي لـ RdRP ، فإن منتجات الاستطالة المرصودة لهذا المسوخ سيتم إنشاؤها بواسطة تخليق الحمض النووي الريبي المعتمد من الخلف. دعمًا لهذا التفسير ، فإن من جديد تم إلغاء تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) على قوالب قليلة النوكليوتيد القصيرة في TaVبول(Δ611-617) متحولة (S6 الشكل).

تنظيم Dimeric من TaVبول

ترتبط كل من جزيئات البوليميراز في الوحدة غير المتماثلة في محور جزيئي شبه مزدوج. يُظهر سطح التلامس بين هذين الجزيئين ، المحسوب باستخدام برنامج PISA [27] ، مساحة إجمالية قدرها 6038 2 (

11٪ من إجمالي سطحه) ويتوقع طاقة استقرار باهتة تبلغ Gديس = 46.3 كيلو كالوري / مول. تتضمن واجهة التفاعل ما يلي: (1) الطرف N لجزيء واحد يتصل بتجويف الموقع النشط للبوليميراز الثاني و (2) الطرف C لجزيء واحد يلامس الأصابع العلوية للجزيء الثاني (الشكل 3) .

تتضمن التفاعلات التي تتم بوساطة طرف البوليميراز N الجزء المرئي من نهاية الطرف N (المخلفات 10-14) ، واللولب α1 (المخلفات 15-29) الذي يمتد نحو التجويف المركزي للجزيء المجاور (ذو صلة ثنائية) ، متلامسًا حلزون الإصبع α8 (المخلفات 205-207) وحلقة α8-α9 (208-225). التفاعلات بين الجزيئات هي أساسًا روابط هيدروجينية من السلسلة الرئيسية للسلسلة الرئيسية ولكنها تشمل أيضًا جسرًا ملحًا بين R37 و D101 (β3). تحتل البقايا المرئية الأولى في كثافة الإلكترون (P10) قاعدة قناة القالب ، في الموضع المتوقع تقريبًا للنيوكليوتيدات النموذجية الأولى ، في اتصال وثيق مع البقايا 209-211 (الشكل 3 ب). تشتمل هذه الملامسات على ما مجموعه 38 وحدة بنائية ، تغطي سطحًا يبلغ 2725 2 بطاقة ميكروغرامديس = 16.5 كيلو كالوري / مول. تم الحصول على بلورات مكافئة بعد الانقسام الأنزيمي لعلامة N-terminal hexa-histidine. لسوء الحظ ، لم يكشف الهيكل الناتج عن معلومات إضافية حول موضع أول تسعة مخلفات بروتين.

من أجل استكشاف الدور الوظيفي لنهاية البوليميراز N على اتصال وثيق مع قناة القالب للإنزيم المجاور ، قمنا بتصميم متحولة TaV rORF1 ، TaV rORF1 (Δ27) ، تفتقر إلى أول 27 من المخلفات الطرفية N (الشكل 1) . من المثير للدهشة أن TaV rORF1 (Δ27) لا يخضع للانقسام في بولي ببتيد 75 كيلو دالتون الذي لوحظ في البروتين كامل الطول ، بالإضافة إلى أنه يتم تنظيمه كمونومر في محلول (الشكل 1C). يتم إجراء فحوصات البلمرة باستخدام هذا المسوخ وكذلك مع TaVبول(Δ27-Δ657) يوضح البناء أن التخلص من البقايا الـ 27 الأولى التي تمنع تكوين الثنائيات يؤدي أيضًا إلى زيادة كبيرة في تخليق الحمض النووي الريبي (الأشكال 3 أ ، وإدراج أسفل ، و S7).

TaVبول يتكون الطرف C من ذراع طويلة (بقايا 649-674) تمتد على طول حلزونات الأصابع α8 و α9 و α14 عند السطح الخارجي للبروتين (الشكل 3C). تشتمل التفاعلات C- بوساطة على 43 وحدة بنائية ، وتشكل سطح تلامس يبلغ 3،313 Å2 ، مع ΔGديس = 17.2 كيلو كالوري / مول.

TaVبول كما لوحظ الثنائيات عن طريق المجهر الإلكتروني النافذ للتلطيخ السلبي (S8 الشكل) ، مما يشير إلى أن بنية الثنائيات ، التي لوحظت لأول مرة في البلورات ، مستقرة في المحلول ويتم الحفاظ عليها حتى عند تركيزات البروتين المنخفضة جدًا.

هيكل TaVبول في معقدة مع قالب ssRNA و rNTPs الواردة

TaVبولتم الحصول على بلورات مشتركة معقدة -ssRNA-rNTP بعد حضانة TaVبول باستخدام نموذج قليل النوكليوتيد 5’-CCCAUUCGACUCCUG و ATP و CTP و MnCl2. تبلور هذا المركب في المجموعة الفضائية I222 مع TaV واحدبول ديمر في الوحدة غير المتماثلة. تم حل الهيكل عن طريق الاستبدال الجزيئي وصقله إلى دقة 3.5 (الجدول 1). كشفت المقارنات الهيكلية بين الإنزيمات غير المنضمة و ssRNA-rNTP تغييرين هامين في التوافق: (1) دوران ∼7˚ لمونومر واحد فيما يتعلق بالآخر في dimer و (2) إعادة ترتيب مطابقة لنهاية polymerase N ، مما أدى إلى فتح خفي للتجويف المركزي يسهل إدخال القالب (S9 الشكل).

كشف التحليل الهيكلي لهذا المجمع عن وجود كثافة زائدة في الموقع النشط للبوليميراز في أحد جزيئي الوحدة البلورية غير المتماثلة (الجزيء ب). تم تفسير هذه الكثافة على أنها وجود جزيء ATP مرتبط ، مع وجود قاعدة ATP مكدسة بإحكام مع البقايا Y611 و F613 من الحلقة λ6 وشق ثلاثي الفوسفات الذي يشغل نفق دخول النوكليوتيدات ، ملامسة المخلفات الأساسية R280 ، K278 من الحافز F و K488 من الحافز D (الشكل 6 أ و 6 ب).

(أ) موقع موقعي الربط لجزيئات rNTP الواردة الموجودة في الهياكل البلورية المختلفة. تم تمييز التصميم C باللون البرتقالي مع إظهار المخلفات الحفازة D351 و D352 كعصي. (ب) لقطة مقرّبة لجزيء ATP المرتبط بـ TaVبول موقع نشط مع قاعدة الأدينين مكدسة بإحكام على بقايا Y611 و F613 في الحلقة التمهيدية λ6 (أزرق). يتفاعل جزء الريبوز مع بقايا الحفاز D351 للعنصر C (البرتقالي) ، ويشارك ثلاثي الفوسفات في جسور الملح مع K278 و R280 في شكل الأصابع F (سماوي) و K448 من الحافز D. خريطة كثافة الإلكترون 2Fo-Fc حولها يتم عرض جزيء ATP في محيط 1σ (شبكة خضراء). (C) موقع ربط غير متوقع لنيوكليوتيدات CTP في مجال الإبهام لـ TaVبول. تظهر خريطة كثافة الإلكترون 2Fo-Fc (1σ) كشبكة خضراء. تم تفسير ذروة قوية إضافية لكثافة الإلكترون ، وجدت بالقرب من موقع ربط NTP ، من خلال وجود أيون كبريتات واحد من محلول التبلور. يبدو أن هذه الكبريتات مرتبطة بإحكام بالسلاسل الجانبية لثلاث بقايا R.

لسوء الحظ ، كانت كثافة الإلكترون المقابلة لقالب ssRNA ضعيفة للغاية وغير متصلة للسماح ببناء نموذج دقيق. ومع ذلك ، تم اكتشاف قمم قوية على طول قناة القالب للبوليميراز التي تتوافق مع شقوق الفوسفات من قليل النوكليوتيد المرتبطة في اتجاه مماثل لتلك الخاصة بالقوالب المشتقة من تراكب مجمعات RdRP-ssRNA المتاحة على إنزيم TaV (الشكل S10) .

علاوة على ذلك ، شوهدت أيضًا ذروة إضافية لكثافة الإلكترون على اتصال وثيق مع بقايا العزر B T443 و T444 ، بعيدًا عن مسار سلسلة فوسفوديستر النموذجية المفترضة (S10 الشكل). تحليل الأشعة السينية لـ TaV الثانيبولأشار مجمع -ssRNA إلى أن هذه الكثافة تتوافق مع قاعدة القالب في الموضع 3 'الذي يتجاوز موقع الربط المتوقع أمام rNTP الوارد ، ويظهر معبأ بإحكام مع بقايا النموذج B. لسوء الحظ ، يمكن جمع مجموعة بيانات جزئية فقط من هذه البلورات (53.8 ٪ اكتمال إلى 3.1 Å دقة S10 الشكل). يحتوي Motif B على عدد من بقايا S / T المحفوظة بشكل صارم في RdRPs التي تشارك في ربط القالب ونقل موقع dsRNA المركب حديثًا [28-29]. TaVبوليشير مجمع -RNA إلى أن بقايا التصميم B قد تعمل أيضًا كموقع ربط للقاعدة النهائية للقالب في مرحلة ما قبل البدء. لتقييم دور هذه المخلفات المحفوظة في تخليق الحمض النووي الريبي ، تم استبدال T443 و T444 بواسطة Ala. تم تحليل نشاط RdRP للإنزيم الطافر في المختبر، مما يدل على أن T → A بدائل في الموضعين 443 و 444 من TaVبول يلغي تماما تخليق الحمض النووي الريبي (S10 الشكل).

موقع ربط غير عادي للنيوكليوتيدات في مجال الإبهام في TaV RdRP

TaVبول-GTP و TaVبولتم الحصول على بلورات CCTP أيضًا في وجود MgCl2 وتم حل الهياكل المقابلة بدقة 2.3 و 2.25 ، على التوالي (الجدول 1). في كلتا الحالتين ، لوحظت كثافات إلكترونية واضحة لشقوق ثلاثي الفوسفات التي تتفاعل مع البقايا الكهربية في نفق rNTP. ومع ذلك ، كانت أجزاء النوكليوسيدات المقابلة مضطربة. بالإضافة إلى ذلك ، كشفت هذه الهياكل عن موقع ارتباط نيوكليوتيد ثانٍ في منطقة غير متوقعة تمامًا ، تجويف داخل المجال الفرعي للإبهام ، عند حوالي 30 من الموقع النشط (الشكل 6 ج). في هذا الموضع ، تتلامس شقوق النيوكليوزيد الخاصة ببقايا NTPs المرتبطة M556 و T560 و D563 من الحلزون α19 وإلى E601 من الطرف λ6 N ، بينما تظل شقوق ثلاثي الفوسفات معرضة جزئيًا للمذيب ، وتبدو مضطربة في الغالب. وتجدر الإشارة إلى أن النيوكليوتيدات مرتبطة بجوار منطقة حساسة كهربائية قوية ، والمخلفات R564 و R545 و R269 ، والتي تحتوي أيضًا على ذروة كثافة إضافية ، يتم تفسيرها على أنها جزيء كبريتات مشتق من محلول التبلور (الشكل 6 ج). تجدر الإشارة إلى أن هذه الكبريتات موجودة في جميع TaV الأخرى التي تم تحليلهابول الهياكل.


نتائج ومناقشة

لتحديد VPg unsinkase ، قمنا بتطوير إجراء تنقية متعدد الخطوات باستخدام مقايسة نشاط VPg uninkase الموصوفة مؤخرًا ، والتي تحل [35 S] methionine radiolabeled-VPg الصادر من فيروس شلل الأطفال vRNA (35 S-PV1-RNA) بواسطة Tris-tricine SDS / الصفحة (7). تم تحسين الاختبار الخاص بنا للكشف السريع عن نشاط إلغاء ارتباط VPg (المواد والأساليب). أثناء تطوير مخطط التنقية هذا ، قمنا بفحص المركبات الاصطناعية المختلفة والأحماض النووية كمثبطات تنافسية لاستخدامها في تنقية التقارب لـ VPg uninkase. لقد قمنا بملاحظة عرضية مفادها أن الحمض النووي أحادي الخيط (ssDNA) أكثر كفاءة بمقدار 100 مرة في تثبيط نشاط VPg uninkase من الحمض النووي الريبي الاصطناعي مع أو بدون رابطة 5′-tyrosyl-RNA (الشكل S1). دفعنا هذا الاكتشاف الأساسي إلى تضمين السليلوز ssDNA في بروتوكول التنقية الخاص بنا.

نظرًا لوجود نشاط إلغاء الارتباط VPg في كل من المستخلصات السيتوبلازمية والنووية (2) ، فقد بدأنا إجراء التنقية الخاص بنا باستخدام متجانس الخلايا الكلي من خلايا هيلا غير المصابة. بعد تعريض المجانسة للطرد المركزي عالي السرعة للحطام الخلوي الحبيبي والمجمعات الكبيرة التي تحتوي على بروتينات مرتبطة بالحمض النووي ، تم تجزئة المادة الطافية (S370) ، والتي تحتوي على 75٪ من النشاط الأولي ، بالتتابع بواسطة الهيبارين-سيفروز ، ssDNA- السليلوز ، تبادل الأنيون ، استبعاد الحجم ، كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني ، مما أدى إلى توليد إنزيم متجانس تقريبًا يتم فيه إثراء النشاط بمقدار 10000 ضعف (الشكل 1). ب و ج). عديد الببتيد الناتج 38 كيلو دالتون (p38) المعزول بواسطة مخطط التنقية هذا (الشكل 1ب، الممر 7 ، خطوة التنقية F) يتوافق الحجم مع VPg uncinkase المكتشف أثناء التوصيف الأولي لهذا النشاط (الشكل S2). تحقق تحليل الكسور من خطوة التنقية F (كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني) من تجانس p38 (الشكل 2).أ, أدنى) مع نشاط إلغاء ارتباط VPg (الشكل 2أ, العلوي والشكل S3).

تحديد p38 كـ TDP2. (أ) ملف تعريف نشاط إلغاء ربط VPg الكمي (العلوي، الرسم البياني الأحمر) وتحليل SDS / PAGE (أدنى) من الكسور التي تم إنشاؤها بواسطة خطوة التنقية F تظهر تلاؤم p38 مع نشاط إلغاء ربط VPg. يشير الخط القطري (البني) إلى التدرج الخطي لزيادة تركيز كلوريد الصوديوم (∼150 إلى 350 ملي مولار) المستخدم في إزالة VPg uninkase. (ب) تحليل مطياف الكتلة لـ p38 المعزول من الممر 7 (p38-F12 ، العلوي) والممر 8 (p38-F13 ، أدنى) من هلام بولي أكريلاميد الموضح في أ, أدنى حددت العديد من الببتيدات التجريبية المقابلة لـ TDP2 (في تسلسل متداخل باللون الأحمر يتم وضع خط تحته). (ج) يؤكد تحليل اللطخة الغربية باستخدام الجسم المضاد متعدد الأضداد المضاد لـ TDP2 (التكنولوجيا الحيوية سانتا كروز) عزل TDP2 بواسطة بروتوكول التنقية الخاص بنا (الممرات المسمى بخطوة التنقية). (د) ترتبط مستويات التعبير TDP2 النسبية في المستخلصات الخلوية المختلفة بنشاط VPg uninkase الذي تم اكتشافه سابقًا (7): HeLa (خط خلايا سرطان عنق الرحم البشري) و gt K562 (خط خلايا سرطان الدم النخاعي البشري) و gt NGP (خط خلايا الورم الأرومي العصبي البشري) و GT SKOV3 (الإنسان) خط خلايا سرطان المبيض) و GT RRL (محلول الخلايا الشبكية للأرانب).

تم استئصال البروتين المقابل لـ p38 من مسارين مختلفين من هلام بولي أكريلاميد (الشكل 2أ، الممرات 7 و 8 ، أدنى) المقابلة لكسور الشطف F12 و F13 في ملف تعريف النشاط (الشكل 2أ, العلوي) وتعرض لهضم التربسين متبوعًا بتحليل كروماتوجرافيا السائل النانوي (nano-LC) MS / MS. حدد هذا التحليل بشكل لا لبس فيه p38 كـ TDP2 عبر الببتيدات الفريدة الموضحة في الشكل 2ب, العلوي و أدنى. TDP2 عبارة عن هيدروليز خلوي معتمد على Mg 2+ / Mn 2+ معروف بأنه يشق رابطة 5′-tyrosyl-DNA الناتجة عن تلف الحمض النووي بوساطة توبويزوميراز (10). يُعرف هذا البروتين أيضًا باسم TTRAP و EAPII وقد ثبت أنه يعمل في تنظيم النسخ ونقل الإشارات وتفاعلات البروتين والبروتين المرتبطة بالأدوار المحتملة في تطور الخلايا العصبية وتطور السرطان (11). بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على TDP2 في كل من النواة والسيتوبلازم لخلايا الثدييات (11) ، بالاتفاق مع التقرير الأصلي لنشاط VPg uninkase بواسطة Ambros et al. (2).

