معلومة

إصلاح شقوق ناقل الاستنساخ المهضومة بفوسفاتيز القطب الجنوبي والمربوطة بإنزيم T4

إصلاح شقوق ناقل الاستنساخ المهضومة بفوسفاتيز القطب الجنوبي والمربوطة بإنزيم T4



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

المنتج المتجه الذي تم الحصول عليه عن طريق الربط بين ناقل تم هضمه سابقًا بفوسفاتيز القطب الجنوبي يفتقر إلى 5 مجموعات فوسفات. يمكن أن يقوم T4 ligase بربطه بإدراج مع نهايات لزجة تكميلية والتي توفر مجموعتين من الفوسفات. ولكن لا تزال هناك نقطتان في منتج المتجه! كيف يتم إصلاحها عادة؟


لا يتم إصلاح النكات أثناء التحضير. بدلاً من ذلك ، يتم تحويل المتجه (وهو دائري ، على الرغم من النكات) إلى المضيف حيث يتم إصلاحه بآليات داخلية ، على الأرجح من خلال الاستئصال الأساسي.


التكنولوجيا الحيوية الجزيئية ، الفصل الثالث

إنها نوكليازات مقيدة يمكنها قطع جزيئات الحمض النووي في مواقع محددة تسمى مواقع التعرف. تحتوي مواقع التعرف على تسلسلات DNA PALINDROMIC ويتراوح طولها بين 4 إلى 8 نقاط أساس.

إن أهم أساس لتقنية الحمض النووي المؤتلف هو وجود نوكليازات مقيدة. تشق إنزيمات التقييد جزيئات الحمض النووي الكبيرة إلى أجزاء أصغر يمكن التحكم فيها. هذا مطلوب للتلاعب بجزء الحمض النووي وفي تجارب استنساخ الجينات. أيضًا ، فإن شق الحمض النووي بواسطة إنزيمات التقييد محدد للغاية. لذلك ، تساعد نوكليازات التقييد في قطع عينة الحمض النووي بطريقة قابلة للتكاثر.

البلازميد pCEL1 عبارة عن بلازميد دائري مزدوج الشريطة ويتم معالجته باستخدام إنزيمات تقييدية واحدة تلو الأخرى وفي مجموعات. العصابات التي تم الحصول عليها في أزواج أساسية:

لذا فإن حجم البلازميد pCEL1 هو 6 أزواج كيلوباز قبل الميلاد ، وهو ينتج عنه جزء واحد بطول 6.0 كيلو بايت عند الهضم مع EcoRI و BamHI و HindIII. كما أن لديها موقع التعرف الفردي على هذه الإنزيمات الثلاثة. لديها ثلاثة مواقع لـ HaeII

حجم البلازميد - & gt 4.361 bp
له جينان يعطيان مقاومة الأمبيسيلين والتتراسيكلين. يشار إليها باسم جينات Amp ^ r و Tet ^ r.

يحتوي جين Tet ^ r على مواقع فريدة للتعرف على BamHI و SaII و HindII. يحتوي جين amp ^ r على موقع PstI فريد ، وهناك جين EcoRI فريد خارج الحمض النووي المشفر

له أصل التكرار لتكرار الحمض النووي الذي يعمل في الإشريكية القولونية

يتم الاحتفاظ به باعتباره بلازميد ذو عدد نسخ مرتفع يتضمن خلية الإشريكية القولونية.

يتم الآن دمج الحمض النووي المستهدف مع DNA البلازميد وربطه باستخدام إنزيم T4 DNA ligase و ATP. ينتج عن هذا مزيج من البلازميدات المؤتلفة التي تحتوي على الحمض النووي المستهدف والبلازميدات غير المؤتلفة التي تنشأ بسبب الارتباط الذاتي للحمض النووي البلازميدي. ثم يتم تحويل هذه البلازميدات إلى خلايا الإشريكية القولونية المضيفة.

يتم تحديد الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي المستنسخ عن طريق فحص الخلايا المتحولة لاثنين من علامات مقاومة المضادات الحيوية الموجودة على البلازميد.

مباشرة بعد التحول ، يتم تحضين الخلايا في وسط خالٍ من abx للسماح للخلايا بالنمو والتعبير عن جينات مقاومة abx. ثم يتم زراعة الخلايا في abx الذي يكون جين المقاومة في البلازميد سليمًا.
على سبيل المثال ، إذا تم إدخال الحمض النووي المستهدف في موقع BamHI لجين Tet ^ r ، فإن الخلايا تنمو أولاً في وسط يحتوي على الأمبيلسين (جين المقاومة في البلازميد سليم) الخلايا التي لم تتحول لا تعيش في هذه الوسيلة. تنمو الخلايا المحولة مع الحمض النووي المستهدف وبدونه على هذا الوسط

يؤدي إدخال الحمض النووي المستهدف إلى موقع BamHI إلى تعطيل جين Tet ^ r والخلية التي تحتوي على هذا البلازميد لم تعد مقاومة للتتراسيكلين. إنه مقاوم للأمبيسيلين فقط. إذا كان البلازميد لا يحتوي على إدراج DNA ، فإنه يحتوي على جين Tet ^ r سليم ومقاوم لكل من المضادات الحيوية.

لذلك في الخطوة التالية ، نمت الخلايا على وسط الأمبيسيلين وهي مطلية على وسيط مع التتراسيكلين عن طريق تعليم المواضع النسبية للمستعمرات.
فقط الخلايا التي تحتوي على جين Tet ^ r السليم وهو البلازميدات ذاتية الارتباط تنمو على هذا الوسط.

الحجم - & GT 2،686 نقطة أساس
لديها جين يعطي مقاومة للأمبيسيلين abx. يشار إليها باسم الجين amp ^ r.

يحتوي أيضًا على منطقة من جين B-galactosidase (lacZ) التي تعد جزءًا من أوبرا اللاكتوز في بكتريا قولونية. هذا تحت سيطرة مروج lac الذي يمكن تنظيمه. الجين lacI موجود أيضًا وينتج البروتين المثبط الذي يساعد في تنظيم جين lacZ

له أصل استنساخ من pBR322 البلازميد لتكرار الحمض النووي الذي يعمل في بكتريا قولونية.

يحتوي على جزء قصير من الحمض النووي يسمى موقع الاستنساخ المتعدد أو الوصلة المتعددة. هذا يحتوي على # من مواقع الاستنساخ الفريدة التي تم تجميعها معًا. على سبيل المثال ، EcoRI و BamHI و HincII و PstI و SacI وغيرها هي بعض المواقع الموجودة في موقع الاستنساخ المتعدد. هذا موجود في جين lacZ ولا يؤثر على إنتاج الإنزيم

يتم الآن دمج الحمض النووي المستهدف مع DNA البلازميد وربطه باستخدام إنزيم T4 DNA ligase و ATP

ينتج عن هذا خليط من البلازميدات المؤتلفة التي تحتوي على الحمض النووي المستهدف والبلازميدات غير المؤتلفة التي تنشأ بسبب الارتباط الذاتي للحمض النووي البلازميدي. ثم يتم تحويل هذه البلازميدات إلى خلايا الإشريكية القولونية المضيفة.

يجب أن تكون الخلايا المضيفة قادرة على إنتاج الجزء الآخر من B-galactosidase المسمى LacZa. يتحد هذا مع جزء من الإنزيم الذي ينتجه جين lacZ ويشكل إنزيمًا نشطًا.

يتم استخدام وسيط يحتوي على الأمبيسلين و IPTG و X-Gal لتنمية الخلايا المضيفة المعالجة. يعمل IPTG كمحفز لأوبرون lac ويعمل X-Gal ركيزة لـ B-galactosidase. عند التحلل المائي ، ينتج X-Gal مركبًا أزرق اللون. يضمن وجود الأمبيسلين أن الخلايا غير المتحولة لا تنمو على الوسط

الخلايا التي تحولت مع البلازميدات ذاتية الارتباط تنتج إنزيم B-galactosidase النشط وتتحلل X-Gal لتنتج مستعمرات زرقاء اللون. الخلايا التي تم تحويلها مع البلازميد المؤتلف لن تنتج الإنزيم النشط وتنتج مستعمرات بيضاء اللون. هذا لأن الحمض النووي المستهدف الذي يتم إدخاله في موقع الاستنساخ المتعدد يعطل جين lacZ وبالتالي لا يتم إنتاج الإنزيم النشط


مخازن رد الفعل

  • يجب إذابة T4 DNA Ligase Buffer (NEB # B0202) على المقعد أو في راحة يدك ، وليس عند 37 درجة مئوية (لمنع انهيار ATP).
  • بمجرد الذوبان ، يجب وضع T4 DNA Ligase Buffer على الجليد.
  • يمكن إجراء عمليات الربط في أي من المحفزات المعيارية للنويدات الداخلية NEBuffers المعيارية الأربعة أو في T4 Polynucleotide Kinase Buffer (NEB # B0201) إذا تم استكمالها بـ 1 ملي مولار من ATP.
  • عند التكميل بـ ATP ، استخدم ribo ATP (NEB # P0756). لن يعمل Deoxyribo ATP.
  • قبل الربط ، قم بتعطيل إنزيم التقييد تمامًا عن طريق تعطيل الحرارة ، أو عمود الدوران (NEB # T1030) ، أو تنقية الفينول / EtOH.
  • تثبيط الحرارة (فوسفاتاز أنتاركتيكا ، سريع CiP ، rSAP) قبل الربط.
  • حافظ على تركيز الحمض النووي الكلي بين 1-10 ميكروغرام / مل.
  • المتجه: إدراج النسب المولية بين 1: 1 و 1:10 هي الأمثل لعمليات الإدراج الفردية (حتى 1:20 للمحولات القصيرة). إدراج: يجب أن تكون نسبة الضرس المتجه 6: 1 لتعزيز عمليات الإدراج المتعددة. استخدم NEBioCalculator لحساب النسب المولية.
  • لاستنساخ أكثر من إدخال واحد ، نوصي NEBuilder & reg HiFi DNA Assembly Products.
  • إذا لم تكن متأكدًا من تركيز الحمض النووي الخاص بك ، فقم بإجراء عمليات ربط متعددة بنسب متفاوتة.

استنساخ ثانوي

الاستنساخ الفرعي هو عملية نقل إدخال الحمض النووي من ناقل إلى آخر عن طريق تحضير إدراج الحمض النووي والمتجه الجديد بشكل منفصل ، وربطهما معًا ، وفحص استنساخ الخليط الناتج لتحديد الاستنساخ الفرعي المطلوب.

يتم إجراء الاستنساخ الفرعي لأن المتجه الجديد أو الترتيب الجديد لإدخال DNA (s) في الاستنساخ الفرعي المخطط له يقدم بعض المزايا على المتجه أو الترتيب القديم.

