معلومة

رسم الخرائط التقييدية لتخصيص البلازميد

رسم الخرائط التقييدية لتخصيص البلازميد


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

pUWL22 عبارة عن بلازميد دائري مزدوج تقطعت به السبل ، 10.5 كيلو بايت. يحتوي على جين يشفر إنزيمًا يمنح مقاومة الأمبيسلين في البكتيريا المضيفة. الاستنساخ في مواقع kpn I و Sst I يلغي مقاومة الأمبيسلين ، في حين أن الاستنساخ في مواقع أخرى على البلازميد لا يفعل ذلك. ينتج عن الهضم باستخدام إنزيمات التقييد التالية منفردة وتوليفة البيانات التالية:

خلاصة الإنزيم () () () () () () الأجزاء المنتجة (كيلو بايت) هند III ___________________________ 10.5 Kpn I _______________________________ 10.5 لست _______________________________ 10.5 Pvu II ______________________________ 10.5 Sst I _______________________________ 10.5 Stu I _______________________________ 10.5 هند III + Kpn II ___________________ 8.5 _______________ 2.0 Hind III + Not I _____________________ 8.0 __________________ 2.5 Hind III + Pvu II ________________ 6.0 __________________ 4.5 Hind III + Sst I _________________ 7.5 ___________________ 3.0 Hind III + Stu I _________________7. 5 __________________ 3.0 Stu I + ليس أنا ____________________ 10.0 __________________ 0.5 Stu I + Pvu II ____________________ 7.5 __________________ 3.0

الآن الأسئلة الفعلية:

أ) قم بإنشاء خريطة دائرية لـ pUWL22 ، مع تحديد موقع Hind III باعتباره الموضع 0 على الخريطة. بمجرد الانتهاء من الخريطة ، حدد الموضع النسبي لجين الأمبيسلين.

رسم الخرائط البلازميد الخاص بي:

ما أحتاجه للمساعدة في الإشارة إلى الموضع النسبي لجين الأمبيسلين. وجاء في البيان أعلاه أن "الاستنساخ في مواقع Kpn I و Sst I يلغي مقاومة الأمبيسلين". هل هذا يعني أنه يقع بين Sst 7.5 و Kpn 8.5؟ من فضلك قل لي أين هو ولماذا هناك.

ملاحظة. لقد ارتكبت خطأ في إنزيم Sst I ، ومن المفترض أن يكون @ 7.5 وليس 7.8.

السؤال بعد ذلك هو:

ب) اقترح 2 من الملخصات المزدوجة الأخرى التي يمكن إجراؤها لتأكيد تحليلك. توقع أحجام الأجزاء التي سيتم إنشاؤها من هذه الملخصات.

الرجاء الإجابة على هذا وشرح لماذا.


أ) هنا الخريطة الصحيحة:

لقد ارتكبت خطأً على خريطتك في موقع PvuII (ليس على 6.5 كيلو بايت من بداية البلازميد ، ولكن على 6 كيلو بايت).

هل يمكن لـ Kpn أنا لا أذهب إلى موقع 8.5 ، وما زال ينشئ 2 و 8.5 ، لذا ألا يوجد أكثر من خيار واحد صحيح لخريطة البلازميد؟

نعم فعلا. ما عليك القيام به لعمل الخريطة الصحيحة هو تجربة جميع المواضع الممكنة لمواقع التقييد:

  1. تبدأ بـ HindIII وتضعه في الموضع 0 من المتجه الخاص بك.
  2. يمكن أن يكون موقع KpnII إما على 2 كيلوبايت (يسار HindIII) أو 8.5 كيلوبايت (يمين HindIII). ارسم كلا الإصدارين من البلازميد.
  3. يمكنك وضع موقع NotI الذي يمكن أن يكون بحجم 2.5 كيلوبايت أو 8 كيلوبايت. الآن لديك أربعة احتمالات مختلفة للبلازميد:
    1. HindIII [0] ، KpnII2 ، NotI [2.5]
    2. HindIII [0] ، KpnII [8.5] ​​، NotI [2.5]
    3. HindIII [0]، KpnII2، NotI [8]
    4. HindII [0] ، KpnII [8.5] ​​، NotI [8]
  4. ثم تفعل الشيء نفسه بالنسبة لبقية مواقع التقييد. عندما تصل إلى آخر هضمين ، يوجد خيار واحد فقط للبلازميد الصحيح المتبقي بالترتيب التالي ، كما هو موضح على خريطة البلازميد أدناه.

يجب أن أشير إلى أن كلا من StuI و SstI يمكن أن يكونا عند 3 كيلوبايت (يمكن أن يكونا بجانب بعضهما البعض). ثم سيكون الجزءان من الملخص حوالي 3 كيلو بايت و 7.5 كيلو بايت تقريبًا. لذلك من الناحية الفنية ، هناك نسختان محتملتان: صحيح

أ) HindIII [0] ، KpnII2 ، NotI [2.5] ، StuI [3] ، PvuII [6] ، SstI [7.5]

ب) HindIII [0] ، KpnII2 ، NotI [2.5] ، StuI [3] ، SstI [3] PvuII [6]

إذا كنت تستطيع ، هل يمكنك من فضلك توضيح السؤال ب عن سبب وجود خيار واحد صحيح لخريطة البلازميد؟ أيضا ، ماذا يقصدون بهضم مزدوج لتأكيد تحليلك؟

يعني الهضم المزدوج أنك تقطع البلازميد الخاص بك باستخدام إنزيمين مقيدين مختلفين في نفس الوقت. نظرًا لأن لديك بالفعل خريطة مفترضة للبلازميد ، يمكنك توقع العصابات المتوقعة. إذا لاحظت الأحجام المتوقعة ، فسيكون تصميمك صحيحًا ويتم تأكيد تحليلك.