لقد تحققنا من وجود TDP2 في الكسور المختلفة (A إلى F) الناتجة عن مخطط التنقية الخاص بنا (الشكل 1). ب و ج) عن طريق تحليل لطخة غربية باستخدام جسم مضاد متعدد الأضلاع متوفر تجاريًا (الشكل 2ج). لتقييم الارتباط بين نشاط TDP2 و VPg uninkase ، حددنا ما إذا كانت مستويات التعبير TDP2 في خلايا مختلفة مرتبطة بنشاط VPg uninkase. ملف تعريف التعبير المرصود لـ TDP2 عن طريق تحليل اللطخة الغربية (الشكل 2د) كانت متوافقة مع الوفرة النسبية لنشاط VPg uninkase المُبلغ عنها سابقًا (الشكل 5 في المرجع 7) للمستخلصات من الخلايا التالية (من أعلى إلى أدنى نشاط): هيلا (خط خلايا سرطان عنق الرحم البشري) و GT K562 (خلية سرطان الدم النخاعي البشري خط) و GT NGP (خط خلية ورم الخلايا البدائية العصبية البشرية) و GT SKOV3 (خط خلايا سرطان المبيض البشري) و GT RRL (محللة الخلايا الشبكية للأرانب). وتجدر الإشارة إلى أننا اكتشفنا عدم وجود نشاط لإلغاء ارتباط TDP2 أو VPg تقريبًا في المستحضرات التجارية لـ RRL ، في حين أبلغت الدراسات السابقة عن نشاط إلغاء ربط VPg في RRL (2 ، 6 ، 12). على الرغم من أننا لا نعرف سبب هذا التناقض الواضح ، إلا أن ملاحظاتنا تسمح لنا باستنتاج أن مستويات تعبير TDP2 ترتبط بمستويات نشاط إلغاء الارتباط VPg.

للتأكد من أن TDP2 يحتوي على نشاط أصلي لإلغاء ارتباط VPg ، قمنا بتنقية TDP2 المؤتلف الموسوم بعلامة GST من الإشريكية القولونية ومعايرة لنشاط إلغاء ربط VPg. عندما تم تحضين [35 S] VPg المسمى VPg RNA ([35 S] VPg-PV RNA) المعزول من فيروس شلل الأطفال المنقى باستخدام GST-TDP2 أو إلغاء ارتباط VPg المنقى جزئيًا ، لوحظ فك ارتباط VPg (الشكل 3).أ, العلوي). تحقق تحليل هذه التفاعلات بنسبة 1 ٪ (وزن / حجم) من الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز أن إطلاق VPg من vRNA لم يكن بسبب تدهور الحمض النووي الريبي (الشكل 3).أ, أدنى). لقد أبلغنا سابقًا أن VPg uninkase يمكنه إزالة VPg من ركائز مختلفة لفيروس picornavirus VPg-RNA (7) لذلك ، قمنا باحتضان GST – TDP2 باستخدام [35 S] VPg-PV RNA أو [35 S] ميثيونين مشع بشري rhinovirus 14 VPg مرتبط بـ a الحمض النووي الريبي الوراثي لفيروس شلل الأطفال (7) ([35 S] VPg HRV-PV RNA). تمكنت GST-TDP2 ، ولكن ليس GST وحدها ، من فك ارتباط VPg بأي من الركيزة VPg-RNA (الشكل 3)ب). كانت ملفات تعريف الترحيل الكهربي لـ VPg الناتجة عن GST-TDP2 أو إلغاء ربط VPg المنقى جزئيًا متطابقة ، ولكنها متميزة عن الهجرة الأبطأ لـ VPg – pUp ، والتي تنتج عن التدهور الكلي لـ vRNA باستخدام RNase A (قارن الممرات 2-5 إلى الممر 6 والممرات 9-12 إلى الحارة 13 في الشكل 3ب). توضح هذه النتائج أن TDP2 له نشاط أصلي لإلغاء ارتباط VPg.

المؤتلف GST – TDP2 له نشاط أصلي لإلغاء ربط VPg. (أ) كميات مكافئة من VPg المنقى جزئيًا و GST-TDP2 كلاهما VPg غير مرتبط من [35 S] VPg-PV RNA (العلوي) ، دون أي تدهور واضح للـ PV RNA (أدنى). (ب) زيادة كميات VPg المنقى جزئيًا و GST – TDP2 ، ولكن ليس GST ، غير المرتبط VPg من [35 S] VPg-PV RNA و [35 S] VPg HRV-PV RNA. تم تضمين التفاعلات التي تحتوي على RNase A لإنشاء علامات لـ VPg – pUp (الممرات 6 و 13).

للتحقيق في الآلية (الآليات) المحتملة التي تحمي بها الفيروسات البيكورنية الارتباط VPg-RNA من ذرية الحمض النووي الريبي أثناء النسخ والتغليف ، استخدمنا الفحص المجهري متحد البؤر لتحديد التوطين دون الخلوي لـ TDP2 والبروتينات الفيروسية المرتبطة بتخليق الحمض النووي الريبي (3A) أو التغليف (قفيصة) البروتينات) أثناء الإصابة بفيروس شلل الأطفال. كانت خلايا هيلا مصابة أو مصابة بفيروس شلل الأطفال ، وتم إصلاح الخلايا ومعالجتها للتصوير كما هو موضح في المواد والأساليب. تظهر في الشكل 4 صورًا تمثيلية للخلايا المصابة بفيروس شلل الأطفال الوهمي في 2 أو 4 ساعات بعد الإصابة. تم توطين TDP2 في الغالب في نواة الخلايا المصابة بالعدوى الوهمية ، مع تلطيخ أقل كثافة في السيتوبلازم ، وكان أكثر تشتتًا إلى حد ما في النواة والسيتوبلازم للخلايا في ساعتين بعد الإصابة. في المقابل ، في 4 ساعات بعد الإصابة ، أظهر TDP2 نمط توزيع خلوي مذهل ويبدو أنه معزول في مناطق معينة من النواة ومحيط السيتوبلازم. بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا مناطق داخل سيتوبلازم الخلايا في 4 ساعات بعد الإصابة والتي كانت خالية إلى حد كبير من TDP2 (مميزة بأسهم متقطعة) ، بينما تحتوي على البروتين الفيروسي 3A (الشكل 4).أ) والبروتينات القفيصة الفيروسية (الشكل 4ب). في محيط الخلية المصابة ، تم العثور على بروتينات TDP2 و 3 A والبروتينات القفيصة على مقربة من بعضها البعض ، ومع ذلك ، لا يبدو أنها تتجمع في مكان واحد (تم تأكيدها بواسطة ضتحليل المكدس). من التغييرات في التوطين الخلوي لـ TDP2 التي تحدث في أوقات لاحقة بعد الإصابة ، نقترح أن تستبعد فيروسات البيكورنا TDP2 من مجمعات تكرار الحمض النووي الريبي لحماية الحمض النووي الريبي الذري المرتبط بـ VPg والمطلوب للتغليف.

عدوى فيروس شلل الأطفال تعيد توطين TDP2. (أ) التألق المناعي لـ TDP2 وبروتين تكاثر الحمض النووي الريبي الفيروسي 3A. وهمية- (قمة) أو تم إصلاح خلايا هيلا المصابة بفيروس شلل الأطفال في أوقات محددة بعد الإصابة الموضحة في الصور التي تم إنشاؤها في ساعتين (وسط) أو 4 ساعات (قاع) ما بعد العدوى. تم تمييز الخلايا بأجسام مضادة موجهة ضد TDP2 (كما هو موضح باللون الأحمر) أو بروتين فيروس شلل الأطفال 3A (أخضر) ، وكانت النوى ملطخة بـ DAPI. تشير الأسهم المتقطعة إلى المناطق التي كانت خالية إلى حد كبير من TDP2. تشير الأسهم إلى مناطق فيروس شلل الأطفال 3A الموجودة بجوار مناطق TDP2. (ب) التألق المناعي لـ TDP2 والبروتينات القفيصة. وهمية- (قمة) أو خلايا هيلا المصابة بفيروس شلل الأطفال كما هو موصوف في أ أعلاه ، باستثناء أنه تم تمييز الخلايا بأجسام مضادة لـ TDP2 أو أضداد لفيروس شلل الأطفال. تشير الأسهم المتقطعة إلى المناطق التي كانت خالية إلى حد كبير من TDP2. تشير الأسهم إلى مناطق بروتينات القفيصة الفيروسية الموجودة بجوار مناطق TDP2.

على الرغم من أن TDP2 هو الوحيد المعروف 5′-tyrosyl-DNA phosphodiesterase الموجود في الخلايا الفقارية (13) ، إلا أنه تم تجاهله في البداية باعتباره مرشحًا مفترضًا لإلغاء الارتباط لـ VPg لعدة أسباب. أولاً ، تم الإبلاغ عن أن VPg uninkase لا يمكن أن يشق ارتباط التيروزيل بالحمض النووي لركيزة اصطناعية 5′-tyrosyl-DNA (14). ومع ذلك ، في محاولة لفهم سبب عدم قدرة VPg uncinkase أيضًا على التحلل المائي لرابط السيرين والحمض النووي الريبي للبروتين المرتبط بالجينوم لفيروس فسيفساء اللوبيا (15 ، 16) ، أخذنا في الاعتبار احتمال أن تكون التفاعلات الكهروستاتيكية مع التيروزين (مرتبطة بالحمض النووي الريبي الجيني) ) هي محددات مهمة للتعرف على الركيزة بواسطة VPg uncinkase ، على غرار الآليات المستخدمة بواسطة نوكلياز الأبورينيك / أبيرميدينيك (17) ، وبروتينات ربط الغطاء (18) ، ومجموعة واسعة من تفاعلات البروتين - الترابطية الأخرى (تمت مراجعتها في المرجع 19) . يتنبأ هذا النموذج بأن الركيزة الاصطناعية المسمى 5′-tyrosyl-DNA المسمى بـ 3،5- [125 I] المستخدمة في العمل المشار إليه أعلاه غير متوافقة مع الموقع النشط لـ VPg uninkase. ثانيًا ، لم يكشف تحليل قياس الطيف الكتلي للكسور التي تحتوي على VPg uncinkase الناتجة عن بروتوكولات التنقية السابقة عن TDP2 (7). بالنظر إلى أن TDP2 هو إنزيم سريع (20) ومنخفض الوفرة (21) ، فمن المحتمل أن نقاء البروتين فيما يتعلق بوفرة TDP2 لم يكن كافياً لتحديد هذه الكسور. ثالثًا ، لم يرتبط الوزن الجزيئي لـ TDP2 كامل الطول بأي من الأوزان الجزيئية التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا لـ VPg uninkase [∼27 كيلو دالتون (3) و24-30 كيلو دالتون (22)]. على الرغم من أن هذا صحيح بالنسبة للأشكال السائدة من TDP2 الموصوفة في الأدبيات (تمت مراجعتها في المرجع 11) ، فقد اكتشفنا ثلاثة أشكال على الأقل من TDP2 بكتل جزيئية واضحة تتراوح من 26 إلى 50 كيلو دالتون (الشكل S4)ب). جميع الأشكال الثلاثة من TDP2 ملفوفة مع الأنواع المقابلة من نشاط VPg uninkase المكتشف في المستخلص الخام (الشكل S4أ). نظرًا لأن مجال فسفوديستيراز لـ TDP2 يقع ضمن الجزء C- الطرف من هذا البروتين (23) ، فإننا نتوقع أن المجموعات السابقة ربما تكون قد قامت بتنقية شكل مبتور من TDP2 جزئيًا.

حاليًا ، الدور الوظيفي لـ TDP2 ، إن وجد ، أثناء الإصابة بفيروس بيكورنا غير واضح. تم اقتراح أن نشاط VPg uninkase متورط في نضوج picornavirus vRNA إلى mRNAs المرتبطة بترجمة polyribosomes (2 ، 3 ، 8) ، ربما كشرط أساسي لبدء الترجمة بوساطة موقع إدخال الريبوسوم. قد يحدث دور تنظيمي إضافي لفك ارتباط VPg بواسطة TDP2 على مستوى تغليف vRNA (6 ، 9 ، 12). نظرًا لأنه يتم تغليف الحمض النووي الريبي المرتبط بـ VPg فقط ، فقد تكون هناك حاجة إلى TDP2 لتحفيز النسخ المتماثل الفعال للحمض النووي الريبي الفيروسي عن طريق تثبيط تغليف الحمض النووي الريبي السابق لأوانه. نظرًا لأن مستويات نشاط VPg uninkase لا يبدو أنها تتغير أثناء الإصابة بفيروس شلل الأطفال (7) ، فإن هذا السيناريو يشير إلى أن البروتينات TDP2 والبروتينات الفيروسية المشاركة في تغليف vRNA تتنافس مع vRNAs الوليدة. بالنظر إلى الأدلة الجينية والكيميائية الحيوية على اقتران تكاثر الحمض النووي الريبي لفيروس بيكورنا وتغليفه (24 ، 25) ، قد يتم حظر TDP2 أو عزله من vRNAs الوليدة بعد تراكم مستويات كافية من البروتينات الفيروسية ، مما يؤدي إلى زيادة إنتاج فيروسات ذرية. يتم عرض هذا السيناريو المحتمل ، المدعوم ببيانات التصوير المتحد البؤر الخاصة بنا ، في النموذج الموضح في الشكل 5. ضمنيًا في نموذجنا هو التنبؤ بأن العدوى الفيروسية تعدل النشاط أو الموقع الخلوي لإلغاء ارتباط TDP2 / VPg لتقييد وصولها إلى الحمض النووي الريبي الفيروسي في وقت متأخر من الدورة المعدية. سيكون من الضروري إجراء عدوى فيروس بيكورنا في زراعة الخلايا في حالة عدم وجود TDP2 (بعد ضربة قاضية RNAi أو الاستئصال الجيني) لتحديد ما إذا كان هناك انخفاض ناتج في مستويات تكاثر الحمض النووي الريبي الفيروسي (وفي النهاية ، في غلة الفيروس) بسبب التغليف السابق لأوانه لـ vRNAs أو بدء الترجمة غير الفعالة في بداية الإصابة. هذا التوقع ، إذا كان صحيحًا ، سيجعل نشاط VPg غير المحبب لـ TDP2 هدفًا جذابًا للعلاجات المضادة للفيروسات التي تهدف إلى تقليل الحمل الفيروسي لدى الأفراد المصابين بفيروسات البيكورنا مثل فيروس الأنف البشري أو الفيروس المعوي 71 (EV71) ، خاصةً بالنظر إلى المراضة عند الرضع والأطفال المصابين بهذه الفيروسات (26 ، 27). يتمثل أحد التحذيرات في TDP2 كهدف علاجي للسيطرة على عدوى فيروس بيكورنا في التأثيرات السامة المحتملة التي قد تحدثها مثل هذه العلاجات على الخلايا ، نظرًا للأدوار الطبيعية التي يلعبها هذا البروتين في إصلاح الحمض النووي والإشارات الخلوية. ومع ذلك ، قد يكون من الممكن تصميم مثبطات جزيئات صغيرة تستهدف الآلية التي يستخدمها الفيروس لاختطاف TDP2 دون التأثير على وظيفته الخلوية.

عزل TDP2 - نموذج التدريع vRNA النسل. (أ) يتم قطع ارتباط VPg-RNA للـ virion RNA (vRNA) بعد إطلاقه من الفيروس المصاب بالعدوى بواسطة TDP2 (رمز "pac-man" الأصفر) ، والذي يولد mRNA الفيروسي و VPg المجاني (الكرة الخضراء). بعد الترجمة ، يتم استخدام mRNA الفيروسي كقالب (-) تخليق RNA بواسطة البوليميراز الفيروسي (3D pol) (الأشكال البيضاوية البرتقالية). ثم يتم استخدام الحمض النووي الريبي (-) حبلا بواسطة 3D pol كقالب في (+) تخليق RNA لتوليد vRNA ، والذي يكون إما مغلفًا أو غير مرتبط للمشاركة في الترجمة الفيروسية وتكرار الحمض النووي الريبي. (ب) خلال المرحلة المتأخرة من دورة النسخ المتماثل ، يتم استبعاد TDP2 من مواقع تخليق وتغليف الحمض النووي الريبي الفيروسي ، مما يسمح بتوليد فيروسات ذرية.

باختصار ، تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى حل لغز مُمْرِض للمضيف ظل بعيد المنال لأكثر من ثلاثة عقود. على حد علمنا ، يعتبر إنزيم TDP2 فريدًا من حيث نسب نشاط فوسفوديستراز 5′-tyrosyl-RNA. إنزيم الثدييات القادر على نشاط 3′-tyrosyl-DNA phosphodiesterase (Tdp1) يؤوي نشاطًا محدودًا من 3-nucleosidase قادر على العمل على ركائز كل من DNA و RNA (28). ومع ذلك ، حتى الآن لم يتم الإبلاغ عن هذا الإنزيم لشق روابط التيروزيل-الرنا. قد يكون النشاط الفريد لـ TDP2 في التحلل المائي لكل من ارتباطات Tyrosyl-RNA و tyrosyl-DNA نتيجة للتشابهات المشتركة بين DNA و RNA. يمكن أن يكون أيضًا نتيجة لتطور المسارات الكيميائية الحيوية باستخدام إنزيمات شبيهة بـ TDP2 لإصلاح أو تنظيم وظيفي لأنواع فريدة من البروتين - الحمض النووي. قد تكون قدرة TDP2 على التحلل المائي للروابط بين البروتين والحمض النووي الريبي هي الأثر المتبقي لإنزيم أسلاف في عالم الحمض النووي الريبي الذي اكتسب ، أثناء التطور ، القدرة على شق روابط البروتين والحمض النووي والتوسط في وظائف جديدة (على سبيل المثال ، النسخ التنظيم ونقل الإشارة) عبر تفاعلات البروتين والبروتين دون تعطيل نشاط فسفودايستراز RNA النوعي القديم.