على الرغم من وجود العديد من المزايا المحتملة مثل وجود ناقلات وهناك المئات إن لم يكن الآلاف من النواقل المختلفة. ومع ذلك ، هناك بعض المواضيع المشتركة. أحدهما هو أن ناقل الاستنساخ الأمثل ، ملثمة لامدا ، ليس مثاليًا لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي بسهولة لاستخدامه في أغراض أخرى ، مثل عزل الشظايا للاستنساخ الفرعي. لحل هذه المشكلة ، عادةً ما يتم استنساخ الحمض النووي المستنسخ حديثًا من مكتبة لامدا على الفور في ناقل بلازميد ، والذي يوفر إنتاجية أكبر بكثير من الحمض النووي بسهولة أكبر بكثير من فجوة لامدا.

في حالة نموذجية ، يتم عزل cDNA (DNA التكميلي) لجين معين عن طريق استنساخ فج واحد مؤتلف (فيروس بكتيري) من مكتبة phage cDNA المؤتلفة. تحتوي العاثية على جينوم DNA كبير جدًا وتمثل cDNA المستنسخة 2 إلى 5 ٪ فقط منها. بعد يوم من العمل ، يمكن للمرء أن يعزل ربما 25 ميكروغرامًا من DNA phage ، والتي تحتوي فقط على 0.5 إلى 1 ميكروغرام من cDNA. استنساخه إلى متجه آخر للاستنساخ الفرعي للأغراض العامة أولاً ، ببساطة للسماح بصنع المزيد منه بسهولة. من خلال بناء متجه الاستنساخ الفرعي هذا ، من السهل تكوين كميات متعددة من المليغرام من الحمض النووي الريبي في وقت قصير.

سبب آخر للاستنساخ الفرعي هو وضع الحمض النووي موضع الاهتمام في سياق جديد للتعبير عنه كـ RNA و / أو بروتين. عادة ، يتطلب التعبير محفزًا ومُنهيًا لبدء وإيقاف تخليق الرنا المرسال والمكونات اللازمة للترجمة: موقع ربط الريبوسوم وإطار قراءة مفتوح يبدأ بكودون البداية (ATG) وينتهي بكودون الإيقاف. عادةً ما توفر المتجهات المصممة للتعبير الجيني كل شيء باستثناء إطار القراءة المفتوح. لا تحتوي نواقل الاستنساخ النموذجية (عادةً الملتهمة) وناقلات الاستنساخ الفرعي للأغراض العامة النموذجية (البلازميدات) على كل هذه العناصر. تختلف عناصر التعبير اختلافًا كبيرًا ولا تتوافق بين أنواع الكائنات التي يكون التعبير فيها مطلوبًا: البكتيريا ، والخميرة ، وخلايا الحشرات ، وخلايا الحيوانات الفقارية ، والخلايا النباتية ، لذلك يجب استخدام ناقل مختلف لكل منها.

أخيرًا ، للحصول على تغيير محدد في الحمض النووي ، يتم معالجته إنزيميًا (بالكامل في المختبر - في أنبوب الاختبار). يمكن القيام بذلك لإنتاج اندماج قطعتين من الحمض النووي ، أو حذف بعض الحمض النووي ، أو حدوث طفرات (تغييرات في تسلسل الحمض النووي). عادة ، تنتج هذه التلاعبات الأنزيمية الحمض النووي المطلوب بكميات صغيرة جدًا وغالبًا ما تكون غير معروفة وغير قابلة للكشف. لكي تكون مفيدة ، يجب استنساخ الحمض النووي الناتج (المرغوب فيه) وتضخيمه في البكتيريا.

تفاعل البوليميراز المتسلسل واستخدامه في الاستنساخ الفرعي

يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لإعداد الحمض النووي ذي الأهمية للربط في استنساخ فرعي أو لعمليات أخرى في المختبر مثل تسلسل الحمض النووي أو رسم خرائط التقييد. ومع ذلك ، عند استخدامه تحضيريًا مثل هذا ، يمكن أن يؤدي تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) إلى حدوث مشكلات. تتمثل إحدى المشكلات في أن تفاعل البوليميراز المتسلسل ينتج كمية صغيرة إلى حد ما من الحمض النووي ، مع تناقص العائد كلما زاد طول الحمض النووي. لا يعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل جيد على الإطلاق مع الحمض النووي الذي يزيد عن 1000 زوج قاعدي ، ومعظم cDNAs أكبر من ذلك. أيضًا ، يُدخل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الطفرات بشكل عشوائي بمعدل واحد لكل 2 أو 3 أزواج من قاعدة كيلو ، لذلك يمكن إجراء أي استنساخ فرعي ناتج (أو تسلسل الحمض النووي أو رسم الخرائط) بدءًا من خليط معقد من الحمض النووي المضخم. أيضًا ، يتلوث الحمض النووي المضخم لـ PCR بشدة بواسطة بادئات الحمض النووي القصيرة المفردة التي تقطعت بها السبل والتي تتداخل مع المعالجة اللازمة لاستنساخ الحمض النووي المصنوع بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. يجب إزالة هذه البادئات قبل أي معالجة ، وهذه خطوة إضافية ليس من السهل إنجازها دون فقد قدر كبير من منتج PCR المطلوب. أيضًا ، من الأفضل استنساخ الحمض النووي الناتج عن تضخيم PCR ، وهو خطي ، إذا تم قطع نهاياته بواحد أو اثنين من إنزيمات التقييد ، ومع ذلك فإن العديد من إنزيمات التقييد لا تقطع الحمض النووي المضخم لـ PCR بالقرب من نهاياته ما لم يتم تحسين الظروف بشكل خاص. لجعل الأمور أسوأ ، على عكس المدخلات المقطوعة من البلازميدات ، لا يمكن للمرء أن يعرف من خلال تحليل هلام الاغاروز ما إذا كانت نهايات الحمض النووي المضخم PCR قد تم قطعها بواسطة إنزيمات التقييد ، لذا فإن الفشل في القطع يظهر على أنه فشل استنساخ فرعي فقط بعد عدة أيام إضافية مجهود.

تسمح طرق PCR المتقدمة بربط الحمض النووي المتضخم بوساطة PCR في المتجه باستخدام بادئات PCR التي تصلب كل من تسلسل الاهتمام والحمض النووي المتجه. على الرغم من أن هذا يتطلب مواد أولية أطول ، إلا أن تكلفة تصنيع البادئات قد انخفضت بشكل كبير في السنوات الأخيرة بحيث أصبحت البادئات الأطول في المتناول. مشكلة انخفاض العائد ليست مهمة مع هذه الطرق لأن الإدخال بوساطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لا يتطلب استخدام ليجاز الحمض النووي ويمكن للبكتيريا أن تضخم حتى الكميات الصغيرة المتلاشية من منتج DNA الدائري من هذه الطريقة. المشكلة الرئيسية المتبقية هي معدل الخطأ المرتفع لبوليميراز الحمض النووي عالي الحرارة المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل.

منهجية الاستنساخ الفرعي التقليدية (الختان - الربط)

تحضير إدراج الحمض النووي

يمكن الحصول على "إدخال" الحمض النووي ، وهو الحمض النووي الذي سيتم وضعه في ناقل جديد عن طريق الاستنساخ الفرعي ، من بلازميد آخر ، أو من دنا العاثيات ، أو من الحمض النووي الجيني ، أو من cDNA المصنوع عن طريق النسخ العكسي ، أو من أي من هذه الحمض النووي الذي يحتوي على تم تضخيمه بواسطة PCR (تفاعل البلمرة المتسلسل). أيضًا ، يمكن استخدام الحمض النووي الاصطناعي كإدراج. ومع ذلك ، انظر القسم أعلاه الذي يصف عيوب تحضير الحمض النووي لاستخدامه في الاستنساخ الفرعي عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. في الشكل الأكثر تقليدية للاستنساخ الفرعي ، يتم استئصال الحمض النووي المراد استنساخه من استنساخ DNA آخر أو استنساخ فرعي باستخدام هضم نوكلياز مقيد.

تقليديًا ، يجب عزل الحمض النووي المُدخَل من مصدره DNA (عادةً لاقمات أو بلازميد) عن طريق الهضم المقيد ، عن قطع الحمض النووي الأخرى الناتجة عن تفاعل الهضم. يتم فصل شظايا الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. يتم بعد ذلك قطع نطاق الحمض النووي ذي الأهمية من الجل بشفرة حلاقة ويتم استخراج الحمض النووي الموجود في قطعة الاغاروز بإحدى الطرق المتنوعة. تزيل هذه الطرق شظايا الاغاروز التي تتداخل مع خطوة الربط اللاحقة.

بالنسبة إلى الاستنساخ الفرعي ، يعتمد اختيار كيفية قطع الحمض النووي المُدرج من سياق الحمض النووي السابق (الأولي) على مواقع إنزيمات التقييد المتاحة لهذا الغرض ، وفي أي مكان آخر تقطع هذه الإنزيمات الحمض النووي المتضمن وناقله الداخلي. من المستحسن أن يكون لديك الإنزيمات التي تقطع الحمض النووي المُدرج غير المقطوعة داخل الحمض النووي المُدخَل وأن تترك تراكبًا واحدًا قصيرًا متراكمًا والذي سيكون متوافقًا مع البروز الناتج عند فتح ناقل الحمض النووي (انظر أدناه). إذا أمكن ، يجب استخدام إنزيمين مختلفين لقطع الحمض النووي المُدرج (واحد على كل طرف) ، لأن ذلك يسمح "بالاستنساخ الفرعي الاتجاهي" (انظر أدناه). في بعض الحالات ، قد لا يكون من الممكن تجنب القطع بإنزيم يقطع أيضًا داخل الحمض النووي المُدخَل. في مثل هذه الحالات ، يتم إجراء هضم التقييد الجزئي لإنتاج جزء الحمض النووي المطلوب. يتم ذلك عن طريق قطع متجه البداية بإدخال في تفاعل لا يكتمل ، لذلك يتم قطع بعض مواقع الحمض النووي فقط. نظرًا لأن الإنزيم يقطع المواقع في كل جزيء بشكل عشوائي ، يتم إنتاج جميع منتجات الهضم الجزئي الممكنة ، بما في ذلك بعض أجزاء الحمض النووي التي تحتوي على مواقع تقييد داخلية غير مقطوعة. في بعض الحالات ، يجب استخدام إنزيم تقييد "غير حاد الطرف" لقطع أحد طرفي الحمض النووي المُدخَل أو كلاهما. في هذه الحالات ، يكون الاستنساخ الفرعي أكثر صعوبة لأنه لا توجد "نهايات لزجة" (بروزات) لمساعدة الحمض النووي على الانضمام بواسطة DNA ligase. على الرغم من أن عمليات الربط هذه ممكنة ، إلا أنها أقل كفاءة إلى حد ما (عدد أقل من الإيجابيات من النسائل الفرعية الناتجة) من تلك التي تحتوي على شظايا متدلية على كلا الطرفين. نظرًا لأن نهايات إدخال الحمض النووي المحضر يجب أن تكون قادرة على الربط مع النهايات المعدة للحمض النووي المتجه ، فقد يكون ذلك على الرغم من إمكانية إنتاج البروزات المتراكمة على كل منها ، فقد لا تكون قادرة على توليد نفس الإنزيمات بسبب عدم وجود تسلسلات التعرف المتاحة و / أو المفيدة. في بعض الحالات ، يمكن أن تنتج الإنزيمات ذات تسلسلات التعرف المختلفة بروزات متوافقة (مثل BamHI و BglII أو NcoI و SalI). خلاف ذلك ، يمكن تحويل الأجزاء المتدلية إلى نهايات حادة عن طريق التشذيب أو ملء النهاية المجوفة ببوليميراز الحمض النووي.