للتحقق من أيهما صحيح ، سأقوم بعمل ملخص مزدوج مع: 1) SstI و PvuII ، وإنشاء نطاقي 1.5 كيلو بايت و 9 كيلو بايت إذا كان التصميم أ) صحيحًا أو 3 كيلو بايت ونطاقات 7.5 كيلو بايت إذا كان التصميم ب) صحيحًا 2) StuI و SstI ، لتوليد نطاقي 4.5 كيلو بايت و 6 كيلو بايت إذا كان التصميم أ) صحيحًا أو نطاق 10.5 كيلو بايت إذا كان التصميم ب) صحيحًا

لتأكيد "جين الأمبيسلين" يبدأ عند kpn I 2.0 وينتهي عند موقع 3.0 stu I الصحيح ؟؟ لذا فإن جين الأمبير هو 1 كيلو بايت ؟؟ لذا فإن الموضع النسبي لجين الأمبير يبدأ عند 2.0 وينتهي عند 3.0. لماذا جاء في السؤال أن الاستنساخ في مواقع kpn I و sst I يلغي مقاومة الأمبيسلين بينما الاستنساخ في المواقع الأخرى لا يفعل ذلك؟ ماذا يقصدون بذلك؟ هل يختلف جين مقاومة الأمبيسلين عن جين الأمبيسلين ؟؟

إن جين مقاومة الأمبيسلين وجين الأمبيسلين متماثلان. يشير إلى إنزيم (بيتا لاكتاماز) الذي يحلل الأمبيسيلين ، وبالتالي يمكن للخلايا التي تؤوي البلازميد المحتوي على الأمبيسيلين أن تعيش عندما تكون مطلية بالأمبيسيلين.

هل أنت متأكد من أن المقاومة تتعطل إذا تم الاستنساخ في موقع SstI وليس StuI؟ إذا كان هذا هو الحال بالفعل ، فسيكون موقع StuI ومواقع SstI بجوار بعضهما البعض ، حيث يكون لديك أولاً موقع SstI ، متبوعًا بـ StuI. جين amp يزيد الجين بقليل عن 1 كيلو بايت ، لذلك يبدأ في منبع KpnII وينتهي مباشرة بعد SstI ، لكنه لا يعطل StuI. إذا تم استنساخ شيء ما في مواقع KpnII أو SstI ، فسيتعطل إطار القراءة المفتوح للأمبير ، ولا يمكن للبروتين أن يعمل.


هيريس الحل

حصلت على علامة واحدة لمنصب ليس أنا


رسم خرائط إنزيم التقييد للبلازميد

معًا عن طريق إنشاء رابطة فسفودايستر بين 3 'OH للنيوكليوتيد و 5' فوسفات من آخر. إن الإنزيم الأساسي الذي يربط جزءًا من الحمض النووي والناقل معًا هو T4 DNA ligase ، الذي ينشأ من T4 العاثية. سيقوم هذا الإنزيم بربط الأطراف المتماسكة التي تنتجها إنزيمات التقييد. سيقوم T4 أيضًا بربط الأطراف الحادة ولكن هناك حاجة إلى تركيز عالٍ من الإنزيم. يتطلب تفاعل الارتباط أيضًا وجود ماء وعازل يحتوي على ATP. ATP هو مصدر الطاقة الذي يسمح لـ


التقنيات الحالية والناشئة لتشخيص العدوى الميكروبية

تانيس سي دينجل ، دنكان آر ماكانيل ، في طرق علم الأحياء الدقيقة ، 2015

2.1.1 تقييد تحليل نوكلياز

REA هي واحدة من أولى طرق كتابة السلالة الوراثية الموصوفة والأكثر مباشرة. يستخدم عادة إنزيمًا هندIII ، الذي يقطع تسلسل الجينوم بشكل متكرر مما يؤدي إلى عدد كبير من النطاقات التي يمكن حلها عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام التقليدي (Kuijper، Oudbier، Stuifbergen، Jansz، & amp Zanen، 1987 Wren & amp Tabaqchali، 1987). تم وصف استخدامه لأول مرة في عدة جيم صعب دراسات الفاشية في عام 1987. Kuijper et al. استخدم REA لإظهار أن اثنين من المرضى ، الذين أصيبوا بالتهاب القولون الغشائي الكاذب أثناء وجودهم في المستشفى في نفس الغرفة ، أصيبوا بنفس المرض جيم صعب أضنى. بالإضافة إلى، جيم صعب تبين أن العزلات من البيئة المحيطة بهؤلاء المرضى لها أنماط تقييد متطابقة ، مما يشير إلى مصدر بيئي للعدوى (Kuijper et al. ، 1987). دراسة ثانية أجريت في نفس الفترة تقريبًا استخدمت REA لإظهار أن 10 عزلات من جيم صعب المعزولة أثناء تفشي المرض في المستشفى لا يمكن تمييزها وأن الملامح التي تم الحصول عليها كانت خاصة بالسلالة (Wren & amp Tabaqchali ، 1987). جمعت Peerbooms والزملاء جيم صعب على مدى 4 أشهر وأخضعوها لـ REA (Peerbooms، Kuijt، amp Maclaren، 1987). كانوا قادرين على التمييز بين 22 نوعًا مختلفًا من القيود بين 38 سلالة ، وأكثرها شيوعًا يتم تخصيصها لأنواع REA من A إلى E. ارتبطت هذه الأنماط جيدًا بأنماط الحساسية لمضادات الميكروبات ، على الرغم من أنها كانت أقل تمييزًا من كتابة REA. في عام 1993 ، Clabots et al. كانوا أول من وصف طريقة REA بعمق وفهرس 1965 جيم صعب يعزل إلى 206 نوع فريد من أنواع REA (Clabots et al. ، 1993). كان هذا العمل الأساسي هو الأساس لتسميات كتابة REA المستخدمة حاليًا.

يظل REA أداة وبائية مهمة في تصنيف سلالة جيم صعب ويستخدم على نطاق واسع في مختبر Gerding في Hines ، VA. اعتبارًا من عام 2003 ، تم تجميع مجموعتهم من جيم صعب عزلات ، تم جمعها طوليًا على مدى أكثر من عقدين من الزمن ، بلغ عددها أكثر من 5000 ، وتضم ما لا يقل عن 436 نوعًا مختلفًا من REA عبر 108 تجمعات من سلالات REA. كان توفر بيانات كتابة سلالة REA الواسعة والتاريخية أمرًا محوريًا في فهمنا لعدد من الدراسات الوبائية واسعة النطاق لـ جيم صعب، بما في ذلك حالات التفشي الأخيرة لسلالات NAP1 / BI في شرق كندا والولايات المتحدة (Killgore et al. ، 2008 McDonald et al. ، 2005). بينما تم استخدام REA على نطاق واسع في الدراسات الوبائية لـ جيم صعب وقد أظهر باستمرار قوة تمييزية عالية وإمكانية استنساخ ، وتفسير أنماط النطاق أمر صعب ، والبروتوكول نفسه يتطلب تقنيًا وإمكانية نقل البيانات الناتجة بين المختبرات يمثل مشكلة. بسبب هذه التحديات ، أبلغ عدد قليل من المختبرات عن الاستخدام الروتيني لـ REA لـ جيم صعب كتابة السلالة ، على الرغم من أن الكتابة المرجعية متاحة من خلال التشاور مع مختبر خبير في REA.