نتائج

تحليل التسلسل ونمط التعبير والتوطين الخلوي لـ NbDCP1 و NbDCP2 و NbXRN4 و NbPARN

لقد بدأنا هذه الدراسة عن طريق استنساخ أربعة مفاتيح وتسلسلها 5’RDGs من عند ن. بنتاميانا، بما فيها NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 و NbPARN. كشف تحليل التسلسل أن إطارات القراءة المفتوحة (ORFs) من NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 و NbPARN تحتوي على 1113 nt (رقم انضمام GenBank: KY402210) ، 966 nt (رقم انضمام GenBank: KY402211) ، 2949 nt (رقم انضمام GenBank: KY402212) ، و 2056 nt (رقم انضمام GenBank: KY402213) ، على التوالي. تشترك تسلسلات الأحماض الأمينية المستخلصة من NbDCP1 و NbDCP2 و NbXRN4 و NbPARN بنسبة 70.2٪ و 68.4٪ و 67.1٪ و 62٪ مع نظيراتها AtDCP1 و AtDCP2 و AtXRN4 و AtPARN من Arabidopsis ، على التوالي. لتوثيق ميزات الأحياء الأساسية لهذه المجموعات الخمسة من ن. بنتاميانا، حددنا نمط التعبير عن هذه الجينات والتوطين الخلوي لبروتيناتها المشفرة. تم إجراء النسخ العكسي الكمي في الوقت الحقيقي PCR (qRT-PCR) باستخدام مجموع الحمض النووي الريبي المعزول من مختلف ن. بنتاميانا المناديل كقالب. تم التعبير عن الجينات الأربعة بشكل أساسي ولكن مستويات التعبير الخاصة بهم اختلفت في الأنسجة المختلفة (الشكل 1 أ). بشكل عام ، أظهرت جميع الجينات الأربعة أعلى مستوى تعبير في أنسجة الجذر ، وأدنى مستوى في الأنسجة الجذعية.

(أ) تحليل qRT-PCR لـ NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 و NbPARN مستويات التعبير في أنسجة مختلفة من ن. بنتاميانا. تم تطبيع التعبير ضد NbActin النصوص ، التي تعمل كمعيار داخلي. تم اشتقاق كل قيمة متوسطة من ثلاث تجارب مستقلة (ن = 3 عينات). تمثل القيم المتوسط ​​± الانحراف المعياري (SD). (ب) صور مجهرية تظهر الخلايا من أوراق H2B-RFP المعدلة وراثيا ن. بنتاميانا التعبير عن YFP-NbDCP1 أو YFP-NbDCP2 أو YFP-NbXRN4 أو YFP-NbPARN. القضبان = 50 ميكرومتر. (ج) تم تطبيق تحليل اللطخة الغربية (WB) لمجموع مستخلصات البروتين من الأوراق المتسللة كما هو موضح في (ب) بعد 32 ساعة بعد التسلل (hpi) ، تم تطبيق الجسم المضاد ضد GFP (WB: GFP). تشير العلامات النجمية الحمراء إلى أحجام النطاق المتوقعة. تم استخدام وحدة Rubisco الكبيرة ذات اللون الأزرق اللامع Coomassie كعنصر تحكم في التحميل.

لفحص التوطين الخلوي لهذه الأربعة ن. بنتاميانا 5’RDGs ، تم إدخال مناطق الترميز الخاصة بهم أولاً في ناقل pDNOR221 عن طريق تفاعل BP (Invitrogen) ، متبوعًا بإعادة التركيب في إطار المصب لتسلسل ترميز بروتين مضان أصفر (YFP) عن طريق تفاعل LR (Invitrogen). تم التعبير عن الجينات الكيميرية بشكل عابر في أوراق H2B-RFP المعدلة وراثيا ن. بنتاميانا النباتات ، وتم فحص التألق في الأوراق المعدلة وراثيا المتسربة بالزراعة في 32 ساعة بعد التسلل (HPI) عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 1 ب). كان YFP-NbDCP1 موجودًا في الغالب في السيتوبلازم ، مكونًا الحبيبات المستديرة ، بينما كانت الثلاثة الأخرى بما في ذلك YFP-NbDCP2 و YFP-NbXRN4 و YFP-NbPARN واضحة في كل من السيتوبلازم والنواة ، وبعض YFP-NbDCP2 و YFP-NbXRN4 و YFP-NbPARN مجمعة لتكوين حبيبات في السيتوبلازم أيضًا (الشكل 1 ب). النشاف الغربي باستخدام الجسم المضاد GFP (WB: GFP) (الشكل 1 ج) اكتشف النطاق المتوقع والمحدّد المقابل لبروتين NbDCP1 و NbDCP2 و NbXRN4 و NbPARN الموسوم YFP ، مما يؤكد وجود بروتينات مؤتلفة كاملة الطول.

التفاعل والتوطين المشترك لـ NbDCP1 و NbDCP2 و NbXRN4

لتحديد ما إذا كانت NbDCP1 و NbDCP2 و NbXRN4 تتفاعل مع بعضها البعض ، أجرينا فحوصات تكميلية مضان ثنائية الجزيئية (BiFC) [25]. تم التعبير عن البروتينات الموسومة N- و C-YFP بشكل مشترك في أوراق H2B-RFP المعدلة وراثيًا ن. بنتاميانا النباتات وتحليلها عن طريق الفحص المجهري للخلية الحية عند 32 نقطة في البوصة (الشكل 2 أ). أظهر كل من NbDCP1 و NbDCP2 و XRN4 تفاعلات إيجابية. تم دمج P3N-PIPO ، وهو بروتين حركة مخصص لـ TuMV [26] ، في N- أو C-YFP لخدمة تحكم سلبي (الشكل 2 أ). تم استخدام البروتينات الفيروسية P3N-PIPO و CI التي تتفاعل لتشكيل معقد لحركة الفيروس من خلية إلى خلية [27] كعنصر تحكم إيجابي (S1 التين). ومن المثير للاهتمام أن مركب التفاعل الذاتي NbDCP2 كان موجودًا في السيتوبلازم وكذلك في النواة. باستثناء مركب التفاعل الذاتي NbDCP2 ومجموعة NbDCP2-N-YFP و NbXRN4-C-YFP ، وكلاهما تم توزيعهما بالتساوي في السيتوبلازم ، شكلت جميع التركيبات المتبقية بؤر السيتوبلازم ، بغض النظر عن الانصهار المتبادل مع N- أو C -YFP (الشكل 2 أ).

(أ) فحوصات BiFC بين NbDCP1 و NbDCP2 و NbXRN4 في H2B-RFP المعدلة وراثيًا ن. بنتاميانا يترك عند 32 نقطة في البوصة. نتج التألق الأصفر (الأخضر) عن تفاعل اثنين من البروتينات المختبرة الموسومة بالنصف الطرفي C من YFP (C-YFP) أو النصف N-terminal من YFP (N-YFP). يشار إلى نوى خلايا البشرة بأوراق التبغ بالتعبير عن التحوير H2B-RFP (أحمر). تعمل P3N-PIPO الموسومة بواسطة C-YFP أو N-YFP كعنصر تحكم سلبي. القضبان = 50 ميكرومتر. (ب) التوطين المشترك لـ NbDCP1 و NbDCP2 و NbXRN4 في H2B-RFP المعدلة وراثيًا ن. بنتاميانا الخلايا الورقية بسرعة 32 نقطة في البوصة. تنتج الإشارات الصفراء عن تداخل NbDCP1-CFP (أخضر) مع YFP-NbDCP2 (أحمر) أو YFP-NbXRN4 (أحمر) أو NbDCP2-CFP (أخضر) مع YFP-NbXRN4 (أحمر). الأشكال الداخلية هي الصور المكبرة للمناطق الموجودة في المربعات البيضاء في اللوحات المقابلة. يظهر H2B-RFP باللون الأزرق. القضبان = 50 ميكرومتر.

لقد أجرينا كذلك اختبار التوطين المشترك لتأكيد ما إذا كانت مجمعات التفاعل هذه تتشكل في نفس مجمعات البروتين. بروتين الفلورسنت السماوي C (CFP) المنصهر NbDCP1 (NbDCP1-CFP) و N-terminal YFP المنصهر NbDCP2 (YFP-NbDCP2) أو NbXRN4 (YFP-NbXRN4) أو C-terminal CFP المنصهرة NbDCP2 (NbDCP2-CFP) تم التعبير عن -NbXRN4 بشكل مشترك في أوراق H2B المعدلة وراثيًا ن. بنتاميانا النباتات ، وتم إجراء الفحص المجهري متحد البؤر عند 32 نقطة في البوصة. وجدنا أن NbDCP1-CFP و YFP-NbDCP2 أو YFP-NbXRN4 قد تمت ترجمتهما معًا في السيتوبلازم لتشكيل الحبيبات الساطعة (الشكل 2 ب). كما لوحظت هذه البؤر الساطعة في سيتوبلازم الخلايا التي تشارك في التعبير عن NbDCP2-CFP و YFP-NbXRN4 (الشكل 2 ب). مجتمعة ، تشير هذه البيانات إلى أن NbDCP1 و NbDCP2 و NbXRN4 يمكن أن تشكل مجمعات بروتينية من خلال تفاعلات البروتين البروتين.

فشل التعبير الزائد عن NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN في قمع إسكات RNA الناجم عن GFP

أفادت العديد من الدراسات الحديثة أن المكونات الأساسية لمسار اضمحلال الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي 5'-3 'بما في ذلك XRN4 و DCP2 يمكن أن تثبط تأثير PTGS الناجم عن الحمض النووي الريبي (S-PTGS) ، ولكن لا يتم عكس PTGS الناجم عن الحمض النووي الريبي (IR-PTGS) في Arabidopsis ، مما يشير إلى أن إسكات RNA ومسارات تحلل RNA 5'-3 'مترابطة ، ربما عن طريق مشاركة نفس ركيزة RNA [28،29]. على الدوام ، فإن التنازل عن التحلل غير المعقول أو التثبيط أو النشاط الخارجي يعزز S-PTGS ، الأمر الذي يتطلب مضيفًا يعتمد على RNA بوليميريز 6 (RDR6) و SUPPRESSOR OF GENE SILENCING 3 (SGS3) لتحويل الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة إلى dsRNA لتحفيز PTGS [30،31]. لتحديد ما إذا كان ملف ن. بنتاميانا تؤثر 5’RDGs أيضًا على S-PTGS و IR-PTGS مثل تلك الموجودة في Arabidopsis ، الأجرعية الثقافات التي تعبر عن 35S-GFP ، 35S-GF (GF: جزء من GFP يمكن أن يحفز S-PTGS ، الشكل 3 أ) و NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN التي تحمل علامات N-Myc تم اختراقها بشكل مشترك ن. بنتاميانا أوراق. تخدم الأوراق التي تم اختراقها باستخدام 35S-GFP و 35S-GF وناقلًا فارغًا (Vec) أو ناقل للتعبير عن TBSV P19 (مثبط إسكات الجينات المعروف) عناصر تحكم. الترشيح الزراعي ن. بنتاميانا يترك مع 35S-GFP ، 35S-GF و Vec المستحثة GFP إسكات الحمض النووي الريبي ، وأدى إلى تقليل مضان GFP تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في 5 أيام بعد التسلل (نقطة في البوصة) (الشكل 3 ب). بينما زادت شدة التألق الأخضر بشكل كبير في بقع الأوراق التي تعبر عن GFP و P19 ، لم يلاحظ أي اختلافات واضحة في التألق بين بقع الأوراق التي شاركت في التعبير عن علامات Myc NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN أو التسلل المشترك مع التحكم في ناقلات (الشكل 3 ب). لذلك ، لم يكن التعبير العابر للأربعة 5’RDGs قادرًا على قمع إحساس مشغل الحمض النووي الريبي (35S-GF) الناجم عن GFP إسكات. على العكس من ذلك ، أدى التعبير عن 5’RDGs إلى توليد المزيد من siRNAs المشتقة من GFP والمستويات المنخفضة من GFP مرنا والبروتين ، مما يعزز إسكات الحمض النووي الريبي الناجم عن GFP (الشكل 3 D و 3 F). درسنا أيضًا التأثيرات المحتملة لـ 5’RDGs على إسكات الجينات الناجم عن الرنا المزدوج الجديلة. على غرار الملاحظات السابقة [28-30] ، لم يكن هناك قمع أو تحسين واضح لإسكات الحمض النووي الريبي ، عندما تم التعبير عن 35S-dsGF (dsRNA of GF) كمشغل إسكات مشترك مع 35S-GFP و N-Myc الموسومة NbDCP1 ، NbDCP2 ، NbXRN4 أو NbPARN بتنسيق ن. بنتاميانا أوراق (الشكل 3C و 3E و 3G). كعنصر تحكم إيجابي ، قام P19 بقمع S-PTGS و IR-PTGS ، وتكثيف مضان GFP ، والذي تم تأكيده بواسطة تحليلات لطخة مناعية و RNA (تين. 3). مجتمعة هذه البيانات تبين أن الأربعة ن. بنتاميانا من المحتمل أن تشارك 5’RDGs في S-PTGS الناجم عن GFP ، ولكن ليس في IR-PTGS.

(أ) التمثيل التخطيطي لجزء الحمض النووي الريبي المشتق من ناقلات التعبير GFP و GF و dsGF. (ب ، ج) صور لأوراق تمثيلية متسللة بالزراعة تم التقاطها بدقة 5 نقطة في البوصة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تم ترشيح بقع الأوراق بثلاثة نواقل بما في ذلك 35S-GFP و 35S-GF (أو 35S-dsGF) وأحد النواقل التالية: ناقل فارغ (Vec) و Myc-tagged-NbDCP1 و NbDCP2 و NbXRN4 و NbPARN و TBSV p19 (ب). وتم الحصول على نتائج مماثلة من ثلاث تجارب مستقلة. (د ، ه) تحليلات التراكمات النسبية GFP mRNAs بواسطة qRT-PCR محدد في الأوراق المخترقة الموضحة في (B ، C) عند 5 نقطة في البوصة. NbActin بمثابة معيار داخلي. تم حساب كل قيمة متوسطة بناءً على ثلاث تجارب مستقلة (ن = 3 عينات). تمثل القيم المتوسط ​​± SD. تشير العلامات النجمية المزدوجة إلى اختلاف كبير جدًا مقارنة بـ 35S-GFP + 35S-GF + Vec (D) أو 35S-GFP + 35S-dsGF + Vec (E) (ص & lt 0.01 ، للطالب ر اختبار). (F ، G) تراكمات بروتين GFP ، Myc-tag-NbDCP1 ، NbDCP2 ، NbXRN4 ، بروتين NbPARN ، GFP mRNAs و siRNAs في الأوراق المخترقة الموضحة في (B ، C) بدقة 5 نقطة في البوصة. تم تحليل مستويات البروتين عن طريق التحليل المناعي باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP (WB: GFP) أو Myc (WB: Myc). تلطيخ Coomassie باللون الأزرق اللامع (CBB) للوحدة الفرعية الكبيرة من Rubisco ، وتلطيخ بروميد الإيثيديوم من الرنا الريباسي ، و U6 بمثابة عنصر تحكم في التحميل لطخة مناعية ، وصمة عار مرنا ، وصمة عار سيرنا ، على التوالي. تم قياس قيم GFP siRNAs / U6 بواسطة برنامج ImageJ ثم تم تطبيعها مقابل القيمة المتوسطة المقابلة لمعاملة Vec ، والتي تم ضبطها على 1.00.

الضربة القاضية لـ NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 و NbPARN يثبط S-PTGS ، وليس IR-PTGS

لتحديد ما إذا كانت NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN متورطة في إسكات RNA ، ثلاثة متجهات تعبيرية بما في ذلك 35S-GFP و 35S-GF وبنية RNAi القاسية التي تحتوي على NbDCP1 (dsNbDCP1) أو NbDCP2 (dsNbDCP2) أو NbXRbX4 تم ترشيح متواليات (dsNbPARN) تحت سيطرة مروج فيروس القرنبيط الفسيفسائي (CaMV) 35S ، بالزراعة إلى أوراق ن. بنتاميانا النباتات. بالمقارنة مع مضان GFP ضعيف في ن. بنتاميانا تم اختراق بقع الأوراق باستخدام 35S-GFP و 35S-GF و Vec ، وأدى التعبير عن dsNbDCP1 أو dsNbDCP2 أو dsNbXRN4 أو dsNbPARN إلى زيادة التألق الأخضر في المناطق التي تم اختراقها (الشكل 4 أ) ، مما يشير إلى أن إسكات NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 أو NbPARN قمع الشعور بإسكات الحمض النووي الريبي الناجم عن GFP. وفقًا لذلك ، كشفت تحليلات qRT-PCR و RNA لطخة البروتين وهلام البروتين أن قمع إسكات GFP بواسطة dsNbDCP1 أو dsNbDCP2 أو dsNbXRN4 أو dsNbPARN كان مصحوبًا بمستويات متزايدة من GFP مرنا والبروتين ، وانخفاض مستويات siRNAs الخاصة بـ GFP في الأوراق المخترقة (الشكل 4 ب و 4 ج). كعنصر تحكم ، فشل إنشاء RNAi القاسي لـ GUS في قمع S-PTGS (S2B التين) ، مشيرًا إلى أن الضربة القاضية لـ NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 و NbPARN يثبط بشكل خاص S-PTGS ، ولا يؤدي التعبير عن dsRNA غير ذي الصلة إلى تحميل زائد ويمنع آلية الإسكات. عندما تم التعبير عن 35S-GFP و 35S-dsGF بالاشتراك مع dsNbDCP1 أو dsNbDCP2 أو dsNbXRN4 أو dsNbPARN في ن. بنتاميانا، لم يتم اكتشاف مضان GFP في المناطق التي تم اختراقها ، على غرار بقع الأوراق المخترقة Vec (الشكل 4 د). في المقابل ، تم إثبات إشارات GFP القوية في بقع التعبير المشترك P19. أظهرت بقع siRNA الخاصة بـ GFP أنه بالمقارنة مع Vec ، فإن إسكات NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 أو NbPARN قمع بشكل كبير إنتاج siRNAs الثانوية ('P' siRNAs) خلال S-PTGS ، ولكن لم تظهر أي تغييرات واضحة في تراكم siRNAs الأولية ('GF' siRNAs) خلال IR-PTGS (الشكل 4E و 4F). تدعم هذه البيانات مشاركة NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN في S-PTGS التي يسببها GFP ، ولكنها لا تشارك في IR-PTGS.