ناقل الحمض النووي

نظرًا لأن الهدف من الاستنساخ الفرعي هو إنشاء بنية DNA جديدة (ناقل + إدخال) تحتوي على إدخال DNA ، فسيتم ربط جزء الحمض النووي المُدرج في موقع على الحمض النووي المتجه المرغوب (عادةً ما يكون بلازميد). لتحضير ناقل الحمض النووي لهذا الربط ، يجب قطعه (فتحه) في الموقع الذي ترغب في ربطه. على عكس إدخال الحمض النووي ، عادةً ما تكون عمليات الهضم الجزئية غير مجدية مع النواقل ويجب أن يتكون موقع الإدخال من موقع أو موقعين من مواقع إنزيم التقييد الفريدين في المكان المناسب على المتجه بالنسبة للتسلسلات المطلوبة للتعبير أو الوظيفة البيولوجية الأخرى (إن وجدت) وذات الصلة بـ بعضهم البعض. إن وجود أو عدم وجود مواقع التقييد المناسبة في إدخال الحمض النووي والناقل يقيد بشدة عملية الاستنساخ الفرعي وعندما تكون هذه القيود مقيدة للغاية ، يجب في كثير من الأحيان بذل جهد كبير للعمل حولها. في بعض الأحيان ، عندما لا يكون موقع معين موجودًا في إدخال الحمض النووي ، يمكن استنساخ الحمض النووي المُدخل أولاً في موقع استنساخ متعدد لبلازميد آخر ، ثم يمكن قصه بالأنزيمات اللازمة للاستنساخ الفرعي في ناقل الهدف الحقيقي. بدلاً من ذلك ، يمكن تغيير مواقع إنزيم التقييد في ناقل عن طريق فتح المتجه والربط مع "محولات" أو "روابط" DNA الاصطناعية الفتحة التي تقدم موقع نوكلياز داخلي جديد. أخيرًا ، يمكن إضافة موقع تقييد إلى إدخال DNA حيث لم يكن هناك أي شيء من قبل باستخدام الطفرات الخاصة بالموقع ، وهي منهجية مميزة في الغالب.

من الناحية العملية ، لإعداد الحمض النووي المتجه ، غالبًا ما يكون كافيًا قطعه ببساطة باستخدام واحد أو اثنين من الإنزيمات اللازمة لفتح موقع الاستنساخ الفرعي ثم لإفساد أو إزالة إنزيمات التقييد بطريقة أخرى لأنها ستتداخل مع الربط اللاحق. ومع ذلك ، لعدة أسباب ، غالبًا ما يكون من المرغوب فيه تنقية الحمض النووي المتجه الخطي (المقطوع) بالهلام عن طريق الفصل على هلام agarose وعزل الحمض النووي عن الهلام عن طريق قطع قطعة من agarose كما تم وصفه أعلاه لإدخال DNA. بالنسبة إلى نواقل الحمض النووي الخطية مثل لامدا ومشتقاتها ، يتم عزل كل "ذراع" من ناقل الحمض النووي على هيئة أجزاء مميزة من الحمض النووي. أحد أسباب تنقية الهلام لجزء (أجزاء) الحمض النووي المتجه لاستخدامه في الاستنساخ الفرعي هو أن هذا يلغي الحاجة إلى استخدام ناقل DNA عالي النقاء (أي فوق تدرج كثافة CsCl). ثانيًا ، عند إزالتها عن طريق تنقية الهلام ، لا توجد فرصة لإعادة ربط "جزء الحشو" (قطعة من الحمض النووي بين موقعي التقييد على الناقل) في المتجه أثناء الاستنساخ الفرعي. ثالثًا ، قد لا يتم قطع المتجه مفتوحًا تمامًا ، ويميل أي ناقل متجه غير مقطوع إلى التداخل بقوة مع الفحص اللاحق للنسخ الفرعية. يمكن عادةً إزالة المتجه الأصلي غير المقطوع بسهولة عن طريق تنقية الهلام لكل من النواقل الخطية (بسبب اختلافات الحجم) وتنقية نواقل البلازميد ، نظرًا لأن DNA البلازميد الدائري والفائق الالتفاف يهاجر بشكل مختلف في هلام عن جزء الحمض النووي الخطي. بشكل عام ، من الأفضل دائمًا تنقية الحمض النووي المتجه بالهلام لأنه يوفر مزيدًا من المتانة (احتمال أقل للفشل). نظرًا لأن الحمض النووي المُدرج عادةً ما يتم تنقيته بالهلام ، يمكن عمل الناقل في نفس الوقت بدون تكلفة عمالة إضافية تقريبًا.

استنساخ فرعي اتجاهي

في معظم الحالات ، من المهم أن يتم استنساخ الحمض النووي المُدرج جزئيًا بحيث يكون في اتجاه واحد صحيح في موقع الناقل ، عادةً للتعبير مثل RNA و / أو بروتين. إذا تم قطع المتجه مفتوحًا باستخدام إنزيم تقييد واحد وكان للحمض النووي المُدخل نفس الأجزاء المتدلية على كلا الطرفين ، فمن الممكن ربط الحمض النووي المُدرج في موقع المتجه في أي من اتجاهين. إذا تم ذلك ، يجب فحص النُسخ الفرعية ليس فقط لوجودها في الحمض النووي المُدرج ولكن أيضًا من أجل اتجاه الإدخال بالنسبة إلى المتجه. تخضع عمليات الربط هذه "ذات النهايات المتشابهة" أيضًا لإعادة ربط الناقل في حالة عدم وجود أي إدخال DNA ، مما ينتج عنه "خلفية" عالية من النسائل الفرعية المرشحة التي يتم إدخالها سالبة. يمكن القضاء على كلتا هاتين المشكلتين إذا تم استخدام إنزيمين مختلفين للتقييد لفتح الناقل وتحضير إدخال الحمض النووي. ولكي يعمل هذا بشكل صحيح ، يجب أن يترك الإنزيمان "فروقًا" غير متوافقة للحمض النووي حتى لا ترتبط بالطرف الآخر. هذا يحد من ربط الإدخال في المتجه للحالات التي يتم فيها توجيه الإدخال بالطريقة المرغوبة. وهذا ما يسمى "الاستنساخ الفرعي الاتجاهي". مثل كل الأشياء الجيدة ، فإنه يقدم مشكلة جديدة واحدة على الأقل. أثناء قطع الحشوة من ناقلها السابق باستخدام إنزيمين مقيدين مختلفين ، من السهل معرفة ما إذا كان الجل التحضيري للجزء قد وصل إلى المستوى المطلوب من الإكمال من خلال وجود جزء إدخال DNA المطلوب ، وهذا ليس عادةً صحيح لمضاعفة القطع المتجه الجديد. أثناء قطع الحمض النووي المتجه الجديد بإنزيمين ، تكون المواقع عادةً قريبة جدًا من بعضها البعض (في "تسلسل الاستنساخ المتعدد" أو MCS) بحيث لا يمكن تحديد ما إذا كان كلا الإنزيمين أو أحدهما فقط يقطع الناقل. إذا تم قطع أحد الإنزيمين بشكل غير فعال ، فسيكون للربط خلفية عالية ومردود منخفض نسبيًا للنسخة الفرعية المرغوبة. ومما زاد الطين بلة ، أن العديد من إنزيمات التقييد لا تقطع جيدًا بالقرب من نهاية جزء الحمض النووي ، لذلك غالبًا ما يؤدي القطع بأحدها إلى تثبيط تفاعل الآخر. أيضًا ، إذا كان أحد الإنزيمات المستخدمة عبارة عن قاطع غير حاد ، فإن تقليل كفاءة الربط يكون كبيرًا جدًا بحيث يكون من الأفضل عادةً التمسك بربط "متشابه" (موقع إنزيم واحد) مع إنزيم يترك مساحة متراكمة ، ويفحص ببساطة النسخ الفرعية للتوجيه لاحقًا.

تقليل خلفية عمليات الربط المتشابهة عن طريق إزالة 5 'فوسفات في نهايات ناقل الحمض النووي

تم فتح الحمض النووي المتجه في نوع ربط "متشابه" من الاستنساخ الفرعي عن طريق القطع باستخدام إنزيم تقييد واحد. هذا يعني أن نهايات ناقل الحمض النووي يمكن أن تتحلل وترتبط بدون إدخال الحمض النووي أثناء تفاعل الربط. وذلك لأن نهايات الحمض النووي المقطوع بإنزيم التقييد يمكن دائمًا إعادة التصلب وربطها معًا ، مما يؤدي بشكل أساسي إلى عكس عمل إنزيم التقييد. ليس فقط أنه من الممكن للناقل أن يعيد الارتباط بنفسه ، فهذا التفاعل أحادي الجزيء مفضل بقوة على التفاعل ثنائي الجزيء الذي يتضمن جزيء ناقل مع جزيء إدخال DNA. ومع ذلك ، فإن إعادة ربط المتجه بدون إدخال لا ينتج النسخة الفرعية المرغوبة ، وكذلك منتج تفاعل جانبي غير مرغوب فيه. يؤثر هذا التفاعل الجانبي سلبًا على عملية الاستنساخ الفرعي بطريقتين. أولاً ، يستهلك المتجه بحيث يكون القليل منه متاحًا للتصلب مع الحمض النووي المُدرج وربطه. ثانيًا ، يتسبب في خلفية أكبر من المستعمرات السالبة المدرجة في الاستنساخ الفرعي ، مما يقلل من جزء النسائل الفرعية الموجبة (الكفاءة) ويحتمل أن يزيد عدد النسائل الفرعية التي ستحتاج إلى فحصها للحصول على البنية المرغوبة.