4380 E2 Lab Protocol U21

في هذا الأسبوع كنا سنقوم بسكب هلام agarose وتشغيله لإنشاء خريطة تقييد للبلازميد الذي تم هضمه مسبقًا بمزيج من عدة إنزيمات تقييدية. بحلول نهاية هذا التمرين المختبري ، يجب أن تكون قادرًا على إنشاء خريطة تقييد معطياً مادة هلامية مقيدة أو التنبؤ بنمط الهلام بالنظر إلى خريطة تقييد البلازميد.

أ- تحضير جل 1٪: فيديو عن التعليم الإلكتروني كنت ستتبع هذا الإجراء: 1. قم بقياس 50 مل من 1XTAE (Tris-Acetate-EDTA) - تشغيل العازلة إلى قارورة. 2. وزن الكمية المناسبة من الاغاروز لحجم 50 مل النهائي. 3. أضف الاغاروز إلى المخزن المؤقت ، واخلطه برفق. 4. استخدم دورق لتغطية الدورق والميكروويف لمدة 1 دقيقة. احترس من الغليان المفرط. * يجب أن يبدو الاغاروز واضحا ولا يحتوي على أي تكتلات بعد تسخينه في الميكروويف. 5. جهز علبة الجل الخاصة بك. أدخل المشط في الموضع الصحيح. 6. قبل صب الجل ، اطلب من TA إضافة 5 مايكرولتر من بقعة حمض نووي GelRed إلى القارورة. 7. حرك القارورة بحذر لخلط GelRed مع الجل. كن حذرا! الاغاروز سيكون حارا جدا! تصب في صينية جل. اتركيه لمدة 15-20 دقيقة حتى يتماسك تمامًا. * اشطف القارورة بالماء الساخن في أسرع وقت ممكن * ستعرف أن الجل الخاص بك قد تم ضبطه عندما يصبح الاغاروز معتمًا. 8. بمجرد أن يتجمد الجل ، اقلب صينية الجل الموجودة في علبة هلامية إلى الموضع المناسب قبل تحميل العينات.

ب. قم بإعداد علبة الجل الخاصة بك كنت ستتبع هذا الإجراء: صب حوالي 300 مل من عازل الجري (1XTAE) في علبة الهلام لتغطية الجل. * يجب أن يكون مستوى المحلول المنظم فوق سطح الهلام ببضعة مليمترات. يجب غمر الآبار بالكامل. الكثير من المخزن المؤقت سوف يبطئ الرحلان الكهربي.

ج. تحميل العينات الخاصة بك: فيديو عن التعليم الإلكتروني كنت ستتبع هذا الإجراء: أنابيب عينة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 5 ثوان. تحتوي العينات التي سيتم استخدامها على DNA البلازميد المهضوم بتركيبات إنزيمية مختلفة. ستكون العينات مشفرة بالألوان. * أزرق أو أخضر *يضاف محلول التحميل ** (يسمى أيضًا صبغة التحميل) إلى العينات. يحتوي محلول التحميل على صبغة زرقاء بروموفينول تعمل بسرعة

300 قطعة من الحمض النووي. كما أنه يحتوي على الجلسرين لمنع الطفو. اعتمادًا على كمية البروموفينول والجلسرين المستخدمة ، يمكن تحضير صبغة التحميل على شكل 10x ، 5X ، إلخ. يجب أن يكون التركيز النهائي لصبغة التحميل للعينات 1X تقريبًا. أمر التحميل : تخطي البئر الأول وقم بتحميل سلم الحمض النووي في البئر 2. ثم قم بتحميل العينات من اليسار إلى اليمين بالترتيب المقدم كمية التحميل : العينات الخاصة بك سيكون لكل منها 10ul. قم بتحميل كل عينة.

  • تعتمد كمية العينة المحملة في الآبار على حجم المشط. بالنسبة للمشط الخاص بك ، فإن الحد الأقصى للكمية التي يمكن وضعها في البئر هو حوالي 15 ميكرولتر. تم قطع البلازميد pAMP باستخدام إنزيمات التقييد الموضحة في العينات. سيتم تحميلها بالترتيب التالي.

العينات: ايكو أنا هضم بامه أنا هضم هين dIII هضم ايكو أنا/ بامه أنا هضم ايكو أنا/ هين dIII هضم بامه أنا/ هين dIII هضم بلازميد غير مهضوم

د- بدء الرحلان الكهربي تأكد من اختيار موضع القطب الصحيح. اضبط الجهد على 120 فولت. قم بتطبيق التيار الكهربائي عن طريق الضغط على "تشغيل" على مصدر الطاقة * إذا كنت تريد النظر إلى الجل ، فلا تقم بإزالة الغطاء دون الضغط على زر "إيقاف مؤقت".

E. التقاط صورة من هلام الخاص بك (البيانات المقدمة على التعلم الإلكتروني) بعد أن تعمل مقدمة الصبغة الزرقاء على مسافة 1 سم تقريبًا من قاع الجل ، أوقف الرحلان الكهربي بالضغط على زر "إيقاف مؤقت" الموجود في مصدر الطاقة. أخرج الصينية مع الجل من العلبة. ضع الدرج مع الجل على منشفة ورقية وأخذه إلى نظام التصوير الهلامي. سيتم عمل صورة للجل لاستخدامك. تجاهل بشكل صحيح العازلة المستخدمة والهلام.


عينة تعيين توليف الحمض النووي GENE4002

ب) مجموعة صغيرة من الفراشات تطير إلى مونتانا المجاورة وتبدأ في تكوين مجموعة سكانية جديدة. بعد عدة أجيال ، هناك عدد كبير من عشوائيات التزاوج العشوائي من العث الصقر. تكشف ملاحظات عث مونتانا ما يلي:

ما هي ترددات الأليل لـ C و ct و cw؟

نظرًا لأن أجنحة تان تساوي صفرًا ، فإن ترددات C و ct و cw هي 0.5 و 0 و 0.5 على التوالي (C و Cw لهما ترددات متساوية)

ج) التغيير في تردد الأليل في سكان مونتانا مقارنة بالسكان الكنديين الأصليين هو مثال على الانجراف الجيني / تأثير المؤسس.