(ميلادي) تصور التألق الأخضر للأوراق التمثيلية المتسربة بالزراعة. تم تسلل بقع الأوراق بثلاثة ناقلات تعبير بما في ذلك 35S-GFP و 35S-GF (أو 35S-dsGF) وأحد النواقل التالية: ناقل فارغ (Vec) ، dsNbDCP1 ، dsNbDCP2 ، dsNbXRN4 ، dsNbPARN ، P19 ، Myc-tagged- NbDCP1 و NbDCP2 و NbXRN4 و NbPARN. تم التقاط الصور بدقة 5 نقطة في البوصة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. وتم الحصول على نتائج مماثلة من ثلاث تجارب مستقلة. (يكون) التراكم النسبي GFP mRNAs في البقع المتسللة بالزراعة للأوراق المتسللة المشار إليها في (أ) و (د) ، على التوالي. تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي عند 5 نقطة في البوصة و GFP تم تحليل مرنا بواسطة qRT-PCR. NbActin بمثابة معيار داخلي. تم اشتقاق كل قيمة متوسطة من ثلاث تجارب مستقلة (ن = 3 عينات). تمثل القيم المتوسط ​​± SD. تشير العلامات النجمية المزدوجة إلى فرق كبير للغاية مقارنة بـ 35S-GFP + 35S-GF + Vec (B) أو 35S-GFP + 35S-dsGF + Vec (E) (ص & lt 0.01 ، للطالب ر اختبار). (ج ، واو) تراكم بروتين GFP ، GFP mRNA و siRNAs في الأوراق المخترقة الموضحة في (A) و (D) ، على التوالي. تم جمع العينات بدقة 5 نقطة في البوصة. يعمل تلطيخ CBB للوحدة الفرعية الكبيرة من Rubisco ، وتلطيخ بروميد الإيثيديوم من الرنا الريباسي ، و U6 كعنصر تحكم في التحميل لطخة مناعية ، وصمة عار مرنا ، وصمة عار سيرنا ، على التوالي. تم قياس قيم GFP siRNAs / U6 بواسطة برنامج ImageJ ثم تم تطبيعها مقابل القيمة المتوسطة المقابلة لمعاملة Vec ، والتي تم ضبطها على 1.00.

تتحلل NbDCP1 و NbDCP2 و NbXRN4 و NbPARN GFP RNA عبر مسار اضمحلال RNA في النباتات التي تعاني من نقص RDR6

لتحليل دور NbDCP1 و NbDCP2 و NbXRN4 و NbPARN في تحلل الحمض النووي الريبي في غياب S-PTGS ، استخدمنا النباتات المعدلة وراثيًا dsRDR6 ، وبهذا المعنى GFP تم اختراق S-PTGS المستحث [32]. تم اختراق ثلاثة نواقل تعبيرية بما في ذلك 35S-GFP و 35S-GF وواحد من المتجهات التالية: NbDCP1 و NbDCP2 و NbXRN4 و NbPARN وناقل فارغ (Vec) إلى dsRDR6 المعدلة وراثيًا ن. بنتاميانا أوراق. عند 5 نقطة في البوصة ، تسلل التصحيح الورقي بـ 35S-GFP و 35S-GF و Vec لا يزال يُظهر أن مضان GFP القوي بسبب قمع S-PTGS في dsRDR6 ن. بنتاميانا الأوراق مقارنة بالرقعة المقابلة في النوع البري (بالوزن) ن. بنتاميانا أوراق (الشكل 5 أ). أدى التعبير عن NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN في النباتات المعدلة وراثيًا dsRDR6 إلى تقليل مضان GFP بالمقارنة مع عنصر التحكم Vec (الشكل 5 أ). كشفت تحليلات qRT-PCR و RNA وطلاء هلام البروتين أن التألق المنخفض في بقع الأوراق التي تعبر عن NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN كان مصحوبًا بتخفيض كلاهما. GFP مرنا والبروتين ، ولكن بدون زيادة siRNAs الخاصة بـ GFP (الشكل 5 ب و 5 ج). تشير هذه البيانات إلى أنه في النباتات التي تعاني من نقص RDR6 ، يقوم NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN بإيقاف GFP التعبير من خلال مسار اضمحلال الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختراق 35S-GFP و 35S-GF أيضًا باستخدام dsNbDCP1 أو dsNbDCP2 أو dsNbXRN4 أو dsNbPARN في بقع أوراق dsRDR6. بما يتوافق مع بياناتنا في الشكل 4، تمت ملاحظة مضان أقوى بكثير والمزيد من تراكمات الحمض النووي الريبي GFP عندما تم التعبير عن dsNbDCP1 أو dsNbDCP2 أو dsNbXRN4 أو dsNbPARN مع 35S-GFP و 35S-dsGF مقارنة بـ Vec عند 7 نقطة في البوصة (S3 التين). مجتمعة ، تشير هذه البيانات إلى أن جميع المجموعات الخمس RDGs تعزز إسكات الحمض النووي الريبي للهدف GFP RNA بالوزن ن. بنتاميانا النباتات وتتحلل GFP النسخ من خلال تحلل الحمض النووي الريبي في النباتات التي تعاني من نقص RDR6 حيث يتم حظر S-PTGS. وبالتالي ، فإن إسكات الحمض النووي الريبي مقارنةً بتآكل الحمض النووي الريبي له الأولوية للتحلل GFP RNA.

(أ) تصور التألق الأخضر للأوراق التمثيلية المتسربة بالزراعة. تم التقاط صور للأوراق التمثيلية المتسربة بدقة 5 نقطة في البوصة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. النوع البري (بالوزن) ن. بنتاميانا أو dsRDR6 المعدلة وراثيا ن. بنتاميانا (dsRDR6) تم ترشيح نباتات (dsRDR6) بواسطة ثلاثة نواقل تعبيرية بما في ذلك 35S-GFP و 35S-GF وواحد من النواقل التالية: ناقل فارغ (Vec) كعنصر تحكم ، Myc-tagged-NbDCP1 ، NbDCP2 ، NbXRN4 ، و NbPARN. وتم الحصول على نتائج مماثلة من ثلاث تجارب مستقلة. (ب) تراكم بروتين GFP ، GFP mRNA و siRNAs في الأوراق المخترقة الموضحة في (A) عند 5 نقطة في البوصة. يعمل تلطيخ CBB للوحدة الفرعية الكبيرة من Rubisco ، وتلطيخ بروميد الإيثيديوم من الرنا الريباسي ، و U6 كعنصر تحكم في التحميل لطخة مناعية ، وصمة عار مرنا ، وصمة عار سيرنا ، على التوالي. (ج) التراكم النسبي GFP تم تحليل mRNAs بواسطة qRT-PCR محدد في الأوراق المخترقة الموضحة في (A) عند 5 نقطة في البوصة. NbActin بمثابة معيار داخلي. تم حساب كل قيمة متوسطة بناءً على ثلاث تجارب مستقلة (ن = 3 عينات). تمثل القيم المتوسط ​​± SD. تشير العلامات النجمية المزدوجة إلى اختلاف كبير جدًا مقارنة بـ 35S-GFP + 35S-GF + Vec / dsRDR6 (ص & lt 0.01 ، للطالب ر اختبار). تم قياس قيم GFP siRNAs / U6 بواسطة برنامج ImageJ ثم تم تطبيعها مقابل القيمة المتوسطة المقابلة لمعاملة Vec بالوزن. ن. بنتاميانا ، والتي تم ضبطها على 1.00.

العدوى الفيروسية تنظم مسار اضمحلال الحمض النووي الريبي

لتوضيح دور تسوس الحمض النووي الريبي في عدوى TuMV ، حددنا مستويات التعبير للأربعة 5’RDGs في الأوراق المحلية والجهازية المصابة بـ TuMV ن. بنتاميانا النباتات بدقة 3 و 10 نقطة في البوصة باستخدام qRT-PCR (الشكل 6 أ و 6 ب). مستويات التعبير عن الأربعة 5’RDGs تم تنظيمها بشكل كبير في كل من الأوراق المحلية والجهازية استجابةً لعدوى TuMV (الشكل 6 أ و 6 ب). لقد تحققنا كذلك مما إذا كانت بروتينات استنساخ TuMV أو حويصلات النسخ مرتبطة بأجسام P. بروتين القطع DCP1 هو علامة راسخة للأجسام P في النباتات [11،33]. شاركنا في التعبير عن NbDCP1-CFP وثلاثة بروتينات مطلوبة للتكرار المشفر بواسطة TuMV بما في ذلك 6K2 (الذي يؤدي إلى تكوين حويصلات تكاثر فيروسي لتكاثر الفيروس) و 6K2-NIa-VPg (يحتوي على البروتين الفيروسي المرتبط بالجينوم VPg) و NIb ( RNA polymerase الفيروسي الوحيد المعتمد على RNA) مع YFP الموسومة إلى الطرف C الخاص بها. لم يلاحظ أي إشارات توطين مشتركة نموذجية بين NbDCP1 وهذه البروتينات الفيروسية (الشكل 6 ج). تم أيضًا اختبار التوطين المشترك المحتمل بين 5’RDGs وبروتينات النسخ الفيروسي باستخدام نسختين من TuMV المعدية TuMV-6K2-mCherry و TuMV-CFP-NIb [34،35]. الأول يحتوي على نسخة إضافية من mCherry-tagged 6K2 ، وفي الأخير ، يتم تمييز NIb بواسطة N-terminal CFP. لم يتم العثور على توطين مشترك بين NbDCP1 وحويصلات النسخ الفيروسي المسمى 6K2 أو NIb الموسومة بـ CFP (الشكل 6 د). هذه تشير إلى أن عدوى TuMV تنظم مسار تحلل الحمض النووي الريبي الذي لا يرتبط على ما يبدو بمركب تكاثر الفيروس.

(أ ، ب) مستويات التعبير NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 و NbPARN تم تحليلها بواسطة qRT-PCR في وهمية (عازلة تسلل) أو تم اختراق TuMV ن. بنتاميانا الأوراق بدقة 3 نقطة في البوصة (أ) أو الأوراق الجديدة العليا بدقة 10 نقطة في البوصة (ب). NbActin كمعيار داخلي. تم حساب كل قيمة متوسطة بناءً على ثلاث تكرارات بيولوجية مستقلة (ن = 3 عينات). تمثل القيم المتوسط ​​± SD. تشير العلامات النجمية المزدوجة إلى اختلاف مهم للغاية مقارنةً بالمحاكاة عند 3 نقطة في البوصة (أ) أو 10 نقطة في البوصة (ب) (ص & lt 0.01 ، للطالب ر اختبار). (ج) تحليل الفحص المجهري متحد البؤر للخلايا التي تعبر عن NbDCP1-CFP (باللون الأخضر) و 6 K2-YFP (اللوحة الأولى ، الحمراء) ، أو 6K2-NIa-VPg-YFP (اللوحة الثانية ، الحمراء) ، أو NIb-YFP (الجزء الثالث ، الأحمر) ) عند 32 نقطة في البوصة. قضبان ، 25 ميكرومتر. (د) الفحص المجهري متحد البؤر للخلايا التي تعبر عن NbDCP1-YFP (باللون الأخضر) و TuMV-6K2-mCherry (اللوحة الأولى واللوحة الثانية ، باللون الأحمر) أو TuMV-CFP-NIb (اللوحة الثالثة ، الأحمر) بسرعة 72 نقطة في البوصة. تظهر الصورة المكبرة للمنطقة في المربع الأبيض في اللوحة I في اللوحة II. القضبان = 50 ميكرومتر.

يمنع التعبير المشترك عن NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN تراكم الحمض النووي الريبي TuMV

لفحص ما إذا كانت هذه ن. بنتاميانا 5’RDGs تؤثر على تراكم الحمض النووي الريبي TuMV ، تم التسلل إلى TuMV-GFP ن. بنتاميانا يترك مع NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN أو ناقل فارغ (Vec). عند 3 نقطة في البوصة ، تسللت بقع الأوراق بهذه ن. بنتاميانا أظهرت 5’RDGs أضعف GFP مضان مقارنة مع التحكم Vec (الشكل 7 أ). نظرًا لأن GFP نشأ من الفيروس المؤتلف ، يمكن اعتبار شدة الفلورسنت الخاصة به مؤشرًا على تكرار TuMV. أكدت تحليلات qRT-PCR انخفاض مستويات الحمض النووي الريبي الفيروسي في بقع الأوراق التي تعبر عن NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN (الشكل 7 ج). باستمرار ، كان هذا الانخفاض مصحوبًا بزيادة في TuMV-siRNAs (الشكل 7F). لقد تحققنا أيضًا مما إذا كانت NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN تؤثر على عدوى TuMV في dsRDR6 المعدلة وراثيًا ن. بنتاميانا النباتات (الشكل 7 ب).أدى الإفراط في التعبير عن NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN في النباتات المعدلة وراثيًا dsRDR6 إلى تثبيط عدوى TuMV أيضًا ، كما يتضح من مضان GFP الموهن وانخفاض مستويات الحمض النووي الريبي الفيروسي (الشكل 7 ب و 7 ج). ومن المثير للاهتمام ، أنه تم اكتشاف كميات ملحوظة من siRNAs المشتقة من TuMV في عينة التحكم المخترقة Vec للنباتات المعدلة وراثيًا dsRDR6 ، ربما بسبب الإسكات الأولي الناجم عن dsRNA الفيروسي (الوسائط التكاثرية الفيروسية للحمض النووي الريبي) أثناء التكاثر الفيروسي القوي (الشكل 7F). توضح هذه البيانات أن التعبير عن 5’RDGs يمنع تراكم الحمض النووي الريبي TuMV في كل من النباتات المعدلة وراثيًا Wt و dsRDR6.

(أ ، ب) مضان GFP في Wt أو RDR6 ناقص (dsRDR6) ن. بنتاميانا يترك التسلل المشترك مع TuMV-GFP وأحد النواقل التالية: Vec أو NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN بدقة 3 نقطة في البوصة. (ج) تحليلات qRT-PCR لمستويات TuMV RNA. تم استخراج الحمض النووي الريبي من البقع المخترقة الموضحة في (أ) بدقة 3 نقطة في البوصة. تم تطبيع كل قيمة مقابل NbActin النصوص في نفس العينة. تمثل أشرطة الخطأ SD (ن = 3 تكرارات بيولوجية مستقلة). تشير العلامات النجمية المزدوجة إلى اختلاف كبير جدًا مقارنة بمعالجة Vec (ص & lt 0.01 ، للطالب ر اختبار). (د ، هـ) مضان GFP في Wt أو RDR6 ناقص (dsRDR6) ن. بنتاميانا يترك التسلل المشترك مع TuMV-GFP-ΔGDD (متحولة معيبة في النسخ المتماثل) وأحد النواقل التالية: Vec أو NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN بدقة 3 نقطة في البوصة. (F) تراكم TuMV siRNAs في البقع المخترقة الموضحة في (A ، B ، D ، E) بدقة 3 نقطة في البوصة. تم إجراء النشاف الشمالي باستخدام تحقيقات DNA المسمى DIG المكملة لجينوم TuMV. يعمل U6 كعنصر تحكم في تحميل لطخة siRNA ، على التوالي. تم قياس قيم GFP siRNAs / U6 بواسطة برنامج ImageJ ثم تم تطبيعها مقابل القيمة المتوسطة المقابلة لمعاملة Vec ، والتي تم ضبطها على 1.00.

لفحص 5’RDGs بوساطة الدفاع المضاد للفيروسات دون إسكات أولي بوساطة dsRNA في Wt و dsRDR6 المعدلة وراثيا ن. بنتاميانا، استخدمنا استنساخ معدي TuMV ناقص النسخ المتماثل ، TuMV-GFP-ΔGDD [36]. يسمح هذا الاستنساخ بنسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي كامل الطول في الخلية النباتية والترجمة اللاحقة للبروتينات الفيروسية. نظرًا لتحور عزر GDD المحفوظ للغاية في NIb ، يفقد الاستنساخ القدرة على التخليق الحيوي لـ RNA وتوليد وسائط RNA فيروسية مكررة. بالمقارنة مع عنصر تحكم Vec ، فإن التعبير عن NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN بالوزن ن. بنتاميانا قمع تراكم TuMV-GFP-ΔGDD RNA وعزز بشكل ملحوظ مستوى TuMV-siRNAs (الشكل 7F). في النباتات المعدلة وراثيًا dsRDR6 ، أدى الإفراط في التعبير عن NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN إلى تقليل تراكم نصوص TuMV-GFP-ΔGDD وقمع توليد نسخ TuMV-GFP-ΔGDD المشتقة من siRNAs (الشكل 7F). تشير هذه البيانات إلى أن NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN قد تتحلل من TuMV RNA عبر مسار تحلل الحمض النووي الريبي عند تعطل PTGS.