هناك طريقة تقلل من إمكانية إعادة ربط الناقل دون أي إدخال DNA. تتضمن هذه الطريقة معالجة ناقل الحمض النووي باستخدام الفوسفاتيز الذي يزيل الفوسفات المتبقي على كل 5 بوصات من قطع الحمض النووي. بدون الفوسفات على الطرف 5 ، لا يمكن ربط النهايتين 5 و 3 من خيوط النواقل بواسطة DNA ligase (الأمر الذي يتطلب نهاية 5 'تحتوي على فوسفات). نظرًا لأنه لا يمكن إعادة ربط أي من خيطي الحمض النووي المتجه مع الطرف الآخر ، فلا يمكن إعادة تدوير المتجه بدون إدخال. إذا كان الإدخال موجودًا ويصلب مع نهايات المتجه ، فيمكن أن يربط DNA ligase أحد الخيطين (واحد مع نهاية 5 'من إدخال DNA ونهاية 3' من ناقل DNA) ، ولكن ليس الآخر واحد. نظرًا لأن إدخال الحمض النووي عادة ما يكون طويلًا جدًا ، فهناك الكثير من اقتران قاعدة الحمض النووي بين فواصل الجدائل المفردة ("النكات") المتبقية بعد اكتمال ربط الإدخال مع ناقل الفوسفات. لذلك ، على الرغم من أن الحمض النووي ليس مرتبطًا بشكل كامل (كلا الخيطين بهما كسر) ، فإن الحمض النووي يظهر للبكتيريا كما لو كان مرتبطًا بالكامل لأغراض امتصاصه من قبل البكتيريا. بمجرد دخول الخلايا ، يتم إصلاح فواصل الخيط المفرد من خلال عمليات إصلاح الحمض النووي العادية.

ربط وتحويل وتصفيح المستعمرات

تتطلب عمليات الربط فقط إنزيمًا (T4 DNA ligase) ، ومخزنًا مؤقتًا (بما في ذلك المغنيسيوم و ATP اللازمين) والناقل وإدخال شظايا الحمض النووي. بعد احتضانها معًا ، يتم وضع الخليط بأكمله في البكتيريا ، إما عن طريق "تحويل" البكتيريا المؤهلة عن طريق المعالجة الكيميائية أو عن طريق التثقيب الكهربائي (عمل ثقوب في البكتيريا ذات نبضة كهربائية قصيرة). ثم تزرع هذه البكتيريا على ألواح أجار تحتوي على مضاد حيوي (عادة الأمبيسلين) يمنع نمو البكتيريا التي لم تستقبل أي ناقل DNA. بعد فترة الحضانة بين عشية وضحاها ، يتم نقل بعض المستعمرات البكتيرية العديدة الموجودة على الصفائح ("النسخ الفرعية") إلى مزارع سائلة فردية وتزرع كميات صغيرة (عادةً 3 مل من المزرعة) كمعلقات لعزل DNA البلازميد ، والذي يتم فحصه بعد ذلك. عادة ما يلزم فحص من 5 إلى 10 طوائف فرعية فقط بحثًا عن أي ربط. يمكن أيضًا فحص النسخ الفرعية على الفور دون تربيتها كمزارع معلق صغير باستخدام تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل. ومع ذلك ، فإن فحص PCR عادة ما يكتشف فقط وجود بعض من إدخال الحمض النووي. (عادةً ما يستغرق الأمر وقتًا طويلاً للكشف عن كل ذلك) ، ولا يتم التحقق من u إذا كان الإدخال سليمًا. يمكن استخدامه لفحص اتجاه الإدخال (تمهيدي واحد في الملحق والآخر في المتجه) ، لكن هذا لا يكتشف إعادة الترتيب غير العادية (وغير الشائعة) التي تحدث أحيانًا أثناء عمليات الربط ، خاصة أثناء الاستنساخ الفرعي التي تحدث بكفاءة منخفضة.

نظرًا لأن عزل البلازميد والفحص يستغرق عادةً يومًا أو يومين إضافيين ، فمن المفيد للغاية تجنب القيام بذلك إذا لم يعمل الربط بشكل جيد. يتطلب مثل هذا الإنذار المبكر بعض الملاحظات المفيدة التي يجب إجراؤها في وقت ظهور المستعمرات البكتيرية على الصفائح. لسوء الحظ ، هناك طريقتان بسيطتان لا يمكن الاعتماد عليهما ولا يمكن تطبيقهما على نطاق واسع. إحدى الطرق البسيطة هي استخدام ناقل مع سلسلة A LacZ (بيتا غالاكتوزيداز) والتي تكمل نسخة قصيرة من LacZ في الخلايا وتحفز التفاعل الذي يحول المستعمرة إلى اللون الأزرق إذا تم تضمين ركيزة كروموجينية (X-Gal) في أجار لوحة. إذا كان إدخال الحمض النووي موجودًا ، فإن تسلسل سلسلة LacZ A متقطع ولا يتم تكوين نسخة وظيفية منه ولا تتحول المستعمرة إلى اللون الأزرق. لا يمكن استخدام طريقة الفرز المسبق للمستعمرات في نواقل التعبير لأن متواليات LacZ تتداخل مع التعبير عن ناقل cDNA. أيضًا ، غالبًا ما يفشل ، نظرًا لأن البكتيريا غالبًا ما تعيد ربط (إغلاق) ناقل مفتوح دون تضمين إدخال DNA ولكن في كثير من الأحيان مع طفرة صغيرة في موقع الاستنساخ الفرعي الذي يمنع سلسلة A من Lac Z من العمل (وبالتالي المستعمرات البيضاء بدون يُدرج). هذا شائع بشكل خاص مع الإدخالات غير الحادة والاستنساخ الفرعي الاتجاهي ، ولكنه يحدث بشكل متكرر حتى مع الاستنساخ الفرعي ذي النهايات المتشابهة (خاصة إذا تم معالجة الحمض النووي المتجه بالفوسفاتاز).

الطريقة الثانية البسيطة للحصول على إنذار مبكر حول فشل الربط هي مجرد عد مستعمرات النسائل الفرعية. ومع ذلك ، فإن عدد المستعمرات يختلف كثيرًا ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى اختلاف الخلفية والتهم الموجبة. ومع ذلك ، فإن أعداد المستعمرات البسيطة تكون مفيدة عند مقارنتها بالضوابط المناسبة. للقيام بذلك ، في نفس الوقت الذي يتم فيه تفاعل ربط منتظم (يتضمن ناقل وإدخال DNA) ، يتم إجراء ربط التحكم الثاني الذي يحتوي على ناقل DNA ولكن لا يتم إدخال DNA. يمكن أن تكون أعداد المستعمرات من ربط التحكم بمثابة مؤشر للخلفية. إذا أدى تفاعل الارتباط المحتوي على إدخال DNA إلى زيادة كبيرة في عدد المستعمرات مقارنة بتفاعل التحكم غير القابل للإدخال ، فمن المحتمل أن يكون الربط ناجحًا. إذا لم تكن هناك زيادة في عدد المستعمرات الناتجة عن إدراج الحمض النووي في تفاعل الربط ، فمن المحتمل أن يفشل الربط. لاحظ أن هذا التفسير يجعل الافتراض المنطقي أن المتجه لا يمكن ربطه بدون إدراج. هذا افتراض صالح للاستنساخ الفرعي الاتجاهي والارتباطات المتشابهة الأطراف التي تم فيها معالجة الناقل بالفوسفاتيز ، ولكنه غير صالح مع عمليات الربط المنتهية المماثلة التي لم تستخدم معالجة الفوسفاتيز للحمض النووي الناقل.

فحص الحيوانات المستنسخة

عادة ما يتم فحص الحمض النووي للبلازميد المعزول عن طريق هضم الإنزيم المقيد والرحلان الكهربي لهلام الاغاروز. عادةً (وإن لم يكن دائمًا) ، يتم ذلك باستخدام الإنزيم أو الإنزيمات المستخدمة لفتح المتجه وتحضير الملحق. بالنسبة لعمليات الربط المتشابهة ، عادة ما تتضمن عملية الفرز خطوتين. أولاً ، يجب إجراء الفحص للعثور على النسائل الفرعية الإيجابية لوجود إدخال الحمض النووي باستخدام الإنزيم الذي تم استخدامه لتحضير إدخال الحمض النووي والحمض النووي المتجه للربط. ثم تقوم الخطوة الثانية بتحليل تلك الإيجابية لإدخال الحمض النووي لتحديد اتجاه الإدخال في المتجه. عادة ما يتم إجراء "فحص الاتجاه" باستخدام إنزيم واحد أو اثنين من الإنزيمات التي تقطع الناقل وإدخال الحمض النووي بشكل غير متماثل للتمييز بين الاتجاهين. يمكن التنبؤ بالاتجاهين لإنتاج أنماط تأطير مختلفة من الملخص ، وتستخدم هذه لتعيين اتجاه الإدراج في كل استنساخ فرعي مرشح. في بعض الاستنساخات الفرعية ، يمكن إجراء الفرز الأول والتحري عن التوجيه من خلال خلاصة غربلة واحدة ، على الرغم من أن هذا الملخص لا يمكن إجراؤه بنفس الإنزيم الذي تم استخدامه لفتح ناقل للربط.


نقاش

في هذه الدراسة ، أظهرنا أن تكامل AT-DRS طويل في منطقة غير هشة يمكن أن يؤدي إلى تعبير موقع هش. يقدم هذا دليلًا واضحًا على الدور المباشر الذي تلعبه AT-DRS في دفع هشاشة الكروموسومات. وجدنا أيضًا أن شظايا الحمض النووي المستمدة من AT-DRS المتكاملة لديها ميل متزايد لتشكيل هياكل ثانوية مستقرة في حالة واحدة تقطعت بهم السبل مما يفسر قدرتها على اضطراب تكرار الحمض النووي مما يؤدي إلى عدم الاستقرار الجيني (20). إن الملاحظة التي تشير إلى أن نسبة كبيرة (45٪) من AT-DRSs الطويلة على طول الجينوم البشري توجد داخل مناطق كروموسومية غير مستقرة تم تحديدها وراثيًا ، مما يبرز أيضًا أن تكرار AT-dinucleotide هو عامل رئيسي يهيئ المناطق الكروموسومية للهشاشة.