السؤال 2: تضيف هيستون أسيتيل ترانسفيرازز مجموعات الأسيتيل إلى اللايسينات ، وهي أحماض أمينية موجبة الشحنة. كيف يمكن أن يؤثر ذلك على ارتباط الجسيم النووي بالحمض النووي؟

يقلل ارتباط الجسيم النووي بالحمض النووي. في البداية ، يجذب النوكليوسوم الإيجابي (حيث أن اللايسين له شحنة موجبة) يجذب الحمض النووي السالب. الآن لا يحتوي اللايسين على شحنة موجبة ولديه مجموعة أسيتيل سالبة مرتبطة به بعد الأستلة. هذا يعني أن النواة تصبح سالبة الشحنة وبالتالي تصد الحمض النووي.

السؤال 3: إذا تم استنفاد الريبونوكليوتيدات من خلية خلال المرحلة S ، فكيف سيتأثر تخليق الحمض النووي؟ تجاهل اعتبارات الطاقة.

سيتوقف النسخ المتماثل لأن الريبونوكليوتيدات مطلوبة لبدء تخليق الحمض النووي. وذلك لأن المرحلة S هي المكان الذي يبدأ فيه تخليق الحمض النووي ويتطلب استخدام الريبونوكليوتيدات لبدء تخليق الحمض النووي من شظايا أوكازاكي.

السؤال 4. فيما يلي درجات حرارة الانصهار لجزيئات DNA مزدوجة الشريطة مختلفة:

أ) باستخدام الحروف (A-E) لترمز إلى جزيئات DNA ، قم بترتيب الجزيئات المذكورة أعلاه من المحتوى الأدنى إلى المحتوى الأعلى لأزواج G-C.

يحتوي محتوى GC العالي على نقطة انصهار عالية. ومن ثم يكون الترتيب على النحو التالي (من GC إلى أعلى) B & ltA & ltD & ltC & ltE.

ب) اشرح إجابتك في ما لا يزيد عن 6 أسطر.

سبب نقطة الانصهار العالية لمحتوى GC العالي هو أن رابطة GC هي رابطة ثلاثية مقارنة بـ AT وهي رابطة مزدوجة. هذا يعني أنه يلزم قدر أكبر من الطاقة لكسر رابطة GC أكثر من رابطة AT. وهذا بدوره يعني أن نقطة الانصهار لمحتوى أعلى من GC ستكون أعلى من العينات ذات المحتوى المنخفض من GC.

السؤال 5: يحتوي البروتين الموجود في أسماك الحمار الوحشي عادةً على تسلسل الأحماض الأمينية N-terminal التالية:

يتم تغيير متحولة بحيث يتم تغيير anticodon من الحمض الريبي النووي النقال من 5 & rsquo-GAU-3 & [رسقوو] إلى 5 & rsquo-CAU-3 & [رسقوو]. باستخدام الشفرة الجينية الواردة في الملحق ، أجب على الأسئلة التالية:

أ) ما هو تسلسل الحمض الأميني N-terminal لهذا البروتين في المتحولة؟

يظل الحمض الأميني الطرفي N كما هو الحال في Met-Val-Ser-Ser-Pro-Met-Gly-Ala-Ala-Met-Ser. هذا لأن tRNA anticodon يتغير من 5 & rsquo-GAU-3 & rsquo إلى 5 & rsquo-CAU-3 & rsquo ليس له أي تأثيرات مقابلة لأن الحمض النووي الريبي المتحور يرتبط بالميثيونين بدلاً من Isoleucine. نظرًا لعدم وجود Isoleucine في الخيط المحدد ، يظل التسلسل كما هو- Met-Val-Ser-Ser-Pro-Met-Gly-Ala-Ala-Met-Ser.

ب) هل سيكون لهذه الطفرة تأثير على النمط الظاهري للكائن الحي و rsquos؟ اشرح أسبابك.

لا ، هذه الطفرة لا تؤثر على النمط الظاهري للكائن الحي و rsquos. يتطلب التغيير في النمط الظاهري للأسماك قدرًا كبيرًا من التغييرات والطفرات في متواليات أساسية مختلفة. التغيير في الحمض الريبي النووي النقال أو الطفرة فيه ليس له أي آثار في النمط الظاهري.

السؤال 6: Klemke et al. اكتشف (2001) ظاهرة ترميز مثيرة للاهتمام في exon داخل جين مستقبل هرمون عصبي في الثدييات ، حيث يبدو أن كيانين بروتينيين (XL & alphas و ALEX) ينتجان من نفس exon. يوجد أدناه تسلسل الحمض النووي للنهاية exon & rsquos 5 & rsquo-end المشتقة من الجرذ. تمثل الأحرف الصغيرة التسلسل الأولي لجين XL & alphas ، وتشير الأحرف الكبيرة إلى الجزء الأولي من منطقة تشفير ALEX. (من أجل البساطة ، وللتوافق مع قاموس ترميز الحمض النووي الريبي ، من المعتاد تمثيل الخيط غير القالب لقطاع الحمض النووي). gtcccaaccatgcccaccgatcttccgcctgcttctgaagATGCGGGCCCAG باستخدام الكود الجيني المقدم لك في هذا المستند & rsquos الملحق

أ) توفير تسلسل الرنا المرسال لكل من الجينات. أشر إلى التوجه الجزيئي (نهايات 3 و rsquo و 5 و rsquo) للتسلسلات.

ب) توفير تسلسل الأحماض الأمينية لكل تسلسل تشفير. في منطقة التداخل ، هل تسلسل الأحماض الأمينية متماثل؟

3 & rsquo ----- AUG CGG GCC CAG ---- 5 & rsquo: met arg ala gln

3 & rsquo ---- gUc-cca-acc-aUg-ccc-acc-gaU-cUU-ccg-ccU-gcU-UcU-gaa- gAU --- 5 & rsquo: Val Pro خلال التقى pro thr asp leu Pro pro ala ser glu -اسب

ملاحظة: يتراكب Free & ldquog & rdquo مع AU الخاص بـ AUG في منطقة تشفير ALEX وبالتالي تشكيل asp.