لتقليل تدخل RNA ، أجرينا أيضًا هذا الاختبار بتركيز منخفض جدًا من الثقافات الزراعية (OD600 = 0.05) التي تؤوي TuMV أو TuMV-ΔGDD. كما هو متوقع ، في نباتات Wt أو dsRDR6 المعدلة وراثيًا التي تم اختراقها بواسطة TuMV ، كان تراكم الحمض النووي الريبي الفيروسي أعلى بكثير من تلك الموجودة في الأوراق التي تم اختراقها باستخدام TuMV-ΔGDD (S4A التين). الإفراط في التعبير عن NbDCP1 أو NbDCP2 أو NbXRN4 أو NbPARN ، مقارنة بـ Vec ، انخفاض تراكمات TuMV أو TuMV-ΔGDD RNA. أدى الإفراط في التعبير عن مكونات تحلل الحمض النووي الريبي أيضًا إلى انخفاض واضح في siRNAs المشتقة من TuMV (S4B ، الشكل 7F). بسبب التسلل مع تركيز منخفض جدًا من الزراعة البكتيرية الزراعية ، لم يتم العثور على siRNAs الفيروسية في الأوراق المخترقة TuMV-ΔGDD. تشير هذه النتائج أيضًا إلى أنه أثناء التكاثر الفيروسي ، تستمد siRNAs بشكل أساسي من الوسائط التكرارية الفيروسية RNA ، والتي تتناسب مع تراكمات الحمض النووي الريبي الفيروسي ، بدلاً من siRNAs الثانوية المعتمدة على RDR6. مجتمعة ، تدعم هذه البيانات أن 5’RDGs بمثابة دفاع النبات ضد تراكم TuMV RNA.

الضربة القاضية لـ NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 أو NbPARN يعزز الالتهابات الفيروسية الموضعية والجهازية

لمزيد من التحقيق في تأثير إسكات 5’RDGs على عدوى TuMV ، ن. بنتاميانا تم ترشيح بقع الأوراق باستخدام TuMV-GFP وأحد النواقل التالية: ناقل فارغ (Vec) كعنصر تحكم ، NbDCP1 ، dsNbDCP1 ، dsNbDCP2 ، dsNbXRN4 و dsNbPARN. عند 4 نقطة في البوصة ، يتم التقليب من NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 أو NbPARN أدى إلى زيادة مستويات مضان TuMV-GFP ، وبروتينات GFP ، و TuMV RNA ، وانخفاض مستوى TuMV siRNAs (الشكل 8 أ و 8 ب و S5 الشكل). وهكذا ، إسكات NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 أو NbPARN عزز تراكمات TuMV RNA ربما من خلال قمع إنتاج siRNA المشتق من TuMV. للتحقق مما إذا كان هذا ينطبق أيضًا على عدوى TuMV النظامية ، ناقل TRV VIGS معدل يحمل التسلسل الجزئي لـ GUS (كعنصر تحكم) ، NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 أو NbPARN تم تلقيحها مسبقًا في ن. بنتاميانا لنهدم NbDCP1, NbDCP2، نbXRN4 أو NbPARN التعبير (S6 التين). ثم تم تلقيح النباتات الصامتة باستخدام TuMV-GFP. عند 6 نقطة في البوصة ، بدأت إشارات GFP في الظهور على طول الأوردة في الأوراق المطورة حديثًا تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية في النباتات المعالجة TRV-GUS (الشكل 8 ج). ومع ذلك ، كل شيء NbDCP1, NbDCP2, NbXRN4 أو NbPARNطورت النباتات ذات الصوت المنخفض إشارات GFP أقوى بكثير في الأوراق المقابلة (الشكل 8 ج). باستمرار ، تم العثور على مستويات أعلى من RNAs الفيروسية وبروتينات GFP في 5’RDGsنباتات عازلة للصوت (الشكل 8D و 8E). كما ثبت أن إسكات 5’RDGs تمنع siRNAs المشتقة من TuMV (الشكل 8E). تشير هذه البيانات إلى أن الضربات القاضية لـ 5’RDGs يسهل عدوى TuMV ويمنع siRNAs الفيروسية في ن. بنتاميانا.

(أ) مضان GFP في ن. بنتاميانا يترك التسلل المشترك مع TuMV-GFP وأحد ناقلات التعبير التالية: متجه فارغ (Vec) كعنصر تحكم ، NbDCP1 ، dsNbDCP1 ، dsNbDCP2 ، dsNbXRN4 و dsNbPARN بدقة 4 نقطة في البوصة. (ب) تحدد مستويات TuMV RNA النسبية بواسطة qRT-PCR. تم استخراج الحمض النووي الريبي من البقع المخترقة الموضحة في (أ) بدقة 4 نقطة في البوصة. تم تطبيع كل قيمة مقابل NbActin النصوص في نفس العينة. تمثل أشرطة الخطأ SD (ن = 3 تكرارات بيولوجية مستقلة). * ، ص & lt 0.05 ** ، ص & lt 0.01 (طالب ر اختبار). (ج) مضان GFP في الأوراق النظامية للنباتات المعالجة مسبقًا بـ TRV-GUS أو TRV-NbDCP1 أو TRV-NbDCP2 أو TRV-NbXRN4 أو TRV-NbPARN ثم تم تصويره بواسطة TuMV-GFP تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 6 نقطة في البوصة. (د) تحدد مستويات TuMV RNA النسبية بواسطة qRT-PCR. تم استخراج الحمض النووي الريبي من النباتات في (C) عند 14 نقطة في البوصة. * ، ص & lt 0.05 ** ، ص & lt 0.01 (طالب ر اختبار). (ه) تراكم بروتين GFP و TuMV siRNAs في الأوراق النظامية للنباتات في (C) بدقة 14 نقطة في البوصة. يعمل تلطيخ CBB للوحدة الفرعية الكبيرة من Rubisco و U6 كعنصر تحكم في التحميل لطخة مناعية ، وصمة عار مرنا ، وصمة عار ، على التوالي. تم قياس قيم GFP siRNAs / U6 بواسطة برنامج ImageJ ثم تم تطبيعها مقابل القيمة المتوسطة المقابلة لمعاملة TRV-GUS ، والتي تم ضبطها على 1.00.

لمزيد من الفحص لمعرفة ما إذا كانت هذه 5’RDGs تسبب أيضًا في عدوى TuMV في نبات الأرابيدوبسيس ، حصلنا على طفرات ضربة قاضية من Arabidopsis DCP2 و PARN، والضربة القاضية المسوخ DCP1 و XRN4 (S7 التين). بالمقارنة مع نباتات Wt Arabidopsis ، أظهرت جميع المسوخات حساسية معززة لعدوى TuMV من خلال تراكم مستويات أعلى من RNA الفيروسي (S8 تين). من الواضح أن 5’RDGs تلعب دورًا مضادًا لـ TuMV في كليهما ن. بنتاميانا وأنواع نبات الأرابيدوبسيس.

يتفاعل VPg مع DCP2 ويستهدفه في النواة لمنع تكوين حبيبات DCP1 / DCP2 السيتوبلازمية

لفحص التفاعلات البروتينية المحتملة بين البروتينات الأربعة 5’RDGs و 11 من البروتينات TuMV ، أجرينا اختبارات الخميرة ثنائية الهجين (Y2H). تم دمج جميع البروتينات المختبرة مع مجال تنشيط النسخ GAL4 (AD) ومجال ربط الحمض النووي لـ GAL4 (BD). كما تم تلخيصه في الشكل 9 أ و 9 ب، بغض النظر عما إذا تم استخدام اندماج AD أو BD للمقايسة ، تم العثور على تفاعلات إيجابية فقط بين NbDCP2 و VPg ، وبين NbXRN4 و HC-Pro.

(أ ، ب) ملخص نتائج اختبار Y2H. تم طلاء سلالات خميرة الذهب Y2H التي تم تحويلها بالاشتراك مع البلازميدات المشار إليها على وسط دكستروز صناعي (SD) / - Trp ، -Leu ، -His ، -Ade لتحديد تفاعلات البروتين في 3 أيام بعد التحول. تم دمج البروتينات إما في مجال ربط الحمض النووي Gal4 (BD) أو التنشيط (AD). لا يعني عدم وجود تفاعل إيجابي بين بروتينين تم اختبارهما ، نعم تعني تفاعلًا إيجابيًا بين بروتينين تم اختبارهما ، وتعني "-" أن NbDCP1 له نشاط تنشيط ذاتي عند دمجه مع ناقل BD ، مما يشير إلى تفاعل غير حقيقي. (ج ، د) مقايسات Y2H لـ NbDCP2 و VPg (C) و NbXRN4 و HC-Pro (D). تعرضت سلالات خميرة الذهب Y2H التي تم تحويلها بالاشتراك مع البلازميدات المشار إليها إلى تخفيفات متسلسلة بمقدار 10 أضعاف وطليها على وسط SD / -Trp ، -Leu ، -His ، -Ade لتحديد تفاعلات البروتين في 3 أيام بعد التحول. الخلايا التي تم تحويلها بالاشتراك مع AD-T7-T + BD-T7-53 تعمل كخلايا تحكم إيجابية تم تحويلها بالاشتراك مع AD-NbDCP2 أو AD-NbXRN4 و BD الفارغ ، أو AD الفارغة و BD-NbDCP2 أو BD -NbXRN4 الضوابط السلبية.

تم تأكيد التفاعل بين NbDCP2 و VPg بواسطة BiFC في المعدلة وراثيا ن. بنتاميانا التعبير عن H2B-RFP كعلامة نووية (الشكل 10 أ). تم اكتشاف تفاعل NbDCP2 و VPg في النواة (الشكل 10 أ و S10 التين). باستمرار ، تفاعل NbDCP2 مع NbDCP1 (بمثابة عنصر تحكم إيجابي) وشكل حبيبات لامعة في السيتوبلازم ، ولم يتم العثور على تفاعل بين NbDCP1 و VPg (الشكل 10 أ). حقيقة أن NbDCP2 يتفاعل مع VPg في النواة ، ومع NbDCP1 في السيتوبلازم لتشكيل مجمع فك القطع المطلوب لتحلل الحمض النووي الريبي 5'-3 '[11،33] دفعنا إلى التحقق مما إذا كان TuMV VPg ينظم بشكل سلبي تجميع مجمع فك NbDCP1 / NbDCP2. لاختبار هذه الفرضية ، تم اختراق YN-NbDCP1 و YC-NbDCP2 أو YN-NbDCP2 و YC-NbDCP1 معًا باستخدام VPg في أوراق H2B-RFP. لم يتم الكشف عن أي إشارات تفاعل بين NbDCP1 و NbDCP2 عندما تم التعبير عن VPg بشكل مشترك (الشكل 10 أ) ، مما يشير إلى أن VPg يعطل بالفعل تفاعل NbDCP1 و NbDCP2.

(أ) فحوصات BiFC لتفاعلات البروتين البروتين المحتملة في بلانتا. تم دمج NbDCP1 و NbDCP2 و VPg مع YN أو YC. تم التعبير عن البروتينات المندمجة بشكل عابر في H2B-RFP المعدلة وراثيًا ن. بنتاميانا أوراق. تم إجراء الفحص المجهري متحد البؤر عند 32 نقطة في البوصة. لوحظ مضان أصفر (أخضر) في الخلايا الورقية التي تعبر عن NbDCP1 + NbDCP2 أو NbDCP2 + VPg ، ولكن ليس في الخلايا التي تعبر عن NbDCP1 + VPg أو NbDCP1 + NbDCP2 في وجود VPg. يشار إلى نوى خلايا البشرة بأوراق التبغ بالتعبير عن التحوير H2B-RFP (أحمر). القضبان = 25 ميكرومتر. (ب) الترجمة المشتركة لـ VPg + NbDCP1 و VPg + NbDCP2 و NbDCP1 + NbDCP2 في وجود متجه فارغ (+ Vec) أو VPg (+ VPg) في النوع البري ن. بنتاميانا الخلايا الورقية. تم إجراء الفحص المجهري متحد البؤر عند 32 نقطة في البوصة. القضبان = 25 ميكرومتر. (ج) متوسط ​​عدد حبيبات التوطين المشترك NbDCP1 / NbDCP2 (لكل 10 خلايا) عندما تم اختراقها معًا باستخدام Vec (+ Vec) أو VPg (+ VPg). تم تكرار تجارب التسلل المستقلة ثلاث مرات واستخدمت 30 خلية في المجموع للقياس الكمي. تمثل القيم متوسط ​​عدد حبيبات NbDCP1 / NbDCP2 (لكل 10 خلايا) ± SD. تلاميذ ر تم إجراء الاختبار لمقارنة الفروق ، وتشير العلامات النجمية المزدوجة إلى وجود فرق مهم للغاية (ص & لتر 0.01). (د) تحليلات التجلط المناعي لـ NbDCP2-CFP بدقة 2 نقطة في البوصة. تم فحص البروتينات الكلية أو البروتينات المعزولة من السيتوبلازم أو النوى بأجسام مضادة لـ GFP ، كما تم تحضين البروتينات الكلية بأجسام مضادة Myc للكشف عن Myc-VPg. تمت مراقبة التحميل المتساوي لعينات البروتين الكلي والنووي عن طريق التحقيق باستخدام الأجسام المضادة هيستون H2B وتلطيخ مصرف البحرين المركزي ، على التوالي.

لاحظنا كذلك التوطين المشترك دون الخلوي لـ VPg و NbDCP1 و NbDCP2. ن. بنتاميانا تم اختراق الأوراق بشكل عابر إلى VPg-YFP و NbDCP1-CFP أو NbDCP2-CFP. لم يلاحظ أي توطين مشترك لـ VPg-YFP و NbDCP1-CFP ، في حين أن VPg-YFP مترجمة مع NbDCP2-CFP في النواة (الشكل 10 ب ، صفين علويين). علاوة على ذلك ، فإن التعبير المشترك عن VPg قمع بشكل ملحوظ تشكيل حبيبات NbDCP1 / NbDCP2 في السيتوبلازم ، مقارنةً بالتحكم في النواقل (الشكل 10 ب، صفان سفليان ، و 10 ج). في البداية ، توقعنا أن انخفاض تفاعل NbDCP1 / NbDCP2 كان بسبب انخفاض مستوى بروتين NbDCP2 الناجم عن VPg. لاختبار هذا الاحتمال ، تم استخلاص البروتينات الكلية من الأوراق التي تم تسللها بالاشتراك مع NbDCP2-CFP وناقل فارغ (Vec) أو Myc-VPg ، وتم إجراء تحليل لطخة غربية لتحديد تراكم NbDCP2-CFP. من الواضح أن التعبير المشترك عن Myc-VPg لم يؤثر على مستوى البروتين NbDCP2-CFP (الشكل 10 د). بعد ذلك ، نظرنا في احتمال أن يؤدي تفاعل VPg-NbDCP2 إلى تنظيم توزيع NbDCP2 في السيتوبلازم بشكل سلبي لمنع تكوين حبيبات حشوية NbDCP1 / NbDCP2. لاختبار هذا الافتراض ، استخرجنا البروتينات السيتوبلازمية والنووية بشكل منفصل ، وأجرينا تحليل لطخة غربية لتحديد تراكم NbDCP2-CFP في السيتوبلازم والنووي. في الواقع ، عندما تم التعبير عن Myc-VPg بشكل مشترك ، من الواضح أن كمية NbDCP2-CFP انخفضت في السيتوبلازم ولكنها زادت بشكل ملحوظ في النواة (الشكل 10 د). تشير هذه البيانات إلى أن TuMV VPg يتداخل مع التفاعل بين NbDCP1 و NbDCP2 من خلال استهداف NbDCP2 من السيتوبلازم إلى النواة.

يتفاعل HC-Pro مع XRN4 ويكبح نشاط XRN4

تم التحقق من التفاعل بين HC-Pro و NbXRN4 بواسطة فحوصات BiFC في ن. بنتاميانا. تم إنشاء ناقلات التعبير YN-HC-Pro و YC-HC-Pro و YN-NbXRN4 و YC-NbXRN4 للتعبير عن اندماج HC-Pro أو NbXRN4 مع YN أو YC ، على التوالي. أدى التعبير الزوجي عن YN-HC-Pro و YC-NbXRN4 أو YN-NbXRN4 و YC-HC-Pro عن طريق الترشيح الزراعي إلى إشارات مضان YFP قوية في السيتوبلازم عند 32 نقطة في البوصة (الشكل 11 أ). لم يكن هناك مضان YFP قابل للاكتشاف في عينة الورقة التي شاركت في التعبير عن HC-Pro و NbDCP1 ، والتي تعمل كعنصر تحكم سلبي (الشكل 11 أ). لقد فحصنا أيضًا التوطين الخلوي لـ HC-Pro و NbXRN4 في ن. بنتاميانا خلايا البشرة الورقية تشارك في التعبير عن HC-Pro الموسومة بـ CFP (HC-Pro-CFP) و NbXRN4 الموسومة YFP (YFP-NbXRN4). وجدنا أن HC-Pro-CFP مترجمة في السيتوبلازم والنواة ، وبعض الحبيبات المتكونة في السيتوبلازم (الشكل 11 ب ، اللوحة الأولى). تمت ترجمة HC-Pro-CFP بالاشتراك مع NbXRN4-CFP لتشكيل نقطة مضيئة في السيتوبلازم (الشكل 11 ب ، اللوحة الثالثة). تؤكد هذه النتائج أن TuMV HC-Pro يتفاعل مع NbXRN4.