كان تردد كسر الخدمة الثابتة المولدة حديثًا أقل بكثير من التردد في FRA16C الداخلي ، والذي اشتُق منه AT-DRS. يشير هذا إلى أن هناك عوامل أخرى تساهم في هشاشة FRA16C. ومن المثير للاهتمام ، أنه في FRA16C ، بالإضافة إلى AT-DRS الطويل الذي تمت دراسته هنا ، هناك ثلاثة AT-DRS طويلة (& gt400 bp) ، والتي ثبت أنها توقف تقدم شوكة النسخ تحت ظروف إجهاد النسخ (20) وربما تساهم في الهشاشة الأعلى في الموقع الداخلي. علاوة على ذلك ، تكشف بيانات توقيت النسخ (http://www.replicationdomain.com) أن منطقة FRA16C الذاتية تتكاثر لاحقًا في المرحلة S بالنسبة إلى موضع HPRT ، وبالتالي قد تزيد من صعوبة إكمال النسخ المتماثل على طول هذه المنطقة قبل الدخول في الانقسام. سيكون من المثير للاهتمام زيادة توصيف الموقع الهش الذي تم إنشاؤه حديثًا ، من خلال دراسة تأثير AT-DRS على قدرة المنطقة على إكمال النسخ المتماثل خلال المرحلة S. Recent finding showed that fragile regions fail to complete their replication during S-phase and the under-replicated sequences are subjected to repair synthesis during mitosis termed MiDAS ( 34).

The question of whether integration of CFS sequences are sufficient to recapitulate FS-like instability was previously addressed using whole BACs containing FRA3B sequences ( 39). Integration of two adjacent FRA3B BACs, 150 kb each, into a non-fragile ectopic site in human cells was able to confer FS-like instability, implying an inherent instability of these sequences. However, a specific sequence motif responsible for the observed fragility in that study could not be identified. In the present work, however, we showed that a long AT-DRS is able and sufficient to drive the formation of an FS in a non-fragile region in the studied cellular system.

A number of fragile sites are enriched with AT-DRSs that have the potential to form alternative non-B DNA secondary structures ( 10, 21, 29, 40). AT-DRSs >200 bp in length are predicted to readily form secondary structures following unwinding of the DNA double helix during replication ( 10). Under aphidicolin treatment, which leads to uncoupling between the DNA polymerase and the helicase ( 41) longer stretches of ssDNA are exposed, which may enhance the formation of stable secondary structures of the AT-DRSs. Three in vitro studies tested the replication dynamics within plasmids containing different AT-DRSs derived from FRA16D ( 21, 22) and an AT-DRS derived from FRA16B ( 40). In one study ( 21), an ∼500 bp sequence which spans a FRA16D region highly enriched with perfect AT repeats, was shown to stall replication fork progression in yeast in a manner depending on the repeat length. Mfold predictions and gel electrophoresis migration analysis of these fragments suggested that the observed replication perturbation involves secondary structure formation ( 21). This suggestion was recently reinforced by showing that this AT-DRS is targeted by the MUS81 structure-specific endonuclease which cleaves the replication forks stalled at DNA secondary structures along this region ( 42). In another study, cell-free assays showed alleviated polymerase stalling within FRA16D-derived AT-DRSs by the addition of the Werner helicase, implicated in processing of secondary structures arising during replication ( 22). In the third study, a FRA16B-derived AT-rich fragment, cloned into a SV40 replication plasmid, was able to fold into branched secondary structures, promoting polymerase stalling ( 40). The probability to fold into secondary structures was increased when the structure-prone strand served as the lagging strand template ( 40). Recently, using HR reporters it was shown that the Bloom helicase activity and the FANCM fork reversal activity are required for preventing double strand breaks (DSBs) formation along AT-DRSs derived from FRA3B, FRA16C and FRA16D ( 14, 15). In an additional recent study, genome-wide analysis in human cells identified structure forming repeats, including quasi palindromic AT-rich repeats, as principal sites of fork collapse upon ATR inhibition ( 43). All these studies demonstrate that AT-DRSs can perturb the replication progression and generate DSBs. In the current study however, we have directly demonstrated that an AT-DRS that was shown to stall the replication fork progression ( 20) and form highly stable secondary structures (Figure 3B) has the ability to create recurrent chromosomal fragility in a non-fragile region. This provides for the first time a direct evidence for the role of the difficult to replicate AT-DRSs in the mechanism underlying fragile site formation.

DNA DSBs induced by hydroxyurea treatment were recently detected within poly(dA:dT) tracts in the CFSs FRA3B and FRA16D, suggesting that in addition to AT-DRSs, other sequences with potential to form non-B DNA sequences may also contribute to the fragility of CFSs under various stress conditions ( 44).

The landscape of CFS expression differs across cell types. This has been attributed to differences in the availability of replication origins and differences in replication timing programs among cell types ( 6). However, for example, FRA16D and FRA3B that are highly expressed in lymphocytes in which they exhibit a paucity of replication initiation events ( 45), are also expressed in fibroblasts (although to a lesser extent) in which replication initiation events are distributed along the fragility core ( 32, 45, 46). This intrinsic instability suggests that features as AT-DRSs which reside along FRA16D and FRA3B ( 18, 47) predispose these regions to breakage, independently of the tissue specific replication program and together with other key features underlying the fragility along CFSs.

CFSs are preferentially unstable in precancerous lesions and during cancer development [reviewed in ( 9, 48)]. A comprehensive study of the gene pairs involved in all recurrent chromosomal translocations in tumor cells found that over half of breakpoints are mapped to human fragile sites ( 49). Sequences within and flanking three randomly selected pairs of translocations prone genes showed enrichment of AT-DRSs, that were shown to form highly stable secondary structures ( 49). Another study analyzed ∼20 000 translocation breakpoints in cancer genomes and found significant association with potential non-B DNA forming sequences, including AT-DRSs ( 50). AT-DRSs were also found as hot spots for translocations causing genetic syndromes, as in the case of the translocation between chromosomes 11 and 22, t(1122), which underlies the Emanuel syndrome or the supernumerary-der(22)t(1122) syndrome. In most patients the translocation breakpoint is found at the center of the AT-DRS ( 51, 52). All these studies highlight the role of AT-DRSs in genomic instability driving cancer and genetic diseases. In summary, the results presented in the current work highlight the deleterious effect of intrinsic DNA features such as the AT-DRSs in driving recurrent genome instability.


1.4: إنزيمات تعديل الحمض النووي

  • بمساهمة مايكل بلابر
  • أستاذ (العلوم الطبية الحيوية) في جامعة ولاية فلوريدا

ميثيلاز

مثلما قدمت دراسة نظام تعديل التقييد البكتيري مجموعة متنوعة من نوكليازات داخلية محددة ، هناك أيضًا مجموعة متنوعة من ميثيلات الحمض النووي المحددة.

  • تسلسل التعرف على الميثيليز هو نفسه نوكليازات داخلية مرتبطة (على سبيل المثال ، يتعرف EcoR1 methylase ويمثله في التسلسل & quotGAATTC & quot).
  • تنقل جميع الميثيلات مجموعة الميثيل من S-adenosylmethionine (SAM) إلى قاعدة محددة في تسلسل التعرف ، ويعتبر SAM مكونًا مطلوبًا في تفاعل المثيلة.
  • عادةً ما يكون لميثلة الحمض النووي تأثير على حماية الحمض النووي من نوكلياز التقييد ذي الصلة. ومع ذلك ، هناك ميثيلز مع الحد الأدنى من الخصوصية. على سبيل المثال، Sss أنا ميثيلاز سوف ميثيل بقايا السيتوزين في التسلسل 5 '& hellip CG & hellip 3'. In this case, سيتم حماية الحمض النووي الميثلي من مجموعة واسعة من نوكليازات التقييد.
  • بعض نوكليازات التقييد لن تقطع الحمض النووي إلا في مواقع التعرف عليها إذا كان الحمض النووي يكون ميثليته (على سبيل المثال Dpn I).
  • لا يزال سيتم قطع نوكليازات تقييد أخرى على حد سواء الحمض النووي الميثلي وغير الميثلي عند تسلسل التعرف عليها (مثل BamH I).

سد و dcm مثيلة

  • الميثيلاز المشفر بواسطة سد ينقل الجين (ميثيلاز السد) مجموعة ميثيل من SAM إلى N.6 موضع قاعدة الأدينين في التسلسل 5 '& hellip GATC & hellip 3'.
  • الميثيلاز المشفر بواسطة dcm الجين (dcm methylase) ميثيلات قاعدة السيتوزين الداخلية ، في C.5 الموضع ، في التسلسلات 5 '& hellip CCAGG & hellip 3' و 5 '& hellip CCTGG & hellip 3'.
  • تقريبا جميع سلالات بكتريا قولونية يشيع استخدامها في الاستنساخ لها أ سد+dcm+ النمط الجيني. النقطة هنا هي ليس أننا نريد بشكل خاص ميثلة حمضنا النووي ، ولكن هذا لجعل السد dcm- مضيف شخص ما يجب أن تحور البكتيريا وعزل المتحولة الصحيحة. من الواضح أن هذا لم يحدث مع الكثير من السلالات البكتيرية. ربما لأن سد و dcm يؤثر المثيلة فقط على مجموعة فرعية صغيرة من نوكليازات تقييد محتملة

عزل الحمض النووي من السد + dcm + سلالات لن يتم قطعها في الواقع من خلال مجموعة فرعية متواضعة من نوكليازات التقييد المتاحة:

تسلسل التعرف انزيم التقييد جاتك G لي ATC
تجاتكا Bcl أنا + -
جاتك مبو أنا + -
ATCGAT كلا أنا + -
TCTAGA Xba أنا + -
TCGA طق أنا + -
GAAGA مبو الثاني + -
GGTGA أنا Hph + -

قد يكون من الضروري تحضير الحمض النووي من سلالات الإشريكية القولونية التي تكون سدودًا dcm- حتى يتم قطعها بواسطة هذه الإنزيمات.

بوليميراز الحمض النووي

تم وصف مجموعة واسعة من البوليميرات وهي متاحة تجارياً. تشترك جميع بوليميرات الحمض النووي في خاصيتين عامتين:

  1. يضيفون النيوكليوتيدات إلى 3'-OH نهاية من التمهيدي
  2. ترتيب النيوكليوتيدات في عديد النوكليوتيد الناشئ هو قالب موجه

الشكل 1.4.1:تكرار الحمض النووي

بالإضافة إلى نشاط البوليميراز 5 '- & gt3' ، يمكن أن تحتوي البوليميراز على نشاط نوكلياز خارجي. يمكن أن يستمر نشاط نوكلياز خارجي هذا إما في الاتجاه 5 '- & gt3 ، أو في الاتجاه 3' - & gt5 '.

  • يسمح نشاط نوكلياز خارجي في الاتجاه 3 '- & gt5' للبوليميراز بتصحيح خطأ إذا كان يشتمل على نيوكليوتيد غير صحيح (يُطلق عليه & quotنشاط تصحيح الخطأ& مثل). يمكن أن تتحلل ببطء أيضا نهاية 3 'من التمهيدي.
  • سيسمح نشاط نوكلياز خارجي في اتجاه 5 '- & gt3' بتدهور أي أساس مهجن آخر قد يواجهه. بدون نشاط نوكلياز خارجي 5 '- & gt3' ، قد يتم أو لا يتم إزالة المواد الأولية التي تعيق الإشعال فعليًا ، اعتمادًا على البوليميراز المستخدم.