أيضًا ، في منطقة التداخل ، لا يتشابه الأحماض الأمينية مع منطقة تداخل كود ALEX التي تحتوي على الميثيونين بينما يحتوي XL & alphas على حمض الأسبارتيك.

ج) هل هناك أي مزايا لامتلاك نفس تسلسل الحمض النووي لمنتجين بروتينين؟ ناقش المزايا أو العيوب التطورية المحتملة لامتلاك نفس رمز تسلسل الحمض النووي لمنتجين بروتين.)

نعم هناك ميزة لامتلاك نفس تسلسل الحمض النووي لبروتينين. أثناء إنتاج البروتينات المؤتلفة ، فإن استخدام جزء من الحمض النووي كإدخال في ناقل له حدود. عندما يكون لتسلسل الحمض النووي القدرة على الترميز لبروتينين ، فيمكن عندئذٍ إنتاج منتجين باستخدام تقنية إعادة الارتباط دون الحاجة إلى نواقل منفصلة. هناك ميزة تطورية لامتلاك نفس تسلسل الحمض النووي لمنتجين بروتينين. يتم تقليل حجم الجينوم وزيادة كفاءة تصنيع المنتج لتشعب. هذا ينطبق بشكل خاص على الفيروسات التي تتطور بشكل أسرع ولديها جينوم فعال مع تشفير الحمض النووي لتخليق البروتينات المتعددة.

السؤال السابع: كإجراء طارئ أخير للضرر الشديد في الحمض النووي ، تقوم Bacillus subtilis ، مثل E. coli ، بتنشيط استجابة SOS. ينشط تلف الحمض النووي بروتين RecA ، مما يؤدي إلى تشقق بروتين LexA نفسه. يرتبط LexA السليم بتسلسل إجماعي ، 5 & rsquo-CGAACNNNNGTTCG-3 & rsquo ، الموجود في منطقة المروج لحوالي 17 جينًا تستخدم لإصلاح تلف الحمض النووي. إن Cleaved LexA غير قادر على ربط تسلسل الإجماع هذا. لذلك ، يؤدي انقسام ليكسا إلى نسخ هذه الجينات.

أجب عن الأسئلة التالية وبرر إجابتك بإيجاز.

أ) هل ليكسا بروتين تنظيمي إيجابي أم سلبي؟

LexA هو بروتين منظم سلبي لأنه يرتبط بمنطقة المروج ويوقف عملية النسخ. عندما لا يكون LexA موجودًا أو مشقوقًا ، يحدث النسخ. هذا يعني أن LexA منظم سلبي.

ب) ما هو الدور الذي يلعبه التسلسل 5 & rsquo-CGAACNNNNGTTCG-3 & rsquo؟

يتمثل دور هذا التسلسل في المساعدة في ربط LexA وبالتالي عدم السماح للحمض النووي بالنسخ ، مما يعني أن الجينات الأخرى مثل dinA و dinB و dinC و recA الموجودة بعد هذا التسلسل لا يمكن نسخها. وهذا بدوره يعني أنه لا يمكن تصنيع البروتينات اللازمة لتصحيح خيوط الحمض النووي.

ج) تغير الطفرات الأليلية ، المعينين A و B ، التسلسل 5 & rsquo-CGAACNNNNGTTCG-3 & rsquo للجين بحيث لا تستطيع LexA ربط التسلسل A على الإطلاق ولكنها ترتبط بالتسلسل B بشكل أكثر إحكامًا مما تفعله بالنوع البري تسلسل. افترض أنه تم تشغيل استجابة SOS في كل متحولة. ما هو النمط الظاهري الذي تتوقع أن يظهره كل منهم؟

نظرًا لأن LexA لا يمكنه الارتباط بالتسلسل ، يكون المروج نشطًا دائمًا وسيتم تصنيع عوامل إصلاح الحمض النووي إلى أجل غير مسمى. بصرف النظر عما إذا كان SOS يحدث أم لا ، تقوم آلية إصلاح الحمض النووي بتجميع العوامل إلى أجل غير مسمى ، مما يؤدي إلى التهاب في النمط الظاهري.

إذا تم السماح لـ LexA بالالتزام بإحكام بالتسلسل المتحور 5 & rsquo-CGAACNNNGTTCG-3 & rsquo ، فعندما يتم تشغيل استجابة SOS ، فإن LexA سوف تنشق ببطء لأن ميزة الانقسام الذاتي لـ LexA لا تتأثر بضيق LexA بالتسلسل المتحور .

د) يتم إدخال البلازميد الحامل لجين lexA الطافر في سلالة عادية من العصيات الرقيقة. يصنع الجين الطافرة بروتين LexA الذي يرتبط بإحكام بالتسلسل 5 & rsquo-CGAACNNNNGTTCG-3 & rsquo ولكنه غير قادر على الخضوع للانقسام الذاتي. ما هو النمط الظاهري الذي تتوقع أن تمتلكه هذه السلالة؟

نظرًا لأن هذه السلالة لا يمكن أن تشق ذاتيًا LexA المرفقة بالتسلسل 5 & rsquo-CGAACNNNNGTTCG-3 & rsquo ، فإن السلالة ستعرض أضرارًا شديدة في الحمض النووي متبوعة بموت السلالة. هذا لأنه لا يمكن إزالة LexA من تسلسل المروج 5 & rsquo-CGAACNNNNGTTCG-3 & rsquo والذي بدوره يعني أنه لا يمكن للكائن الحي توليف البروتينات المطلوبة لإصلاح الحمض النووي.

السؤال 8: لا يمكن دائمًا التعبير عن جينات حقيقيات النوى المستنسخة في الخلايا البكتيرية. ما هي بعض الأسباب المحتملة لذلك؟

السبب الأول لذلك هو أن بدائيات النوى لا تحتوي على نواة مرتبطة بالغشاء. هذا يعني أن الجينات من حقيقيات النوى لا يمكن التعبير عنها في بدائيات النوى لأن جين حقيقيات النوى يتطلب أن تكون النواة داخل الغشاء من أجل نسخ أفضل للجين متبوعًا بالترجمة لإنتاج البروتينات.

يعد التعديل اللاحق للترجمة ظاهرة أساسية مهمة لوحظت في جينات حقيقية النواة. تعد التعديلات اللاحقة للترجمة نادرة في أنظمة تعبير بدائيات النوى. ينتج عن هذا إنتاج بروتينات غير مجدية أو بعبارة أخرى ، فشل في التعبير عن البروتينات المطلوبة.