(أ) اختبارات BiFC لتأكيد تفاعل HC-Pro و NbXRN4 في H2B-RFP ن. بنتاميانا يترك عند 32 نقطة في البوصة. تم دمج HC-Pro و NbXRN4 مع YN و YC. لوحظ مضان أصفر (أخضر) في الخلايا التي تشارك في التعبير عن YN-HC-Pro + YC-NbXRN4 أو YC-HC-Pro + YN-NbXRN4. لم ينتج عن التعبير المشترك عن YN-HC-Pro + YC-NbDCP1 أو YC-HC-Pro + YN-NbDCP1 أي مضان يمكن اكتشافه في H2B-RFP ن. بنتاميانا يترك عند 32 نقطة في البوصة ، مما كشف أن HC-Pro لم يتفاعل مع NbDCP1. القضبان = 25 ميكرومتر. (ب) تحليل التوطين المشترك لـ HC-Pro-CFP و YFP-NbXRN4 في ن. بنتاميانا يترك عند 32 نقطة في البوصة. تم التعبير عن اللوحة الأولى: HC-Pro-CFP بمفردها ، وتم التعبير عن اللوحة الثانية: YFP-NbXRN4 وحدها ، وتم التعبير عن اللوحة الثالثة: HC-Pro-CFP و YFP-NbXRN4 معًا. القضبان = 25 ميكرومتر. (ج) مقايسات Y2H لـ AtXRN4 و HC-Pro. تعرضت سلالات خميرة الذهب Y2H التي تم تحويلها بالاشتراك مع البلازميدات المشار إليها إلى تخفيفات متسلسلة بمقدار 10 أضعاف وطليها على وسط SD / -Trp ، -Leu ، -His ، -Ade لتحديد تفاعلات البروتين في 3 أيام بعد التحول. تعمل الخلايا التي تم تحويلها بالاشتراك مع AD-T7-T + BD-T7-53 كخلايا تحكم إيجابية تم تحويلها بالاشتراك مع AD-HC-Pro و BD الفارغ ، أو أن AD و BD-AtXRN4 الفارغان هما عناصر تحكم سلبية. (د) كشفت فحوصات BiFC أن HC-Pro تفاعل مع AtXRN4 في H2B-RFP ن. بنتاميانا يترك عند 32 نقطة في البوصة. خدم P3N-PIPO و AtXRN4 كعنصر تحكم سلبي لمقايسة تفاعل البروتين البروتين. الحانات = 25 ميكرومتر. (هـ) الأنماط الظاهرية لـ Col-0 ، xrn4 نباتات نبات الأرابيدوبسيس المتحولة والمعدلة وراثيًا التي تم تحويلها باستخدام 35S: Myc-AtXRN4 ، 35S: HC-Pro-CFP-1 ، 35S: HC-Pro-CFP-2 و 35S: HC-Pro-CFP-1 / 35S: Myc-AtXRN4 في 20 يوما بعد البذر. 35S: HC-Pro-CFP-1 / 35S: تم الحصول على نباتات Myc-AtXRN4 عن طريق التهجينات الجينية بين 35S: HC-Pro-CFP-1 و 35S: نباتات Myc-AtXRN4 Arabidopsis. تم استخدام محطات توليد T2 في التجارب المذكورة أعلاه. تأكيد xrn4 نباتات متحولة وراثياً تعبر عن 35S: Myc-AtXRN4 ، 35S: HC-Pro-CFP-1 ، 35S: HC-Pro-CFP-2 و 35S: HC-Pro-CFP-1 / 35S: تم عرض Myc-AtXRN4 في S7 التين و S10 التين. (F ، G ، H) تحليل qRT-PCR لـ AtEBF1, AtRAP2.4, AtNMT التعبير في العمود 0 ، xrn4 نباتات متحولة ومعدلة وراثيًا تحمل 35S: Myc-AtXRN4 ، 35S: HC-Pro-CFP-1 و 35S: HC-Pro-CFP-1 / 35S: Myc-AtXRN4 في 20 يومًا بعد البذر (F) ، في Col-0 و xrn4 تم اختراق أوراق متحولة بواسطة ناقل فارغ (Vec) و HC-Pro بدقة 3 نقطة في البوصة (G) ، وفي Col-0 ظهرت أوراق نباتات مصابة بالعدوى الوهمية أو TuMV بدقة 12 نقطة في البوصة (H). أتاكتيني تم استخدام الجين كعنصر تحكم داخلي. تم تحليل البيانات باستخدام Student ر يشير الاختبار والعلامات النجمية إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين العلاجات (* ص & lt0.05 ** ص & lt0.01).

لتقييم الأهمية البيولوجية لتفاعل HC-Pro و XRN4 ، استخدمنا النبات النموذجي أرابيدوبسيس. في البداية ، أكدنا أن TuMV HC-Pro يتفاعل بالفعل مع AtXRN4 ، أخصائي تقويم NbXRN4 في Arabidopsis من خلال إجراء فحوصات Y2H في الخميرة (الشكل 11 ج) ومقايسات BiFC بتنسيق ن. بنتاميانا (الشكل 11 د). ثم حصلنا على أرابيدوبسيس xrn4 نباتات نبات الأرابيدوبسيس المتحولة والمعدلة وراثيًا التي تعبر عن HC-Pro و AtXRN4. ومن المثير للاهتمام أن النمط الظاهري لـ xrn4 متحولة تحاكي النمط الظاهري المعتدل لنباتات نبات الأرابيدوبسيس المعدلة وراثيًا HC-Pro (الشكل 11E) ، والتي تعرض حواف أوراق مسننة. نظرًا لأن الجسم P هو موقع تحلل الحمض النووي الريبي ، ويتفاعل HC-Pro مع XRN4 في الحبيبات السيتوبلازمية التي تشبه الجسم P (الشكل 11 أ و 11 د) ، توقعنا أن التعبير عن HC-Pro قد يثبط وظيفة AtXRN4 في تحلل الحمض النووي الريبي. لاختبار هذه الفكرة ، تتضمن ثلاث ركائز محتملة لـ AtXRN4 في تحلل الحمض النووي الريبي AtEBF1, AtRAP2.4 و AtNMT [37] تم تحليلها. وجدنا أن مستويات الرنا المرسال لهذه الجينات الثلاثة زادت بالفعل بشكل ملحوظ في xrn4 نباتات نبات الأرابيدوبسيس الطافرة وانخفضت في النباتات المعدلة وراثيًا XRN4 (الشكل 11F). أدى الإفراط في التعبير عن HC-Pro إلى تعزيز تراكم الرنا المرسال بشكل كبير AtEBF1, AtRAP2.4 و AtNMT، والذي تم استعدائه من خلال الإفراط في التعبير عن AtXRN4 (الشكل 11F).على الدوام ، عالج الإفراط في التعبير المشترك لـ AtXRN4 جزئيًا النمط الظاهري النموذجي الناجم عن الإفراط في التعبير عن HC-Pro (الشكل 11E) ومستويات التعبير AtEBF1, AtRAP2.4 و AtNMT كانت متشابهة في HC-Pro-Expressing Wt (Col-0) و xrn4 نباتات متحولة (الشكل 11G). علاوة على ذلك ، في النباتات المصابة بـ TuMV ، ارتفع مستوى ركائز XRN4 هذه (الشكل 11 ح) ، ربما بسبب HC-Pro. مجتمعة ، تشير هذه البيانات إلى أن HC-Pro يتفاعل مع XRN4 وأن التفاعل يمنع نشاط XRN4.


الملخص

إن uridylylation من VPg الببتيد التمهيدي هو المرحلة الأولى في تكرار picornavirus RNA. يمكن تحقيق هذه العملية في المختبر باستخدام مكونات نقية ، بما في ذلك 3B (VPg) مع بوليميريز RNA المعتمد على الحمض النووي الريبي (ثلاثي الأبعاد) بول ) ، والسلائف 3CD ، وقالب RNA الذي يحتوي على كري/أوتوبيس. نظهر أن بعض تسلسلات الحمض النووي الريبي داخل فيروس مرض الحمى القلاعية (FMDV) 5 & # x02032 منطقة غير مترجمة ولكن خارج المنطقة cre / الحافلة يمكن أن يعزز نشاط VPg uridylylation. علاوة على ذلك ، أظهرنا أن بروتين FMDV 3C وحده يمكن أن يحل محل 3CD ، وإن كان بكفاءة أقل. بالإضافة إلى ذلك ، سلائف VPg ، 3B33 ج و 3 ب1233C ، يمكن أن تعمل كركائز ل uridylylation في حالة عدم إضافة 3C أو 3CD. المخلفات داخل بروتين FMDV 3C المشاركة في التفاعل مع cre / الحافلة تم تحديد الحمض النووي الريبي (RNA) وتوجد على وجه البروتين المقابل لموقع التحفيز. هذه البقايا داخل 3C ضرورية أيضًا لنشاط VPg uridylylation وتكرار الفيروس الفعال.

العائلة Picornaviridae يشمل مسببات الأمراض المهمة للإنسان والثدييات الأخرى ، على سبيل المثال ، فيروس شلل الأطفال (PV) ، فيروس الأنف البشري (HRV) ، فيروس مرض الحمى القلاعية (FMDV). جينومات Picornavirus هي جزيئات RNA موجبة الاتجاه تبلغ حوالي 8 كيلو بايت والتي تعمل على حد سواء كـ mRNAs (لإنتاج البروتينات المشفرة بالفيروس) وكقوالب لإنتاج نسخ RNA جديدة (4 ، 32). الحمض النووي الريبي الجينومي غير مغطى (راجع mRNAs الخلوية حقيقية النواة) ولكنه مرتبط عند نهايته 5 & # x02032 بالببتيد المشفر بالفيروس VPg (أو 3B). تحتوي جميع جينومات picornavirus على تسلسل طرفي 5 & # x02032 من VPgpUpU & # x02026 ، وهذا مشتق من استخدام VPg كببتيد تمهيدي لتخليق الحمض النووي الريبي. يحدث ربط هذا الببتيد بالحمض النووي الريبي عبر بقايا Tyr (Y) ويتم إجراؤه بواسطة بوليميريز الحمض النووي الريبي الفيروسي (ثلاثي الأبعاد) بول ). بالنسبة إلى PV و HRV و FMDV ، فقد ثبت أنه يمكن تحقيق uridylylation لـ VPg في المختبر باستخدام VPg المنقى (كببتيد صناعي) مع 3D بول ، والسلائف 3CD ، و UTP ، وقالب RNA الذي يشتمل على بنية حلقة جذعية يُطلق عليها في كثير من الأحيان رابطة الدول المستقلة- فعل عنصر النسخ المتماثل (كري) (15 ، 29 ، 33). ينتج هذا التفاعل VPgpU و VPgpUpU [معًا يُطلق عليهم اسم VPgpU (pU)]. كان من المتوقع أن تعمل مثل هذه البادئات لتشكيل الحمض النووي الريبي الموجب والسالب على حد سواء (32). بشكل غير متوقع ، داخل نظام النسخ المتماثل في المختبر ، تظهر التجارب أن الكهروضوئية كري ليس مطلوبًا لتوليف الحمض النووي الريبي ذي المعنى السلبي (19 ، 26 ، 28). ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ مؤخرًا عن حدوث طفرات معينة في فيروس كوكساكي B3 كري أثرت على كل من تخليق الحمض النووي الريبي الإيجابي والسلبي (43). وهكذا ، فإن الآلية التي ينطوي عليها بدء تخليق الحمض النووي الريبي ذي المعنى السلبي لم تحل بعد.

بشكل فريد ، يقوم FMDV بتشفير واستخدام ثلاثة ببتيدات مميزة VPg ، والتي يبلغ طولها 23 أو 24 حمضًا أمينيًا (21). يمكن تحويل كل من FMDV VPgs إلى uridylylated في المختبر ، على الرغم من أن VPg3 (3B3) يبدو أنه الركيزة الأكثر كفاءة (29). من المثير للاهتمام أن تعديل تسلسل ترميز VPg3 فقط في سياق طول كامل (FL) cDNA المعدية أدى إلى إنتاج نسخة غير معدية من الحمض النووي الريبي (13).

الأول كري تم تحديده في picornavirus RNA ضمن تسلسل ترميز البروتين 1D (VP1) من نوع HRV 14 (HRV-14). لقد ثبت أن هذا العنصر مطلوب في شكل RNA لتكرار الحمض النووي الريبي الفيروسي (24 ، 25). بعد ذلك ، تم تحديد عناصر مماثلة في جينومات أخرى لفيروس بيكورنا (15 ، 17 ، 22). كل من هذه كري تشتمل الهياكل (حوالي 50 إلى 60 نيوكليوتيد [nt] في الطول) على نموذج تسلسل محفوظ ، AAACA ، يقع داخل حلقة في نهاية جذع مستقر. تحدث هذه العناصر في مواقع مختلفة داخل جينومات مختلفة لفيروس بيكورنا كري توجد هياكل من HRV-14 و HRV-2 و Cardiovirus و PV ضمن مناطق الترميز لـ 1D و 2 A و 1 B و 2 C ، على التوالي (15 ، 22 ، 25 ، 33). بشكل فريد ، FMDV كري يقع داخل المنطقة غير المترجمة 5 & # x02032 (5 & # x02032 UTR) من RNA (23) ، فقط منبع موقع دخول الريبوسوم الداخلي (IRES). ال كري يمكن نقل الهياكل بدون وظيفة السد (18 ، 23).

الشكل A 1 A 2 A 3 CA داخل كري يعمل كقالب ل uridylylation لـ VPg ، وضمن هذا الشكل ، يكون النيوكليوتيد A 1 ضروريًا للغاية للتفاعل ، في حين أن تعديل A 2 أو A 3 يمنعه بشدة (35). لقد ثبت أن آلية & # x0201cslideback & # x0201d متورطة في uridylylation لـ PV VPg وأن النيوكليوتيد A 1 يعمل كقالب لإضافة مجموعتي uridyl إلى الببتيد. تتوافق البيانات الخاصة بمتطلبات هذا النموذج داخل عنصر FMDV مع نفس الآلية (29). في الآونة الأخيرة ، هيكل كري من HRV تم تحديده باستخدام الرنين المغناطيسي النووي (40) ، ولكن من المدهش أن عزر AAACA لم يكن مكشوفًا للغاية. أشارت الدراسات الجينية إلى أن مرض الحمى القلاعية (FMDV) كري يمكن أن تعمل فيه عبر (41) ، وبالتالي ، فقد تم اقتراح أن هذا العنصر يجب أن يسمى موقع 3B-uridylylation (أوتوبيس). PV كري يمكن أن تعمل أيضًا في عبر في فحوصات المختبر (19) ، وأظهرت البيانات الحديثة من Crowder و Kirkegaard (11) أن الطفرات داخل PV كري يمكن أن تمنع تكرار PV في عبر- الأسلوب المهيمن داخل الخلايا.

طبيعة الدور الأساسي لـ 3CD في تفاعل uridylylation ليست واضحة تمامًا. من المعروف أن PV 3CD يمكن أن ترتبط بـ RNA وهي قادرة على التفاعل مع 5 & # x02032-محطة البرسيم هيكل على PV RNA (1) وكذلك على وجه التحديد مع PV كري (48). تم تحديد بقايا محددة ، ضمن تسلسل KFRDI المحفوظ (Lys-Phe-Arg-Asp-Ile) اللازمة للتفاعل بين بروتينات picornavirus 3C مع الحمض النووي الريبي (1 ، 5 ، 27 ، 44). لقد ثبت أيضًا أن دور PV 3CD في تفاعل uridylylation يمكن تحقيقه بواسطة 3C وحدها ، على الرغم من أن التفاعل أقل كفاءة (31). تم تحديد هياكل العديد من بروتينات picornavirus 3C بواسطة علم البلورات بالأشعة السينية ، بما في ذلك تلك المشفرة بواسطة FMDV (5 ، 7 ، 27) ، ولكن حاليًا ، لم يتم الإبلاغ عن أي بنية لبروتين 3CD. تم تعيين مناطق ربط الحمض النووي الريبي للبروتياز PV و التهاب الكبد A (HAV) 3C على تسلسلات على وجه الجزيء المقابل للموقع النشط الحفزي (5 ، 27 ، 33 ، 47). أدى تعديل كل من R84 و I86 داخل عزر K 82 FRDI 86 للبروتياز PV 3C إلى منع قدرة البروتين على ربط & # x0201ccloverleaf & # x0201d RNA ودعم PV VPg uridylylation (1 ، 33). لقد اكتشفنا الآن أدوار التسلسلات داخل بروتين FMDV 3C المطلوبة لعملية التحلل البولي لـ FMDV VPg في المختبر. لقد حددنا الأحماض الأمينية الفردية الموجودة على سطح بروتين FMDV 3C والتي تعتبر بالغة الأهمية في عملية التحلل البولي والتي تعدل أيضًا تفاعل البروتين مع البروتين. cre / الحافلة. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بالتحقيق في طبيعة قالب RNA المتضمن في تفاعل uridylylation وأظهرنا أن وجود FMDV IRES داخل نسخة RNA يعزز نشاط القالب المجاور cre / الحافلة بنية.