البوليميرات المختلفة لها معدلات خطأ مختلفة في التضمين ومعدلات مختلفة من البلمرة.

E. coli DNA polymerase I E. coli DNA polymerase I - جزء Klenow بوليميريز T4 DNA بوليميريز T7 DNA Taq DNA polymerase النسخ العكسي M-MuLV
نشاط نوكلياز خارجي 5 '- & GT3 * *
3 '- & GT5' نشاط نوكلياز خارجي * * * *
معدل الخطأ (x10 -6) 9 40 & lt1 15 285
نزوح حبلا *
تعطيل الحرارة * * * *

استخدامات البوليميراز

تضفي الأنشطة المختلفة للبوليميرات المختلفة على مجموعة متنوعة من التطبيقات. على سبيل المثال ، يمكن أن تنتج نوكليازات التقييد شظايا من الحمض النووي مع 3 'أو 5' نيوكليوتيدات & quotoverhangs & quot.

  • في حالة 5 'متراكمة ، يمكن لنشاط البوليميراز 5' - & gt3 أن يملأها نهايات حادة.
  • في حالة الثلاثة "المتراكمة" ، يمكن لنشاط نوكلياز 3 "- & gt5" الموجود في بعض البوليميراز (خاصة بوليميراز الحمض النووي T4) أن يعيد ويقتبس هذه الأطراف لصنع شظايا DNA غير حادة الأطراف.

الشكل 1.4.2:نشاط البلمرة

& quotNick-translation & quot

تُستخدم هذه الطريقة للحصول على شظايا الحمض النووي المفردة ذات العلامات الإشعاعية العالية ، والتي تستخدم نشاط نوكلياز خارجي 5 '- & gt3' موجود في بعض البوليميرات (بكتريا قولونية بوليميريز الحمض النووي الأول ، على سبيل المثال).

  • في هذه الطريقة ، يتم & quot؛ اقتباس مزدوج من الحمض النووي & quot؛ (على سبيل المثال ، يتم قطع أحد الخيوط ، انظر DNAse I).
  • ثم يضاف DNA pol I مع النيوكليوتيدات ذات العلامات الإشعاعية. يمضغ نشاط نوكلياز خارجي 5 '- & gt3 نهاية 5' في موقع & quotnick & quot ، ويشتمل نشاط البوليميراز على النيوكليوتيدات ذات العلامات الإشعاعية. سيتم تمييز البولي نيوكليوتيد الناتج بدرجة عالية وسيتم تهجينه مع تسلسل الحمض النووي ذي الأهمية.

الشكل 1.4.3:نيك الترجمة

  • تتمتع البوليمرات المقاومة للحرارة بالقدرة على الحفاظ على وظيفتها في نطاقات درجات الحرارة حيث سيذوب مزدوج الحمض النووي بالفعل وينفصل. وقد سمح هذا بتطوير & quot تفاعل البوليميراز المتسلسل & quot تقنية (PCR) ، والتي كان لها تأثير عميق على التكنولوجيا الحيوية الحديثة. سنناقش هذه الطريقة في وقت لاحق.
  • يؤدي دمج قواعد dideoxy (أي عدم وجود مجموعات هيدروكسيل على 2 'أو 3' كربون من سكر الريبوز) إلى إنهاء تفاعل البلمرة. سيتم مناقشة هذا بمزيد من التفصيل في وقت لاحق. ومع ذلك ، فإن إنهاء السلسلة هذا من خلال دمج ديديوكسينوكليوتيدات هو أساس طريقة سانجر لتسلسل الحمض النووي ، وكذلك العلاجات لمحاولة منع تكاثر الفيروس.

نوكلياز

نوكلياز BAL-31

  • هذا exoنوكلياز (يبدأ من الطرف ويعمل إلى الداخل) والذي سوف يتحلل على حد سواء 3 'و 5' نهاية من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. لن تقوم بعمل انشقاقات داخلية (& quotnicks & quot) ، ومع ذلك ، فإنها ستؤدي إلى تدهور نهايات الحمض النووي في & quotnicks & quot الداخلية الموجودة (والتي تخلق كلا النهايتين 3 'و 5').
  • لا يتم تنسيق تدهور المحطة ، مما يعني أن المنتج مناسب ليس 100٪ غير حاد الأطراف (على الرغم من أن الطباعة على الوجهين الأصلي قد تكون نهائية غير حادة).
  • يمكن جعل هذه النهايات & المقتطفة & quot غير حادة عن طريق التعبئة والمضغ بواسطة بوليميراز مناسب (على سبيل المثال T4 DNA polymerase). تعريف الوحدة لوحدة واحدة هو مقدار الإنزيم المطلوب لإزالة 200 زوج قاعدي من كل طرف من نهايات DNA مزدوج في 10 دقائق عند 30 درجة مئوية.

الشكل 1.4.4:نشاط نوكلياز بال -31

نوكلياز خارجي III

  • يحفز الإزالة التدريجية للنيوكليوتيدات من 3 'نهاية هيدروكسيل من الحمض النووي المزدوج.
  • سيهاجم الإنزيم 3 'هيدروكسيل في DNA مزدوج مع نهايات حادة ، مع 5' نتوءات ، أو مع & quot؛ nicks & quot داخلية.
  • بما أن الحمض النووي المزدوج مطلوب ، فإن الإنزيم سوف لن هضم الطرف الثالث للحمض النووي المزدوج حيث تكون النهايات عبارة عن 3 أجزاء متدلية.

الشكل 1.4.5:نشاط نوكلياز الثالث

نوكلياز مونج فول (معزول من براعم حبوب مونج)

  • أ حبلا واحد محدد نوكلياز DNA و RNA الذي سيؤدي إلى تدهور امتدادات الخيط الفردي من نهايات DNA و RNA تاركًا نهايات غير حادة.
  • يمكن أن تكون امتدادات الجدائل المفردة إما 5 'أو 3' امتدادات - تتم إزالة كلاهما ويتم ترك مزدوج غير حاد.

الشكل 1.4.6:نشاط نوكلياز مونج فول

Deoxyribonuclease I (DNAse I) من البنكرياس البقري

  • هذا الإنزيم يتحلل مائيًا مزدوجًا أو خيوط DNA مفردة بشكل تفضيلي في روابط phosphodiester 5 'إلى بيريميدين النيوكليوتيدات
  • في وجود Mg 2+ ion ، يقوم DNAse I بمهاجمة كل خصلة بشكل مستقل وينتج شقوقًا بطريقة عشوائية (مفيدة للترجمة النكية)
  • في وجود Mn2 + ion DNAse ، أقوم بشق كلا خيوط الحمض النووي في نفس الموضع تقريبًا (ولكن مع ترك & اقتباس & quot النهايات)

إنزيمات دمج الجزيئات

  • تحفز Ligases ملف تشكيل من الرابطة الفوسفاتية بين 5 'فوسفات و 3' هيدروكسيل تيرميني من النيوكليوتيدات (من المحتمل أن يكون الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي اعتمادًا على الليجاز).
  • بمعنى ما ، هم عكس نوكليازات التقييد ، لكن لا يبدو أنهم يتأثرون بالتسلسل المحلي ، في حد ذاته.
  • تتطلب Ligases إما rATP أو NAD + كعامل مساعد، وهذا يتناقض مع نوكليازات التقييد.

فيما يلي أنواع مختلفة من ligases وخصائصها.

T4 DNA ligase

  • معزولة عن البكتيريا T4.
  • سوف يربط نهايات الحمض النووي المزدوج أو الحمض النووي الريبي.
  • سينضم هذا الإنزيم إلى نهايات نهائية غير حادة بالإضافة إلى نهايات متدرجة (مكملة) متدلية (إما 3 'أو 5' نتوءات تكميلية).
  • سيقوم هذا الإنزيم أيضًا بإصلاح النكات المفردة التي تقطعت بها السبل في الدنا المزدوج أو RNA أو DNA / RNA المزدوج. يتطلب ATP كعامل مساعد.

طق DNA ligase

  • سوف يحفز هذا الليجاز رابطة فسفودايستر بين اثنين من قليل النوكليوتيدات المتجاورتين والتي يتم تهجينها إلى خيط DNA تكميلي:

الشكل 1.4.7:نشاط Taq DNA ligase

  • يكون الربط فعالاً فقط إذا تهجين قليل النوكليوتيدات بشكل مثالي مع حبلا القالب.
  • ينشط الإنزيم في درجات حرارة عالية نسبيًا (45 - 65 درجة مئوية). يتطلب NAD + كعامل مساعد.

T4 RNA ligase

  • سوف يحفز تكوين رابطة فوسفوديستر بين أليغنوكليوتيدات RNA / RNA ، أو oligonucleotides RNA / DNA ، أو oligonucleotides DNA / DNA.
  • يتطلب ATP كعامل مساعد.
  • هذا الإنزيم لا يتطلب قالب حبلا.

يمكن استخدام Ligase T4 RNA لمجموعة متنوعة من الأغراض بما في ذلك بناء جزيئات هجينة RNA / DNA.

الشكل 1.4.8:نشاط T4 RNA ligase

DNA ligase (E. coli)

  • سوف يحفز رابطة فسفودايستر بين الحمض النووي المزدوج تحتوي على نهايات متماسكة.
  • ستكون ليس ربط الأجزاء ذات النهاية الزرقاء بكفاءة.
  • يتطلب NAD + كعامل مساعد.

الشكل 1.4.9:نشاط DNA ligase (E. Coli)

T4 عديد النوكليوتيد كيناز

  • يحفز نقل وتبادل مجموعة الفوسفات من ز موضع rATP (أدينين ريبوز ثلاثي الفوسفات نيوكليوتيد) إلى 5 'نهاية هيدروكسيل من DNA أو RNA مزدوج الجديلة وحيدة الجديلة ، و نيوكليوزيد 3 أحادي الفوسفات.
  • سيزيل الإنزيم أيضًا 3 مجموعات فسفورية.
  • قليل النوكليوتيدات التي يتم الحصول عليها من التركيبات الآلية تفتقر إلى مجموعة فوسفات 5 بوصات ، وبالتالي لا يمكن ربطها بالعديد النوكليوتيدات الأخرى.