السؤال 9: أنت تحاول تحديد ما إذا كانت عينة طعام معالج مشتق من النبات (على سبيل المثال ، رقاقة الذرة) تحتوي على مادة من كائن معدل وراثيًا (GMO). أولاً ، تقوم بسحق العينة ومحاولة استخراج الحمض النووي منها. بعد ذلك ، تقوم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعتين مختلفتين من البادئات. ستقوم مجموعة واحدة من التمهيدي بتضخيم تسلسل الحمض النووي الموجود في جميع النباتات. ستقوم مجموعة التمهيدي الثانية بتضخيم تسلسل الحمض النووي الموجود فقط في النباتات المعدلة وراثيًا.

أ) لماذا يجب عليك استخدام مجموعتي البادئات لهذه التجربة؟

يتم استخدام كلتا المجموعتين من البادئات لتضخيم الجين المعني الموجود في النباتات. على سبيل المثال ، تم تصميم أحد التمهيدي خصيصًا ليرتبط بتسلسل فريد موجود في النباتات العادية ويرتبط التمهيدي الآخر بالتسلسل غير الموجود في النبات ولكن في أحد مكونات الكائنات المعدلة وراثيًا. بهذه الطريقة ، ستكون البادئات قادرة على تضخيم الجين المعني أو الجين المستهدف وستظهر النطاق المقابل في PCR.

ب) بالإضافة إلى عينة الاختبار ، تحصل على عينة تحكم سلبية (المواد الغذائية التي أنت متأكد من أنها لا تحتوي على مادة معدلة وراثيًا) وعينة تحكم إيجابية (المواد الغذائية التي أنت متأكد من أنها تحتوي على مادة معدلة وراثيًا). تقوم بإجراء استخلاص الحمض النووي على هذه العينات الثلاث ثم إجراء استخلاص تفاعل البوليميراز المتسلسل مع كل مجموعة من مجموعتي التمهيدي الموصوفين أعلاه. أكمل الجدول التالي بتوقعاتك (العمود 3) لعينة اختبار لا تحتوي على طعام معدل وراثيًا و (العمود 4) عينة اختبار لا تحتوي على طعام معدّل وراثيًا.

لا يحتوي عنصر التحكم السلبي على أي مواد معدلة وراثيًا. هذا يعني أنها تعطي رباطًا للبادئات النباتية ولا تحتوي على البادئات المعدلة وراثيًا. يحتوي عنصر التحكم الإيجابي على مادة معدلة وراثيًا معها وهذا يعني أنها توفر نطاقًا للاشعال المعدلة وراثيًا أيضًا مع البادئات النباتية.


الخريطة القيدية للبلازميد الدائري

أحتاج إلى إنشاء خريطة تقييد محتملة لبلازميد دائري. يرجى الاطلاع على البيانات المرفقة.

© BrainMass Inc. brainmass.com 4 مارس 2021 ، 11:21 مساءً ad1c9bdddf
https://brainmass.com/biology/recombinant-dna/restriction-map-circular-plasmid-415527

المرفقات

معاينة الحل

انظر المرفق للحل الكامل.

تحليل البيانات ملخص واحد في كل مرة. ارسم رسومات دائرية أو خطية لكل منها لمساعدتك على تصور البيانات.

يتضمن الهضم الأول إنزيمًا واحدًا فقط ، هو HaeII. حجم الجزء الناتج من قطع البلازميد باستخدام HaeII هو نطاق واحد يبلغ 12 كيلو بايت. من هذه القطعة من البيانات ، يمكنك أن تفترض دليلين محتملين: 1. يقطع HaeII مرة واحدة فقط لأن البلازميدات نادرًا ما يكون طولها 24 كيلو بايت ، و 2. الحجم الكلي للبلازميد الخاص بك هو 12 كيلو بايت. يجب أن تحتوي جميع عمليات الهضم الأخرى على قطع يصل مجموعها إلى 12. في أي وقت يقطع الإنزيم مرة واحدة فقط ، يكون حجم الجزء الناتج هو الحجم الكلي للبلازميد. (ملاحظة: لا يعني مجرد وجود شريط واحد أنه ينقطع مرة واحدة فقط. نرى هذا في الملخص الخامس.)
(انظر المرفق)

يتضمن الهضم الثاني إنزيمًا واحدًا ، ولكنه ينتج عنه نطاقان يصل مجموعهما إلى 12 كيلو بايت. هذا يؤكد فكرة أن HaeII هو حقًا قاطع واحد. يمكنك الآن أن تكون أكثر ثقة في أن PstI عبارة عن ملف.

ملخص الحل

يشرح هذا الحل كيفية رسم خريطة تقييد محتملة للبلازميد الدائري.


رسم الخرائط التقييدية لتخصيص البلازميد - علم الأحياء

تتعرف نوكليازات التقييد مثل EcoRI على متواليات متناظرة محددة وتشق رابطة فسفودايستر على كل خيط في هذا التسلسل. بعد الهضم باستخدام نوكلياز مقيد ، يمكن فصل شظايا الحمض النووي الناتجة عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ويمكن تقدير حجمها. يتم إنشاء خريطة التقييد باستخدام بيانات حجم الجزء لتحديد موقع تسلسلات التعرف على نوكلياز محددة على البلازميد.

يتطلب كل إنزيم تقييد شروط تفاعل محددة للنشاط الأمثل. يعتبر تركيز الملح (عادة كلوريد الصوديوم) من أهم شروط التفاعل التي تختلف بين إنزيمات التقييد المختلفة. تمت صياغة محاليل الإنزيم خصيصًا لتوفير تركيز الملح لنشاط الإنزيم الأمثل. لذلك ، من المهم أن يتم استخدام محلول المخزن المؤقت الصحيح لأنزيم تقييد معين.

المدرجة أدناه هي إجراء عام لإجراء ملخصات التقييد. ومع ذلك ، ضع في اعتبارك أنه يجب على المرء دائمًا استشارة توصيات الشركات المصنعة للظروف المثلى لكل إنزيم تقييد (انظر الموارد لمزيد من المعلومات حول إنزيمات التقييد).

1. لكل هضم ، اجمع بين الحلول التالية في أنبوب ميكروسينتريفوجي.