الخصائص الأنزيمية لـ Calicivirus RdRps

دقة البوليميراز وسرعة النسخ المتماثل ومعدلات التطور

من المعروف أن Calicivirus RdRps ، وكذلك RdRps لفيروسات RNA الأخرى من الإنزيمات المعرضة للخطأ ، لأنها تفتقر إلى أنشطة التدقيق اللغوي للعديد من بوليميرات الحمض النووي. يحدث خطأ واحد تقريبًا في كل دورة تكرار لفيروسات الحمض النووي الريبي مقارنة بخطأ واحد لكل 300 دورة لفيروسات الحمض النووي (دريك ، 1991 ، 1993). تعد مقارنة الدراسات بوحدات الإبلاغ عن الأخطاء المختلفة أمرًا صعبًا إلى حد ما ، ولكن تظهر اتجاهات معينة. متوسط ​​معدل الخطأ لـ HCV (الأسرة فلافيفيريدي) هو 3.8 & # x00D7 10 -5 ، تم قياسه كبدائل لكل نوكليوتيد لكل دورة من العدوى (s / n / c) (Sanju & # x00E1n and Domingo-Calap ، 2016 Selisko et al. ، 2018) ، وتكرار الخطأ في يتراوح فيروس شلل الأطفال RdRp من 7 & # x00D7 10-4 إلى 5.4 & # x00D7 10 -3 ، على النحو الذي تحدده نسبة دمج النيوكليوتيدات غير التكميلية إلى إجمالي عدد النيوكليوتيدات (وارد وآخرون ، 1988). تم تحديد معدلات خطأ مماثلة لـ RdRp للعديد من فيروسات العائلة Caliciviridae، على سبيل المثال ، 6.8 & # x00D7 10-4 لـ MNV ، 1.6 & # x00D7 10-4 لـ sapovirus GI ، و 9.0 & # x00D7 10-4 استبدال النوكليوتيدات / موقع نوروفيروس GII.4 (Bull et al. ، 2010b).

تعتبر خصائص بوليميراز RNA المعتمدة على الحمض النووي الريبي ، مثل الدقة ومعدل النسخ المتماثل ، من العوامل المهمة التي تشكل تطور الفيروس. على سبيل المثال ، كان لـ RdRps من سلالات نوروفيروس GII.4 معدلات طفرة أعلى (تم تحديدها باستخدام في المختبر فحوصات الإخلاص) مقارنةً بتلك الخاصة بسلالات GII.b و GII.7 ذات الصلة ولكن الأقل اكتشافًا (5.5 & # x20139.1 & # x00D7 10-4 بدائل لكل موقع لـ GII.4 RdRps مقابل 1.5 & # x00D7 10 -4 و 2.2 & # x00D7 10 -5 بدائل لكل موقع لـ GII.b و GII.7 ، على التوالي). ومن المثير للاهتمام أن سلالة GII.4 أظهرت معدل تطور أعلى بنحو 1.7 ضعفًا لتسلسل القفيصة وتكرار أعلى للتغيرات غير المترادفة مقارنة بسلالات نوروفيروس غير الوبائية (Bull et al. ، 2010a). علاوة على ذلك ، Mahar et al. (2013) أن الحصول (عن طريق إعادة التركيب) على متغيرات GII.3 RdRp الجديدة مع معدلات طفرة أعلى قد يزيد التنوع الجيني ويحسن اللياقة العامة للمجموعات الفيروسية تحت ضغوط انتقائية. مجتمعة ، يبدو أن معدل الدقة المنخفض يرتبط بمعدل تطوري أعلى.

يعد معدل تكرار الفيروس محددًا آخر للياقة الفيروسية ، حيث يمكن للفيروسات ذات معدل التكرار المتزايد إنتاج نسخ أكثر من جينومها ، مما قد ينتج عنه المزيد من المتغيرات حتى لو ظل معدل خطأ RdRp كما هو. على سبيل المثال ، كان لـ RdRps من سلالات الوباء GII.4 لعام 2006 معدل دمج أعلى للنيوكليوتيدات (أي أنها تتكاثر بشكل أسرع) من المؤتلف GII.4 RdRps من الفاشيات السابقة وسلالة الوباء التي تشبه US95 / 96 GII.4 على الرغم من أن كانت معدلات الخطأ متشابهة جدًا. ارتبطت الزيادة الملحوظة في معدل الدمج بظهور طفرة خارج الموقع النشط ، أي استبدال Lys291 إلى Thr في مجال إصبع RdRp (Bull et al. ، 2010a). وبالتالي ، يبدو أن معدل الطفرة العالية و / أو معدل النسخ المتماثل داخل سلالة GII.4 يرتبط بتطور سلالات الجائحة. ومع ذلك ، لا ترتبط معدلات النسخ المرتفعة دائمًا بملاءمة عامة عالية للفيروس ، مما يشير إلى أن السرعة تحتاج إلى الموازنة مع معدلات الطفرات المناسبة. على سبيل المثال ، سلالة نوروفيروس GII.7 ، على الرغم من وجود معدل تكرار مرتفع ، لديها معدل طفرة منخفض وانتشار جغرافي محدود (Bull et al. ، 2010a). من المحتمل أن السرعة التي يتكرر بها هذا الفيروس بعينه لم تكن سريعة بما يكفي لموازنة قدرته المحدودة على إنتاج متغيرات جديدة من خلال دمج الطفرات.

أصبحت مساهمة RdRp في المعدل التطوري لفيروسات الكالس أكثر وضوحًا مع النجاح الأخير لفيروسات المؤتلف GII.2 و GII.4 التي اكتسبت متغيرًا جديدًا من البوليميراز. على سبيل المثال ، نوروفيروس المؤتلف الذي ظهر مجددًا GII.P16-GII.2 الذي يختلف عن سلالات GII.P16-GII.2 السابقة بواسطة 5 أحماض أمينية في RdRp (Ruis et al. ، 2017) ، ينتج عنه حمولات عالية من الفيروسات في البراز ، معدل تطوري مرتفع نسبيًا (5.5 & # x00D7 10 -3 بدائل / موقع / سنة) ، وقد انتشر بسرعة في جميع أنحاء العالم (Ao et al. ، 2018 Cheung et al. ، 2019). لقد تم اقتراح أن تغيرات الأحماض الأمينية في RdRp الجديد تؤثر على الخصائص الحركية ودقة الإنزيم ، لكن التفاصيل الميكانيكية الدقيقة تظل غير معروفة.

كما لوحظت أحداث إعادة التركيب الجيني بين فيروسات لاغوفيرس مختلفة. يبدو أن RHDV2 ، وهو في الأصل فيروس ذو فوعة معتدلة ونطاق جغرافي محدود (Le Gall-Recul & # x00E9 et al. ، 2013) ، قد تطور إلى فيروس أكثر ضراوة (Capucci et al. ، 2017) ، وهو تغيير يُعتقد أنه يكون جزئيًا على الأقل نتيجة إعادة التركيب مع فيروسات لاغوفيروس أخرى (لوبيز وآخرون ، 2015). تم العثور على بعض هذه الفيروسات المؤتلفة تمتلك بروتينات غير هيكلية لفيروسات الأرانب الحميدة كاليسيفيروس أستراليا -1 (RCV-A1) الشبيهة بالفيروسات (Lopes et al. ، 2015 Hall et al. ، 2018). RHDV و RCV-A1 لهما معدلات تطورية تبلغ 2.8 & # x00D7 10 -3 و 5.0 & # x00D7 10 -3 بدائل / موقع / سنة ، على التوالي (Eden et al.، 2015 Mahar et al.، 2016). يرتبط المعدل التطوري الأعلى لـ RCV-A1 بسرعة أعلى لـ RdRp ، كما هو محدد بواسطة في المختبر المقايسات (أوراكوفا وآخرون ، 2016). من المغري التكهن بأن RHDV2 قد يكون قد اكتسب بوليميراز سريعًا نسبيًا ، مما قد يفسر ضراوته المتزايدة ونجاحه التطوري الواضح. في غضون 18 شهرًا من وصوله ، حل RHDV2 إلى حد كبير محل سلالات RHDV المستوطنة في أستراليا (Mahar et al. ، 2017).

يوفر توليد مجموعة متنوعة للغاية من الجينومات وراثيًا ميزة تطورية ، لأن مجموعة متنوعة من الفيروسات يمكن أن تتكيف بسهولة أكبر مع الضغوط الانتقائية (Domingo، 2002 Lauring and Andino، 2010). إذا كان التنوع ناتجًا عن معدل خطأ أعلى ، فيمكن أن يؤدي ذلك أيضًا إلى زيادة احتمالية اكتساب طفرات ضارة ، وبالتالي فقد تم اقتراح أن معظم فيروسات الحمض النووي الريبي تتكاثر عند حافة عتبة الخطأ التي يتم تحديدها من خلال تفاعل معقد للعديد من المعلمات مثل حجم الجينوم ومعدلات الخطأ وسرعة النسخ المتماثل (دافي وآخرون ، 2008). على هذا النحو ، لا ينبغي أن يكون مفاجئًا أن الزيادات والنقصان في دقة RdRp يمكن أن تؤثر على اللياقة الفيروسية (Pfeiffer and Kirkegaard ، 2005 Xie et al. ، 2014 Arias et al. ، 2016 Agol and Gmyl ، 2018).

تأثيرات درجة الحرارة ودرجة الحموضة وظروف الملح على أداء RdRp

تم تحديد شروط الأداء الأمثل لـ calicivirus RdRps للفيروسات من الأجناس نوروفيروس, سابوفيروس، و لاغوفيروس (الجدول 3). يعتمد نشاط RdRps الفيروسي على درجة الحرارة ، على الرغم من أن درجة الحرارة المثلى ليست بالضرورة درجة حرارة الجسم المضيف & # x2019s. في الدراسات المبكرة ، تم اكتشاف أعلى نشاط لـ sapovirus RdRp عند 37 & # x00B0C (Fullerton et al. ، 2007). ومع ذلك ، تشير الدراسات الأكثر حداثة إلى أن العديد من الفيروسات التي تحتوي على RdRps تعمل في بيئة لا تسمح بأقصى أداء. على سبيل المثال ، أظهر RdRp البشري نوروفيروس نشاطًا أعلى عند 30 مقارنة بـ 37 & # x00B0C وفقًا لـ في المختبر المقايسات (روحيم وآخرون ، 2006 أ). علاوة على ذلك ، عندما تمت دراسة نطاق درجة حرارة أوسع (على سبيل المثال ، 5 ، 25 ، 37 ، 55 ، 65 ، 75 & # x00B0C) مع نوروفيروس بشري و sapovirus RdRps ، كان النشاط أعلى عند 25 & # x00B0C ، وحوالي 50٪ فقط من تم عرض النشاط الأنزيمي الأمثل عند 37 & # x00B0C (Bull et al. ، 2010b). علاوة على ذلك ، عرض norovirus و sapovirus RdRps حوالي 20٪ فقط من نشاطهم الأمثل عند 5 & # x00B0C وحوالي 1٪ فقط عند 55 & # x00B0C. لم يتم الكشف عن أي نشاط عند 65 أو 75 & # x00B0C لأي من RdRps باستثناء sapovirus RdRp ، الذي لا يزال يعرض 13 ٪ من النشاط الأمثل عند 65 & # x00B0C (Bull et al. ، 2010b). ومن المثير للاهتمام أن درجة الحرارة المثلى لبعض فيروسات اللاجوف إن لم يكن جميعها أعلى من درجة الحرارة في فيروسات النوروفيروس والفيروسات السابوفيروسية البشرية. باستخدام البروتينات المؤتلفة ، وجد أن RdRps الخاص بـ RCV غير الممرض و RHDV شديد الإمراض كان أداء أفضل بين 40 و 45 & # x00B0C (Urakova et al. ، 2016) ، وهي ميزة يمكن تفسيرها على أنها تكيف لفيروسات الأرانب. لمضيفيهم ، حيث تتراوح درجة حرارة أجسام الأرانب السليمة من 38.3 إلى 39.4 & # x00B0C. علاوة على ذلك ، فإن الحمى المرتبطة بمرض نزيف الأرانب غالبًا ما ترفع درجة حرارة الجسم إلى 42 & # x00B0C (Strive et al. ، 2010) ، لكن درجة الحرارة هذه ليست عالية بما يكفي لإبطاء نشاط RHDV RdRp (Urakova et al. ، 2016) ). إن السبب الذي يجعل فيروسات الكاليسيات الأخرى غير فيروسات اللاجوف تمتلك درجة حرارة مثالية تختلف عن درجة حرارة الجسم الأساسية للمضيف غير معروف حاليًا وهناك حاجة إلى مزيد من البحث للإجابة على هذا السؤال.

الجدول 3. الخصائص الأنزيمية لـ calicivirus RdRps.

تم العثور على الرقم الهيدروجيني الأمثل لفيروسات الأرانب calicivirus RdRps ليكون 8.5 ، وهو أعلى من ذلك الموجود في norovirus RdRps (7.0 & # x20138.0) (Bull et al.، 2010b Urakova et al.، 2016). للحصول على الوظيفة التحفيزية المثلى ، يمكن أن يستخدم norovirus و lagovirus RdRps إما Mn 2+ أو Mg 2+ ، ولكن ليس Fe 2+ (Vazquez et al. ، 1998 Rohayem et al. ، 2006a Urakova et al. ، 2016). أظهر Sapovirus RdRp نشاطًا أعلى مع Mn 2+ ، ولكنه كان نشطًا أيضًا عندما تمت إضافة Mg 2+ كعامل مساعد للتفاعل ، مما يشير إلى بعض المرونة في استخدام العوامل المساعدة (Fullerton et al. ، 2007).


نتائج

استراتيجية للتعبير عن الأشكال الأصلية للـ NV الجينومي والجينومي الفرعي RNA. نوعان من NV [كدنا] ، الجينوم ودون الجينومي (الشكل 1ب ) ، لأنه تم اكتشاف مثل هذه الحمض النووي الريبي الفيروسي في الخلايا المصابة بالفيروسات الحيوانية (5). استند إنشاء NV cDNA تحت الجينومي المستخدم في هذه التجربة على تسلسل النوكليوتيدات للحمض النووي الريبي تحت الجينوم الموجود في فيروسات الكاليس الحيوانية (5). تم وضع NV cDNAs الجينومية ودون الجينية التي تحتوي على مسارات متعددة (A) في اتجاه مجرى مروج T7 وفي اتجاه مجرى ريبوزيم فيروس دلتا التهاب الكبد (HδR) وإشارة إنهاء T7 RNA Pol (T7ϕ) للسماح بتوليد النصوص بدقة 5 ′ و 3 ′ نهايات جينوم NV (الشكل 1ب ). نظرًا لأن بدء نسخ تركيبات البلازميد تحت سيطرة مروج T7 يكون عند نيوكليوتيد G (19) والنيوكليوتيدات الأولية لـ NV RNA هي G ، يحدث نسخ NV cDNAs في أصل إدخال NV. يحدث الانقسام التحفيزي للنصوص الأولية بين المنطقة A النهائية من منطقة poly (A) وأول منطقة G من موقع HδR ، مما ينتج عنه الحمض النووي الريبي الفيروسي الذي ينتهي بذيل بولي (A).

التعبير عن الحمض النووي الريبي الجينومي في خلايا الثدييات. لتحديد ما إذا كان بناء cDNA الجيني لـ NV هو استنساخ معدي وظيفي ، تم التعبير عن NV الجينومي RNA في خلايا 293T باستخدام نظام MVA / T7. تم الكشف عن التعبير عن البروتينات الفيروسية غير الإنشائية Pro و RNA Pol المعتمدة على RNA عن طريق الترسيب المناعي الإشعاعي والتألق المناعي في الخلايا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي الجيني (الشكل 2).أ ).

التعبير عن الجينوم NV RNA وتكرارها في خلايا الثدييات. تم إصابة خلايا 293T بـ MVA / T7 ثم تم نقلها بالبلازميدات التي تشفر NV cDNAs. (أ) الكشف عن بروتينات NV غير البنيوية والهيكلية في الخلايا التي تعبر عن NV RNA بواسطة الترسيب المناعي الإشعاعي (اليسار) والتألق المناعي (حق) بمضاد للبروتينات. يتم تصنيع بروتينات NV التي تحمل علامات إشعاعية بواسطة في المختبر تمت معالجة الترجمة بالتوازي.علامات الحجم الجزيئي (كيلودالتون) على اليمين. تبرز الأسهم بروتينات NV. (ب) الكشف عن الحمض النووي الريبي تحت الجينومي المركب في الخلايا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي الجيني. Poly (A) + RNA ، معزول عند 4-12 ساعة ، وتم تعريضه للنشاف الشمالي. في المختبر تم تحليل نسخ من الحمض النووي الريبي تحت الجينوم بالتوازي. يشير السهم إلى الحمض النووي الريبي تحت الجينومي. علامات حجم الحمض النووي الريبي (النيوكليوتيدات) على اليسار.