يمكن استخدام T4 polynucleotide kinase لفوسفوريلات نهاية 5 'من عديد النيوكليوتيدات:

الشكل 1.4.10:نشاط T4 متعدد النوكليوتيد كيناز


نقاش

The In-Fusion™ cloning method was originally developed to produce a common entry vector for a multi-vector cloning system based on the cre-lox recombination (Clontech). As shown here and by others ( 18) (and Andrew Farmer: Clontech, personal communication), the enzyme can be used in combination with any 15 bp homology region to enable ligation-independent cloning of PCR products. We have exploited this property, in combination with single and multiple promoter vectors, to produce a simple and versatile system for expression of recombinant proteins. We have incorporated the method into a semi-automated pipeline for both vector construction and expression screening using standard laboratory liquid handling instruments. The pilot experiments in 96-well format showed cloning efficiencies of 89% after two clones per target tested, with 94% achievable with four clones tested, which we would recommend to maximize cloning efficiency. The reason(s) for some PCR products not cloning is not clear although the quality and quantity of the input DNA appears to be important. Over the last 12 months in the OPPF, we have used In-Fusion™ to construct a total of 661 vectors from 703 PCR products, an overall cloning efficiency of 94%. These results compare favourably with data reported by other HTP structural genomics consortia using either the Gateway™ recombinatorial system (e.g. 79% PCR product to expression clone efficiency ( 19, 20)) or ‘classical’ restriction enzyme and ligation-dependent methods (e.g. 87% ( 1)).

Multi-promoter vectors have been used to express recombinant proteins in more than one host in parallel, typically baculovirus-infected insect cells and بكتريا قولونية على سبيل المثال ( 21, 22). Similarly, the pOPINE, pOPINF, pOPINJ or pOPINM vectors based on pTriEx2 (Novagen) described in this study can be used to survey expression in بكتريا قولونية, insect cells, and mammalian cells from a single vector, which can be easily constructed in HTP mode with the associated savings in time and resources. Transient transfection of mammalian cells, notably COS7 and HEK293, is widely used to investigate the expression of eukaryotic proteins and can be readily scaled up for production purposes ( 7, 12, 23, 24). We describe the derivation and use of a secretion vector based on the pOPINF/pTriEx2 vector backbone for the HTP expression of extra-cellular proteins and domains. In addition, the expression from single vector constructs in all three hosts (بكتريا قولونية, HEK293T and Sf9 cells) has been demonstrated for five target proteins. This ability to screen in multiple hosts would enable rapid scale-up in the most appropriate host (determined by small-scale screening) without the necessity for additional rounds of sub-cloning. The transient transfection protocol (HEK293 cells) and co-transfection protocols (Sf9 cells), which make use of a commercial transfection reagents, have both been automated to enable consistent HTP operation for functional/structural proteomic applications. As far as we are aware, this is the first report of such implementations.

In summary, we have addressed the primary characteristics we set for an improved strategy for HTP cloning as follows:

The ability to clone genes-encoding proteins, or domains thereof, in a rapid and reliable parallel or high-throughput (HTP) fashion. Cloning efficiencies of >90% have been achieved in a parallel 96-well plate format using a generic vector in combination with the In-Fusion™ enzyme.

The ability to accurately determine the final constructs without the addition of extraneous/vector or restriction-site-derived amino acids to the expressed protein. A suite of vectors has been described which make use of In-Fusion™ cloning to precisely engineer the expressed sequence, for example, introducing an N-terminal His6 tag and 3C protease cleavage site to enable removal of the tag during purification. The utility of this format has been exemplified (Case study I).

The process must be versatile in terms of insert sequence independence. Three case studies have been described in which eighty-two expression vectors have been produced from a variety of target genes using the vector system (Case studies I, II, III).

The process would preferably be single-step, to give rapid and cost-effective vector construction. Vector construction involves a single-step reaction that enables the simple and rapid construction of vectors in parallel using a 96-well plate format. Further, certain PCR products are compatible with multiple fusion vector formats (e.g. N-His, N-His-GST and N-His-MBP—see examples in Case study III) thereby enabling cost-effective use of PCR primers.

The constructs should be capable of expressing proteins from multiple hosts, i.e. a single vector capable of expression in بكتريا قولونية, mammalian cell lines (e.g. HEK293T cells) and insect cell lines (e.g. Sf9 cells). By adapting a multi-promoter vector a single cloning step has been used to produce a single vector suitable for expression in E. coli, mammalian and insect cells. The utility of this has been exemplified (Case study III).

The expressed proteins must be capable of purification in HTP mode, i.e. they must all be fused to a common affinity purification ‘tag’ which may be removed, if desired, by enzymatic digest prior to crystallization. All vectors, regardless of additional fusion protein expressed, add either an N-terminal or C-terminal His6 tag onto the expressed target protein to facilitate detection and purification. The purification of proteins expressed both intracellularly in E. coli and secreted from mammalian cells using a common purification strategy has been exemplified (Case studies I and II).

The process should be amenable to automation. Laboratory automation to carry out liquid handling tasks involved in the various stages of the expression screening experiments in all three hosts has been described.


نتائج

Cernunnos Promotes Joining of Mismatched Ends and Noncohesive Ends.

We purified Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos to apparent homogeneity (Fig. 1 أ) and tested their ability to join cohesive 5′ ends (EcoRI–EcoRI) or cohesive 3′ ends (KpnI–KpnI). To measure joining efficiency, we used quantitative PCR, which amplified junctions produced from one pair of ends. The PCR primers eliminated signals from competing junctions, such as those produced from intramolecular ligation into circular monomers or intermolecular ligation of other ends. Ku, DNA-PKcs, and XL joined EcoRI–EcoRI ends and KpnI–KpnI ends with efficiencies of 1.2–2.2% (Fig. 1 ب, rows 1 and 2). However, the addition of Cernunnos had no effect on joining efficiency.

Cernunnos stimulates the joining of mismatched DNA ends. (أ) Purification of NHEJ proteins. Coomassie staining after SDS/PAGE shows our purified preparations of Ku, DNA-PKcs (Pk), Cernunnos (C), and XL. (ب) Cernunnos stimulates the joining of noncohesive ends by Ku, DNA-PKcs, and XL. Linear DNA substrates were incubated with no protein (dark gray bars), Ku, DNA-PKcs and XL (light gray bars), or Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos (black bars). The orientation of DNA is depicted in the upper left corner. We tested compatible ends (rows 1–3) with cohesive 5′ overhangs (EcoRI–EcoRI), cohesive 3′ overhangs (KpnI–KpnI), or blunt ends (EcoRV–EcoRV). We also tested eight combinations of mismatched ends (rows 4–11). Note that SacII creates a 2-nt 3′ overhang. All other 3′ and 5′ overhangs were 4 nt. We measured joining efficiency by quantitative PCR and expressed efficiency as the percentage of input DNA ends joined (18). Because of large differences among experiments, we plotted joining efficiency on a logarithmic scale. Concentrations of Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos were 5, 5, 0.5, and 2.5 nM, respectively, here and elsewhere unless otherwise noted. (أقحم) The overhangs from the KpnI–SacI, Acc65I–EcoRI, and EcoRI–BamHI ends.

Next, we tested whether Cernunnos might affect the joining of noncohesive DNA ends. The addition of Cernunnos to Ku, DNA-PKcs, and XL stimulated the joining of two blunt ends (EcoRV–EcoRV) by 6-fold (Fig. 1 ب, row 3). In the absence of Cernunnos, Ku, DNA-PKcs, and XL joined blunt ends paired with either 5′ or 3′ overhangs with low and approximately equal efficiencies (Fig. 1 ب, rows 4–7). However, the addition of Cernunnos stimulated joining 30- and 55-fold for the blunt-3′ ends, EcoRV–KpnI and EcoRV–SacII, and 8- and 9-fold for the blunt-5′ ends, EcoRV–EcoRI and EcoRV–BamHI. Thus, Cernunnos had a greater effect on blunt-3′ ends than on blunt-5′ ends.

Cernunnos also stimulated joining of ends with mismatched overhangs by 40- to 150-fold (Fig. 1 ب, rows 8–11). Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos joined mismatched 5′ overhangs (Acc65I–EcoRI, 0.0039%) with 23-fold lower efficiency than mismatched 3′ overhangs (KpnI–SacI, 0.091%). However, Cernunnos facilitated more efficient joining when the 5′ overhangs contained partially complementary sequences (BamHI–EcoRI, 0.25%).

In summary, Cernunnos exhibited a preference for 3′ overhangs over 5′ overhangs. This preference also occurred when we omitted DNA-PKcs from the joining reaction [supporting information (SI) Fig. 6]. The effect of Cernunnos appeared to be specific, because Cernunnos had no effect on ligation of blunt ends to 3′ overhangs by bacteriophage T4 DNA ligase (SI Fig. 7).

Cernunnos Requires Ku to Promote Mismatched End Joining by XL.

We were particularly interested in the joining of mismatched 3′ overhangs because they are produced during V(D)J recombination في الجسم الحي (15) and because Cernunnos stimulated their joining by 40-fold في المختبر (رسم بياني 1 ب, row 9). Interestingly, purified XL joined KpnI–SacI ends with low but detectable efficiency, although the addition of Cernunnos failed to stimulate joining by XL alone (Fig. 2 أ). However, even a substoichiometric concentration of Cernunnos (0.05 nM) stimulated joining by XL (0.5 nM) in the presence of Ku (5 nM) and DNA-PKcs (5 nM). A stoichiometric excess of Cernunnos (15 nM) stimulated joining 200-fold, up to a level of nearly 1%.

Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos act in concert to join mismatched 3′ overhangs. (أ) Cernunnos stimulates the joining of mismatched ends with Ku, DNA-PKcs, and XL but not with XL alone. DNA substrates with mismatched 3′–3′ overhangs (KpnI–SacI) were incubated with XL alone or XL, Ku, and DNA-PKcs (Pk). Concentrations of Ku, DNA-PKcs, and XL were 5, 5, and 0.5 nM, respectively. Cernunnos (C) was added at concentrations of 0.05, 0.1, 0.5, 2.5, 5, and 15 nM. The point in the lower left shows the background PCR signal in the absence of protein. Error bars represent the variation in duplicate measurements. (ب) Cernunnos requires Ku to promote mismatched end joining by XL. DNA substrates with mismatched 3′ overhangs (KpnI–SacI) were incubated with different combinations of the core NHEJ proteins Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos (2.5 nM).

To determine which proteins were required for joining mismatched ends, we incubated the DNA with Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos in different combinations (Fig. 2 ب). As single proteins, only XL produced detectable joining of the KpnI–SacI ends. The addition of Ku and DNA-PKcs to XL increased joining efficiency 12-fold. Starting from the reaction with all four protein preparations, we omitted each protein one at a time. The omission of DNA-PKcs reduced joining only 4-fold, but the omission of Ku or Cernunnos reduced joining 150-fold or 40-fold, respectively. Note that the omission of Cernunnos reduced joining 200-fold when the concentration of Cernunnos was 15 nM rather than 2.5 nM (Fig. 2 أ). Significantly, the omission of XL eliminated joining activity completely. Thus, Ku, XL, and Cernunnos were required for efficient joining of mismatched ends. These data suggest that Cernunnos and Ku stimulated a latent joining activity for mismatched ends contained in Ligase IV.