غرض كمية
الماء منزوع الأيونات 6 ماي
10x عازلة رد فعل 1 ماي
DNA miniprep البلازميد 3 ماي
المجموع 10 ماي
2. قم بإزالة نوكلياز التقييد (سيتم إدراج إنزيمات محددة لاستخدامها على السبورة السوداء) من المجمد وضعها على الجليد. من المهم الحفاظ على الإنزيم باردًا. أضف 0.5 ميكرولتر من محلول الإنزيم إلى الخليط الذي صنعته في الخطوة 1. في حالة الهضم باستخدام إنزيمين مقيدين (هضم مزدوج) ، أضف 0.5 ميكرولتر من الإنزيم الثاني.

3. اضغط على الأنبوب لخلط المحتويات ثم اضغط على الأنبوب في جهاز الطرد المركزي الصغير.

4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة إلى بين عشية وضحاها. بعد الحضانة توضع الأنابيب في الفريزر.

الملخص الأول للفصل الدراسي

سيكون ملخص التقييد الأول الخاص بك عبارة عن ملخص مزدوج لتحديد حجم الملحق (cDNA). هضم مزدوج هو واحد حيث يتم استخدام اثنين من الإنزيمات المقيدة لهضم الحمض النووي في تفاعل واحد. في هذه الحالة ، ستستخدم EcoR I و BamH I. لا يوجد سوى موقع واحد في ناقل البلازميد لكل من هذه الإنزيمات ويقعان على جانبي الحمض النووي المُدرج.

سيؤدي الهضم مع كليهما إلى قطع الإدخال من المتجه. في الأسبوع القادم ستحدد حجم الملحق عن طريق فصل الحمض النووي المهضوم على هلام الاغاروز. قد يحتوي الملحق أيضًا على موقع لأحد هذين الإنزيمين أو كليهما ، وإذا كان الأمر كذلك ، فسيتم تقطيع الإدخال إلى أجزاء متعددة. من خلال جمع أحجام كل جزء ، لا يزال بإمكانك تحديد حجم الملحق.

1. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، ضع 6 ميكرو لتر من الماء منزوع الأيونات ، و 1 ميكرو لتر من محلول تفاعل EcoR I 10x ، و 3 ميكرو لتر من بلازميد miniprep ، و 0.5 ميكرو لتر من إنزيم EcoR I و 0.5 ميكرو لتر من إنزيم BamH I. يتم تخزين الإنزيمات والعازل في الفريزر. الأنبوب الذي يحتوي على المخزن المؤقت له سطح أسود. يحتوي الأنبوب الذي يحتوي على إنزيم EcoR I على حرف "E" مع نقطة سوداء في الأعلى ، بينما يحتوي الأنبوب الذي يحتوي على إنزيم BamH I على "B" ونقطة بنية في الأعلى.

2. اضغط على الأنبوب لخلط المحتويات ثم اضغط على الأنبوب في جهاز الطرد المركزي الصغير.

3. احتضان في حاضنة 37 درجة لمدة 1 ساعة. قم بتخزينه في الفريزر أو تحضيره للرحلان الكهربائي لجيل الاغاروز.


فحص هضم تقييد البلازميد DNA

هذه الأسئلة تطرح:
1. كيف تتنبأ بعصابات الحمض النووي التي يتم إنتاجها بعد هضم البلازميد المأشوب. كيف تعرف حجم البلازميد المؤتلف بعد استنساخه وربطه بالبلازميد.
2. كيف يمكنك تحضير مزيج رئيسي لاستخدامه في ملخص التقييد.
3. ما هو رقم نسخة البلازميد وكيف تقدر عدد النسخ للبلازميد

2) ص. 80 (أي الصفحة الأخيرة من المعمل) - بعض الأفكار والاقتراحات والملاحظات والمواد المرجعية لعرض تقديمي مدته 5-10 دقائق حول الموضوع في النقطة 8 - المجموعتان 5 و 13: خصوصية مُسلسِل الحمض النووي ، نموذج الأنظمة الحيوية التطبيقية 3730.

اسمحوا لي أن أعرف ما إذا كان يمكنك مساعدتي في غضون الإطار الزمني المطلوب.
كما يرجى إعلامي إذا كانت قيمة الائتمان مقبولة.
شكرا.

© BrainMass Inc. brainmass.com 4 مارس 2021 ، 10:36 مساءً ad1c9bdddf
https://brainmass.com/biology/genetics/examining-dna-plasmid-restriction-digest-346089

المرفقات

معاينة الحل

إليك المعلومات لمساعدتك في كلا الجزأين من هذه المهمة. يحتوي مستند Word على المعلومات التي تساعدك في الإجابة عن الأسئلة 1-3 بالإضافة إلى معلومات حول Applied Biosystems 3730 Sequencer. في نهاية مستند الكلمة ، ستجد أيضًا تسلسل الحمض النووي للبلازميد ، والإدخال ، والبلازميد + الإدخال الذي تحتاجه للإجابة على السؤال 1. في النص ، أطلعك على من أين أتت هذه التسلسلات.

ملخص الحل

سيوفر لك هذا التفسير فهمًا لكيفية تحديد حجم أجزاء الحمض النووي التي سيتم إنتاجها أثناء ملخص التقييد. سوف يشرح كيفية إنشاء تسلسل الحمض النووي عند استنساخ قطعة معينة من الحمض النووي في بلازميد DNA وكيفية استخدام موقع NEBcutter وكذلك موقع NCBI للانفجار. سيناقش هذا التفسير أيضًا كيفية إعداد تفاعل إنزيم التقييد ووصف مفهوم رقم النسخ وكيف يؤثر رقم النسخ على بلازميد الحمض النووي الذي تستخدمه في استنساخ الحمض النووي. يتضمن هذا التفسير أيضًا معلومات عن تسلسل الحمض النووي ، وما هو وكيف يتم تحقيقه.


رسم الخرائط التقييدية لتخصيص البلازميد - علم الأحياء



منطق بناء خريطة تقييد دائرية

هضم أ الحمض النووي الخطي مع جزيء نوكلياز تقييد (إعادة) التي تجعل قطعة واحدة تنتج اثنين فتات. في المقابل ، فإن هضم أ دائري DNA مع أي جزيء إعادة الذي يجعل قطعًا واحدًا ينتج غير مرتبطة جزء خطي ، وكلها بالضرورة من نفس الحجم. في المثال ، ينتج كل من A & amp B جزيء دائري خطي الطول 17 كيلو بايت [أقصى اليسار]. يُظهر فحص بيانات الملخص المزدوج AB أن مواقع A & amp ؛ B موجودة 5 كيلوبايت بعيدا، بمعزل، على حد. وهكذا يتم رسم الخريطة الفريدة لـ A & amp B بسهولة [يسار ، وسط].