لأن ORF1 من جينوم NV يشفر بولي بروتين غير إنشائي (الشكل 1 أ ) المشقوق في البروتينات غير التركيبية المقابلة بواسطة Pro (4 ، 20-25) ، الكشف عن الأحجام الصحيحة لـ Pro و RNA Pol ، الموجود في أقصى 3 نهاية ORF1 ، عن طريق الترسيب المناعي الإشعاعي يشير إلى أن البروتين غير الإنشائي قد تمت ترجمته من تم إنتاج الحمض النووي الريبي الجينومي المعبر عنه في خلايا 293T ، والبروتينات الفردية غير البنيوية لاحقًا عن طريق الانقسام باستخدام Pro النشط بيولوجيًا. تم اكتشاف كل من Pro و RNA Pol أيضًا عن طريق التألق المناعي في السيتوبلازم للخلايا المعبر عنها.

تم الكشف أيضًا عن التعبير عن بروتين القفيصة الفيروسي VP1 عن طريق الترسيب المناعي الإشعاعي والتألق المناعي (الشكل 2). أ ). في فيروسات calicivirus الحيوانية مثل فيروس calicivirus (FCV) وفيروس مرض نزيف الأرانب ، يعمل الحمض النووي الريبي دون الجيني المنسوخ من الحمض النووي الريبي الجيني كقالب لترجمة VP1 (5). في المختبر لم تنتج ترجمة الحمض النووي الريبي الجينومي أي VP1 (الشكل 6 ، الذي تم نشره كبيانات داعمة على موقع الويب PNAS) ، مما يشير إلى أن VP1 كما تم اكتشافه في الخلايا الجينية المعبر عن الحمض النووي الريبي لم يتم إنشاؤه بواسطة آلية ترجمة داخلية قائمة على البدء. وهكذا ، فإن اكتشاف VP1 في الخلايا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي الجيني اقترح أنه تمت ترجمته من الحمض النووي الريبي تحت الجينوم ، والذي تم نسخه من الحمض النووي الريبي الجيني المكرر بواسطة البروتينات غير التركيبية المعبر عنها. تم فحص التعبير عن بولي (A) + الحمض النووي الريبي دون الجينومي في الخلايا الجينية التي تعبر عن الحمض النووي الريبي في 4 و 6 و 8 و 10 و 12 ساعة بعد تعداء (pt) عن طريق تحليل اللطخة الشمالية باستخدام مسبار RNA موجب خاص بالشريط يتوافق مع منطقة VP1 من جينوم NV (الشكل 2ب ). تم اكتشاف الحمض النووي الريبي الجينومي (7.6 كيلو بايت) لأول مرة عند 4 ساعات نقطة (الخط 1) ، وانخفضت مستويات الحمض النووي الريبي الجينومي بمرور الوقت (الممرات من 2 إلى 5). تشغيل كعناصر تحكم ، الخلايا المنقولة (كدنا) تحت الجينومية (الممر 7) و في المختبر أسفرت نسخ cDNA دون الجينومية (الخط 8) عن نطاقي أحجام مختلفة قليلاً من 2.3 كيلو بايت و 2.5 كيلو بايت ، حيث يفتقر الحمض النووي الريبي الجيني الفرعي ويحتوي على HδR و T7ϕ ، على التوالي. في الخلايا المنقولة باستخدام cDNA الجيني ، تم اكتشاف التعبير عن الحمض النووي الريبي دون الجينومي المتوقع 2.3 كيلو بايت لأول مرة عند 6 ساعات pt (الخط 2). لم يتم اكتشاف الحمض النووي الريبي الجيني الفرعي عند 4 ساعات من النقاط على الرغم من التعبير عن الحمض النووي الريبي الجيني (الخط 1) وكان غائبًا في الخلايا المنقولة بالصورة (الخط 6). لم يكن الحمض النووي الريبي الجيني منتجًا للتحلل أو وسيطًا من الحمض النووي الريبي الجيني ، لأن مستوى التعبير عن الحمض النووي الريبي دون الجينومي انخفض بين 6 و 8 ساعات (الممرات 2 و 3) ، ثم ظل ثابتًا نسبيًا حتى 12 ساعة (الممرات 3-5) على الرغم من انخفاض مستويات الحمض النووي الريبي الجينومي الذي لوحظ بمرور الوقت (الممرات من 3 إلى 5). أشار رسم الخرائط 5 ′ للنهاية للحمض النووي الريبي الجينومي عن طريق التمديد التمهيدي إلى أن تسلسل الحمض النووي الريبي الجيني الذي تم اكتشافه في الخلايا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي الجينومي بدأ في موقع بدء النسخ المحفوظ من الحمض النووي الريبي لفيروس الكالسيوم الجيني الفرعي (5) (الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك ، تم استخراج الحمض النووي الريبي دون الجينومي المعبر عنه من الحمض النووي الريبي الجينومي من هلام الاغاروز ثم تعرض لتحليل 5′-RACE (الشكل 7 ، الذي تم نشره كمعلومات داعمة على موقع الويب PNAS). بدأ التسلسل 5′-end من الحمض النووي الريبي تحت الجينوم في موقع النسخ المحفوظ لـ RNA تحت الجينوم لفيروس calicivirus ، والذي يشبه النيوكليوتيدات الأربعة الأولى من الحمض النووي الريبي الجيني (GTAA) ، متبوعًا بأول AUG في الإطار من ORF2. درسنا أيضًا التعبير عن الحمض النووي الريبي دون الجينومي من الحمض النووي الريبي الجيني ، حيث تم تعطيل RNA Pol عن طريق حذف تسلسل الأحماض الأمينية GDD وهو الموقع النشط المحفوظ لـ RNA Pols. لم يتم الكشف عن تعبير الحمض النووي الريبي تحت الجينوم في الخلايا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي الجينومي باستخدام RNA Pol معطل (الشكل 8 ، والذي يتم نشره كمعلومات داعمة على موقع الويب PNAS). تشير هذه الملاحظات إلى أن الحمض النووي الريبي الجيني الذي تم اكتشافه قد تم إنشاؤه عن طريق النسخ من الحمض النووي الريبي الجيني ولم يكن بسبب النسخ المختلط T7 (الشكل 9 ، والذي يتم نشره كمعلومات داعمة على موقع الويب PNAS).

مجتمعة ، يشير اكتشاف بروتين كابسيد VP1 والحمض النووي الريبي دون الجينومي في الخلايا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي الجينومي إلى أن تكرار الحمض النووي الريبي المعبر عنه بواسطة نظام MVA / T7 حدث ، أي الحمض النووي الريبي الجيني الفرعي المتولد من الحمض النووي الريبي الجيني بواسطة البروتينات غير التركيبية المعبر عنها والوظيفية ، وكان ترجمت إلى VP1. وبالتالي ، تم إنشاء استنساخ NV (كدنا) وهو استنساخ معدي وظيفي بيولوجيًا ، وخلايا الثدييات قادرة على تكرار هذا الاستنساخ.

تغليف الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي في جزيئات الفيروس. يمكن إنتاج جزيئات فيروس NV الفارغة ، المتشابهة شكليًا ومستضديًا للفيريونات من النوع البري ، عندما يتم التعبير عن البروتينات الهيكلية الفيروسية VP1 و VP2 في خلايا الحشرات Sf-9 باستخدام فيروسات باكول المؤتلفة التي تحتوي على cDNA دون الجينوم (8). عبرنا عن الشكل الأصلي للـ RNA الفيروسي تحت الجينوم في خلايا الثدييات وفحصنا ما إذا كانت جزيئات الفيروس قد تولدت. تمت تنقية جزيئات الفيروس المشتقة من الخلايا الجينية التي تعبر عن الحمض النووي الريبي من المواد الطافية المزروعة بواسطة الطرد المركزي المتدرج CsCl المتدرج ، متبوعًا بالتجزئة ، وتم تكوير جزيئات الفيروس المفترضة من كل جزء لتحليلها. تم اكتشاف كل من VP1 و VP2 في نفس الجزء بواسطة النشاف الغربي (الشكل 3أ ، الكسور 4-6) تم الكشف عن ذروة cosedimentation VP1 و VP2 في الكسر 5. تم تأكيد وجود جزيئات الفيروس في الكسر 5 بواسطة المجهر الإلكتروني السلبي للبقعة (الشكل 3).ب ). توفر هذه النتائج دليلاً على أن التعبير عن الشكل الأصلي من الحمض النووي الريبي تحت الجينوم NV في خلايا الثدييات يولد جزيئات فيروسية تتكون من كل من VP1 و VP2.

توليد جزيئات الفيروس من الخلايا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي الجيني. تم عزل جزيئات الفيروس من المستنبتات الطافية بواسطة الطرد المركزي المتدرج CsCl المتساوي ، وتم ترسيب الجسيمات في تجزئة التدرج الفردي. (أ) تم فحص وجود جزيئات الفيروس في كل جزء من خلال النشاف الغربي بمصل مضاد للـ rNV الذي يتفاعل مع VP1 (18) (العلوي) والأجسام المضادة لـ VP2 (24) (أدنى). كعنصر تحكم إيجابي ، تم تحليل جزيئات الفيروس التي ينتجها نظام التعبير عن الفيروسات baculovirus (24) بالتوازي. تشير الأسهم إلى البروتينات الفيروسية المكتشفة. علامات الحجم (كيلودالتونس) على اليمين. (ب) صورة مجهرية إلكترونية لجزيئات الفيروس النقية الملطخة سلبًا من الكسر 5. (شريط المقياس: 100 نانومتر).

سعينا بعد ذلك لتحديد ما إذا كان الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي قد تم تعبئته في جزيئات الفيروس التي تنتجها خلايا الثدييات التي تعبر عن الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام نظام MVA / T7. لهذا الغرض ، تمت معالجة جزيئات الفيروس ، المعزولة من الكسور المتدرجة كما هو موصوف أعلاه ، باستخدام DNase I و RNase A لإزالة DNA البلازميد أو الحمض النووي الريبي الفيروسي الذي قد يكون مرتبطًا بشكل غير محدد بسطح الجسيم. تم بعد ذلك استخلاص الحمض النووي الريبي الفيروسي من جزيئات الفيروس وتحديد كميته بواسطة RT-PCR في الوقت الحقيقي. للكشف عن الحمض النووي الريبي الجينومي ، تم استخدام بادئات خاصة بمنطقة RNA Pol ، الموجودة في الحمض النووي الريبي الجينومي ولكنها غير موجودة في الحمض النووي الريبي الجيني الفرعي. عندما تم تجزئة جزيئات الفيروس من الخلايا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي الجيني وحده ، تم اكتشاف إشارة إيجابية ضعيفة تشير إلى دمج الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي في جزيئات الفيروس في الكسر 8 (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، لا يمكن الكشف عن وجود بروتين القفيصة VP1 في الكسر 8 بسبب حدود الكشف عن النشاف الغربي. كان مستوى التعبير عن VP1 في الخلايا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي الجينومي أقل بكثير من مستوى التعبير عن الخلايا الجينية التي تعبر عن الحمض النووي الريبي (الشكل 2). أ ). لذلك ، لزيادة التعبير عن البروتينات القفيصة VP1 و VP2 وزيادة احتمالية تغليف الجينوم الفيروسي ، تم عزل جزيئات الفيروس من الخلايا التي تضم الحمض النووي الريبي الجيني وشبه الجيني. تم اكتشاف إشارة إيجابية تشير إلى دمج الحمض النووي الريبي الجيني الفيروسي في جزيئات الفيروس مرة أخرى في الكسر 8 (الشكل 4أ ). تم الكشف عن هذه الإشارة الإيجابية في وجود النسخ العكسي ولكن ليس في غيابها ، مما يشير إلى أن هذه الإشارة كانت بسبب دمج الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي ولكن ليس NV cDNA. تم اكتشاف بروتين الكبسولة VP1 أيضًا في الكسر 8 بواسطة النشاف الغربي باستخدام مصل مضاد للـ NV (الشكل 4).أ ). تم اكتشاف جزيئات الفيروس في الكسور 2-5 بواسطة الفحص المجهري الإلكتروني السلبي (البيانات غير معروضة) ، ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن إشارة إيجابية تشير إلى تغليف الحمض النووي الريبي الجينومي في هذه الكسور ، مما يشير إلى أن جزيئات الفيروس هذه كانت فارغة. تشير هذه النتائج إلى أن نسبة صغيرة من جزيئات الفيروس يمكنها تجميع الحمض النووي الريبي الجيني ، وتم تحويل كثافة هذه الجسيمات من الكسور 2-5 (كثافة منخفضة حيث تترابط الجسيمات الفارغة) إلى الكسر 8 (كثافة عالية). لقد درسنا أيضًا دمج الحمض النووي الريبي الفيروسي في جزيئات الفيروس ، التي تم إنشاؤها في ظرفين مختلفين من ظروف التعبير (الحمض النووي الريبي دون الجيني وحده أو كلاهما تحت الجينوم والجينوم RNA) ، عن طريق استخدام بادئات خاصة بمنطقة القفيصة التي يمكنها اكتشاف كل من الحمض النووي الريبي الجينومي ودون الجيني. مرة أخرى ، تم الكشف عن إشارة موجبة في الكسر 8 في الجسيمات الناتجة عن تضافر الحمض النووي الريبي الجينومي ودون الجيني (الشكل 4).ثنائية ). ومع ذلك ، فإن جزيئات الفيروس المتولدة عن طريق التعبير عن الحمض النووي الريبي الجيني وحده لم تظهر أي إشارة إيجابية من الحمض النووي الريبي (الشكل 4بيي ). على الرغم من اكتشاف مستويات عالية من بروتين القفيصة في الكسور 2-5 (الشكل 4بيي ) ، بدت جزيئات الفيروس فارغة بواسطة الفحص المجهري الإلكتروني السلبي (البيانات غير معروضة). وهكذا ، فإن الجسيمات المتولدة عن التعبير عن الحمض النووي الريبي دون الجينومي وحده كانت جزيئات فيروسية فارغة تفتقر إلى الحمض النووي الريبي الفيروسي. تم عزل جزيئات الفيروس التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الجينومي الناتج عن تضافر الحمض النووي الريبي الجينومي ودون الجيني بكثافة CsCl تبلغ 1.32-1.36 جم / مل ، وهي مماثلة للكثافات التي تم الإبلاغ عنها سابقًا لـ NV المنقى من البراز (10 ، 26-29). على النقيض من ذلك ، فإن جزيئات الفيروس الفارغة الناتجة عن التعبير عن الجينوم كان لها كثافة CsCl من 1.27-1.29 جم / مل. وهكذا ، كانت كثافة الجزء الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي الجينومي أعلى من كثافة جزيئات الفيروس الفارغة وقريبة من كثافة جزيئات الفيروس التي تم اكتشافها في البراز البشري. تشير هذه البيانات بقوة إلى أن الحمض النووي الريبي الفيروسي قد تم دمجه في جزيئات الفيروس التي تم إنشاؤها عن طريق تضافر الحمض النووي الريبي الجينومي ودون الجيني.

دمج الحمض النووي الريبي الفيروسي في جزيئات الفيروس. تم عزل جزيئات الفيروس من المستنبتات الطافية للخلايا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي تحت الجينوم أو تضافر كل من الحمض النووي الريبي الجينومي ودون الجيني ، متبوعًا بالترسيب كما هو موضح في الشكل 3. وعولجت الجسيمات المترسبة من الكسور الفردية باستخدام DNase I و RNase A ، وكان الحمض النووي هو الحمض النووي. يتم استخراجه وإخضاعه لـ RT-PCR الكمي في الوقت الحقيقي ، والذي يتم إجراؤه باستخدام أو بدون النسخ العكسي. تم تحديد عدد نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي الموجود في كل جزء من خلال المقارنة مع منحنى قياسي ، وتم رسم النتائج مقابل الكثافة. تم فحص كل جزء أيضًا بواسطة النشاف الغربي لوجود VP1 ، وتظهر النتائج في الإدخالات. (أ) الكشف عن الحمض النووي الريبي الجيني المدمج في جزيئات الفيروس المتولدة عن تضافر الحمض النووي الريبي الجينومي ودون الجيني باستخدام البادئات المقابلة لمنطقة بول. (ب) الكشف عن الحمض النووي الريبي تحت الجينومي المدمج في جزيئات الفيروس الناتجة عن تضافر الحمض النووي الريبي الجينومي ودون الجيني (أنا) أو الحمض النووي الريبي دون الجينومي وحده (ثانيا) باستخدام البادئات المقابلة لمنطقة الكبسولة.


فيروس ، تحتوي فيروساته المعدية على الجينوم في شكل الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة ذي الإحساس بالرسول.

فيروس ، تحتوي الفيروسات المعدية منه على الجينوم في شكل RNA أحادي الجديلة مضاد للرسول.

بلازميد DNA يتكاثر عن طريق النسخ والنسخ العكسي للوسيط RNA.

وسم RNA عن طريق استبدال الركيزة UTP بـ 5-bromo-UTP (BrUTP). يمكن توطين الحمض النووي الريبي المسمى باستخدام المجهر الإلكتروني بعد وضع العلامات المناعية مع الجسم المضاد الموجه ضد BrU.

تحول مبرمج خاص بالموقع لبعض الريبوسومات المترجمة من إطار قراءة إلى آخر ، مما يسمح بتمديد جزء صغير من منتجات الترجمة في الإطار الجديد.

ترجمة مبرمجة لبعض الريبوسومات من خلال كودون إنهاء ، مما يسمح بتمديد جزء من منتجات الترجمة إلى ما وراء موقع التوقف العادي.


شاهد الفيديو: هندسة الفيروسات (أغسطس 2022).