C يقطع الدائرة مرتين، المنتجة اثنين شظايا: هناك خريطة واحدة ممكنة [وسط ، أعلى]. يُظهر فحص بيانات الملخص المزدوج لمكيف الهواء أن A يقطع (أصغر) 7 كيلوبايت جزء C. يمكن رسم الخريطة الفريدة لـ A & amp C بسهولة [أعلى ، يمين].

Inspection of the BC double-digest data [lower middle] shows that B cuts the (larger) 10kb fragment of C . There is only one way to diagram this, and the map of B & C is easily drawn [middle, bottom] .

To integrate the AC and BC maps, recall that AB produces a 5kb fragment. Thus the B site is 5kb away from A . لو B were clockwise from A , B would cut the smaller C fragment into 1kb و 6 kb in the BC diges], which the data show is not so. لو B is counter-clockwise from A , it would cut the larger C fragment into 4kb و 6kb fragments , which matches the data [right, bottom].

The final map of ABC places A and B on either side of the C site, and all distances add up to 17kb, as expected [far right].

Circular restriction maps are important in mapping plasmid DNA و mitochondrial DNA الجزيئات. The backbone of an متدنا map is frequently the placement of single-cut site REs, as above, A second clue in متدنا from vertebrate animals is the occurrence of two SstII sites at an interval of 1.6Kb between two highly conserved regions of the larger and smaller الرنا الريباسي الجينات. These can serve to orient the restriction map to the functional map of the molecule.


  • The circular plasmid is opened with a restriction enzyme.
  • Make a fragment of DNA digested with the same restriction enzymes.
  • Ligation is performed.
  • Draw a plasmid map of the ligation product.
  • Adjust the plasmid map.

The circular plasmid is opened with one restriction enzyme.

  1. Select Cloning -> Restriction Enzyme -> Enzyme Selection… from the menu.
  2. The Enzyme Selection dialog is displayed.
  3. Select a restriction enzyme. Check BamHI as an example here.
  4. Click "Show Recognition Site. ".
  5. The Recognition Site dialog is displayed.
  6. The number of recognition sites for the restriction enzyme BamHI is displayed in the left pane.
  7. Check the BamHI check box.
  8. The BamHI recognition sequence, cleavage site, base position, etc. are displayed in the right pane.
  9. Check the cutting site in the right pane (multiple selections are possible) to digest and cut at this site.
  10. The location is displayed in the sequence lane and feature lane of the main feature map .
  11. Click Digestion. A confirmation message is displayed.
  12. Click Yes (y).
  13. The Digestion List dialog is displayed.
  14. Check the digested fragments in the Digestion List (multiple specifications are possible).
  15. Click Load.
  16. A confirmation message is displayed.
  17. انقر فوق موافق.
  18. The digested fragments are loaded in the main directory.
  19. The circular plasmid has been opened to give a linear plasmid.
  20. Close the Digestion List.
  21. Close the Recognition Site dialog.

Next, create the DNA fragment that will be inserted into the plasmid.

  1. Load the genomic sequence to obtain DNA fragment.
  2. As an example, load Bsub_50kb.gbk.
  3. Like the plasmid, it is digested with the restriction enzyme BamHI. Bsub_50kb.gbk has 6 BamHI recognition sites.
  4. The procedure is the same as that for opening the plasmid.
  5. Click Select All .
  6. All recognition sites will be checked.
  7. Click Digestion.
  8. A confirmation message is displayed.
  9. Click Yes.
  10. The Digestion List dialog is displayed. Click Select All .
  11. Click Load.
  12. A confirmation message is displayed.
  13. انقر فوق موافق.
  14. All linear digests are loaded in the main directory.

Next, ligation of the opened plasmid and the genomic digestion fragment is performed.

  1. Select the opened plasmid.
  2. The feature map is displayed.
  3. Click Cloning -> Ligation -> Simple Ligation from the menu.
  4. The Ligation dialog is displayed, showing a list of fragments that can be ligated.
  5. Turn on the 1st radio button of pColdV-BamHI-1.gbk.
  6. Turn on one of the 2nd radio buttons in Bsub_50kb-BamHI-n.gbk. Click Ligation.
  7. A confirmation message is displayed.
  8. Click Yes.
  9. The Ligation List dialog is displayed.
  10. Click Select All.
  11. Click Load.
  12. A confirmation message is displayed.
  13. انقر فوق موافق.
  14. The four ligation product sequences are loaded in the main directory.
  15. Close the Ligation List.
  16. Close the Ligation dialog.
  17. Click on one of the Ligation product sequences to display it in the feature map .

Draw the plasmid map of the inserted plasmid.

  1. Click Window -> Plasmid Map Viewer… from the menu.
  2. A confirmation message is displayed.
  3. Click Yes.
  4. The Select Insert DNA dialog is displayed.
  5. Select the inserted fragment.
  6. The plasmid map drawing dialog is displayed.
  7. Turn on "Plasmid + Insert".
  8. Click Add in the Insert DNA column.
  9. The Plasmid Map Lane Style Setting dialog is displayed.
  10. Select the feature key to display.
  11. For this example, select CDS .
  12. Click Set.
  13. Click Draw.
  14. On the canvas on the right, the plasmid map with the insert blown out is displayed.

How to adjust drawing of plasmid map

If the insert display area extends above the canvas

Increase the page size or make it vertical.

  1. Click Page Setup…
  2. The page setup dialog is displayed.
  3. Set the print orientation to "portrait". Alternatively, increase the paper size.

Reduce the radius of the annular area.

  1. Change Diameter of Circle to a smaller value.
  2. Click Draw.


شاهد الفيديو: Digitizing using ArcGIS Basemaps رسم الخرائط بإستعمال خريطة أساس من الانترنت (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Aristaeus

    هل أنت جاد؟

  2. Karg

    لقد ضربت المكان.هناك شيء ما في هذا وأعتقد أن هذه فكرة جيدة جدًا. اتفق معك تماما.

  3. Hand

    في رأيي ، إنه سؤال مثير للاهتمام ، سأشارك في المناقشة.



اكتب رسالة