Cernunnos Promotes the Preservation of 3′ Overhangs.

To further characterize the joining of mismatched KpnI–SacI ends, we sequenced the junctions created by Ku, DNA-PKcs, and XL with or without the addition of Cernunnos. Surprisingly, the sequence from one 3′ overhang was retained in every junction, whereas the sequence of the other 3′ overhang was lost (Fig. 3). In the absence of Cernunnos, 21 of the 22 sequenced junctions retained the 3′ KpnI overhang, whereas only 1 junction retained the SacI overhang. This preference occurred only in the absence of Cernunnos and remains unexplained. However, in the presence of Cernunnos, the 3′ overhangs were retained with equal probability.

Cernunnos promotes the retention of overhanging ends. We incubated DNA substrates with Ku, DNA-PKcs, and XL with or without the addition of Cernunnos. The DNA substrates had mismatched 3′–3′ ends (KpnI–SacI), blunt-3′ ends with 4-nt overhangs (EcoRV–KpnI), or blunt-3′ ends with 2-nt overhangs (EcoRV–SacII). We used quantitative PCR to measure the percentage of DNA ends joined and sequenced products from each reaction to characterize the junctions. The key shown at the top indicates how the data are presented for each reaction. The junctions recovered from PCR amplification are depicted to show nucleotide addition (black background) and nucleotide deletion (white background).

We also characterized the joining of blunt ends to 3′ overhangs of 4 nt (EcoRV–KpnI) or 2 nt (EcoRV–SacII). In the absence of Cernunnos, most junctions (20 of 29) lost the 3′ overhang, and only a minority (9 of 29) retained the 3′ overhang (Fig. 3). In the presence of Cernunnos, 62 of 62 sequenced junctions retained the 3′ overhang (Fig. 3). Cernunnos exhibited the same effect when added to Ku and XL in the absence of DNA-PKcs (SI Fig. 8). Thus, the addition of Cernunnos promoted retention of sequences from the 3′ overhangs.

Finally, we characterized the joining of blunt ends to 5′ overhangs (SI Fig. 9). Cernunnos exhibited only a moderate effect in promoting retention of the 5′ overhang for EcoRV–BamHI ends, and no effect on retention of the 5′ overhang for EcoRV–EcoRI ends.

Ku, XL, and Cernunnos Ligate One of the Two Strands from Mismatched DNA Ends.

In an effort to account for the retention or deletion of 3′ overhangs, we examined our purified protein preparations for polymerase or nuclease activities. Polymerase activity was absent because the joining reactions did not include dNTPs and because joining efficiency was unaffected by addition of dNTPs (data not shown). Nuclease activity also was absent because Cernunnos strongly stimulated joining of blunt-3′ ends with retention of 3′ overhanging sequences (Fig. 3 and SI Fig. 8). Furthermore, Cernunnos, Ku, XL, and DNA-PKcs failed to degrade radiolabeled single-strand DNA substrates (SI Fig. 10) and did not delete any nucleotides in 112 junctions from pairs of blunt ends (EcoRV–EcoRV) and cohesive ends (EcoRI–EcoRI and KpnI–KpnI) (SI Fig. 11).

Taken together, our data suggest that Cernunnos and Ku stimulated XL to ligate one of the two strands from mismatched DNA ends. The deletion or retention of 3′ overhangs would depend on which strand was ligated. If Ligase IV catalyzes ligation of only one strand from mismatched ends, the 5′ phosphate group of one DNA substrate should be dispensable for ligation. To test this hypothesis, we removed 5′ phosphates from the DNA substrates with 3′ overhanging KpnI ends or blunt EcoRV ends and incubated the DNA with Ku, XL, and Cernunnos with or without DNA-PKcs (Fig. 4). When we removed the recessed 5′ phosphate on the KpnI end, joining actually increased because of decreased competition from intramolecular circularization of the KpnI substrate. This result demonstrated that the 5′ phosphate on the KpnI end was dispensable for joining. By contrast, when we removed the 5′ phosphate from the blunt EcoRV end, joining decreased to the levels observed when both DNA ends lacked 5′ phosphates. Taken together with the junction sequences (Fig. 3), these data indicated that Cernunnos stimulated the ligation of one strand from each end, joining the overhanging 3′ hydroxyl on the KpnI end to the 5′ phosphate on the blunt EcoRV end.

Ku, XL, and Cernunnos join mismatched ends with the 5′ phosphate from only one end. To determine how Ku, XL, and Cernunnos joined mismatched ends, we treated the EcoRV and KpnI substrates with DNA phosphatase (Antarctic phosphatase New England Biolabs). EcoRV* and KpnI* denote dephosphorylated DNA molecules. We confirmed the successful removal of the 5′ phosphates by incubating each DNA preparation with T4 ligase and were able to demonstrate a loss of >90% of the ligation products by using agarose gel electrophoresis (data not shown). We incubated mismatched DNA substrates (EcoRV–KpnI, EcoRV–KpnI*, EcoRV*–KpnI, or EcoRV*–KpnI*) with Ku, XL (1 nM), and Cernunnos (2 nM), with or without DNA-PKcs amplified the junctions by quantitative PCR and plotted joining efficiency on a linear scale.

We wanted to obtain direct evidence for what we shall refer to as mismatched end (MEnd) DNA ligase activity. To avoid PCR amplification, we designed a gel-based assay with radiolabeled DNA. To unambiguously identify the joined products and improve joining efficiency, we assayed intramolecular joining of linear DNA. Each DNA molecule contained cohesive EcoRI–EcoRI ends, blunt EcoRV–EcoRV ends, or mismatched blunt-3′ EcoRV–KpnI ends (Fig. 5).

Ku, XL, and Cernunnos join mismatched ends by ligation of one strand. (أ) Schematic of the gel-based assay for joining. We incubated Ku, XL, and Cernunnos (Ku/XL/C) or T4 ligase (T4) with a linear DNA substrate containing EcoRI–EcoRI, EcoRV–EcoRV, or EcoRV–KpnI ends digested the DNA products with XmnI and used T4 polynucleotide kinase to radiolabel the DNA. Concentrations of XL and Cernunnos were 1 nM and 5 nM, respectively. For EcoRV–EcoRV and EcoRV–KpnI ends, we performed a second digest with ApoI or MspA1I to remove the radiolabel from one DNA strand. To confirm that ligation created a new phosphodiester bond, we digested the products of the EcoRV–EcoRV joining reaction with EcoRV. Radiolabeled DNA strands are red with red asterisks at the 5′ end, and unlabeled DNA strands are black. DNA products were resolved with denaturing gel electrophoresis. (ب) Ku, XL, and Cernunnos joined cohesive EcoRI–EcoRI ends. Ku, XL, and Cernunnos (lane 3) and T4 ligase (lane 4) produced a higher molecular weight band of 498 nt. The molecular weight markers consisted of a radiolabeled 50-bp ladder (lane 1). Joining efficiencies for Ku/XL/C and T4 (calculated from the ratio of intensities in the 498-nt band to the 339-nt band) were 39% and 89%, respectively. Sizes of the ligated higher molecular weight bands in ب- د appear in blue typeface. (ج) Ku, XL, and Cernunnos joined blunt EcoRV–EcoRV ends. Ku, XL, and Cernunnos (lane 3) and T4 ligase (lane 4) produced a higher molecular weight band of 470 nt, with joining efficiencies of 20% and 14%, respectively. ApoI digestion converted the 470-nt band to 413-nt and 57-nt bands and converted the 281-nt band to 224-nt and 57-nt bands (lane 6). MspA1I digestion converted the 470-nt band to 434-nt and 36-nt bands and the 189-nt band to 153-nt and 36-nt bands (lane 8). Intensities of the 413-nt and 434-nt bands were reduced to 50% of the 470-nt band because the second digestion removed the radiolabel from one strand. EcoRV digestion eliminated the 470-nt band (lane 10), demonstrating that the DNA junction contained new phosphodiester bonds. The 153-, 57-, and 36-nt bands are not shown. (د) Ku, XL, and Cernunnos joined only one strand from mismatched EcoRV–KpnI ends. Ku, XL, and Cernunnos (lane 3) produced a higher molecular weight band of 472 nt, with a joining efficiency of 5%. ApoI digestion converted the 472-nt band to 415-nt and 57-nt bands and the 281-nt band to 224-nt and 57-nt bands (lane 5). The intensities of the 472-nt and 415-nt bands were equivalent (lanes 3 and 5). MspA1I digestion converted the 472-nt band to a 36-nt band and converted the 191-nt band to a 36-nt band (lane 7), demonstrating the ligation of only one strand.

We incubated the DNA with Ku, XL, and Cernunnos. To detect the joined products by denaturing gel electrophoresis, we cleaved the DNA products with XmnI and labeled the ends with [γ- 32 P]ATP and T4 polynucleotide kinase (Fig. 5 أ). This procedure labeled the 5′ ends of DNA strands terminating at XmnI, EcoRI, and EcoRV sites. We measured joining by appearance of a higher molecular weight DNA fragment of the appropriate size. To determine whether joining occurred for a specific strand, we removed the radiolabel on one strand or the other by cleaving the DNA with ApoI or MspA1I.

For the cohesive 5′ overhanging EcoRI–EcoRI ends (Fig. 5 ب), Ku, XL, and Cernunnos joined 39% of the input DNA. By contrast, T4 ligase joined 89% of the input DNA. For blunt EcoRV–EcoRV ends (Fig. 5 ج), Ku, XL, and Cernunnos joined 20%, and T4 ligase joined 14% of the input DNA. When we removed the radiolabel from one strand by cleaving the DNA with ApoI or MspA1I, 50% of the signal from the higher molecular weight DNA disappeared (Fig. 5 ج). Thus, the assay was able to discriminate the joining of one strand vs. the other. The junction formed by joining of the blunt EcoRV ends was susceptible to cleavage by the phosphodiesterase activity of EcoRV, indicating that Cernunnos stimulated a ligation event that created a bona fide phosphodiester bond.

For blunt-3′ EcoRV–KpnI ends, Ku, XL, and Cernunnos joined 5% of the input DNA (Fig. 5 د), which was higher than the result from quantitative PCR of the same DNA products, which detected ligation of 1.6% of the input DNA (data not shown). When we removed the radiolabel from the strand containing the 3′ overhang by MspA1I cleavage, 100% of the signal from the higher molecular weight DNA disappeared. By contrast, removal of the radiolabel from the other strand by ApoI reduced the size of the higher molecular weight fragment by 57 nt without diminishing the signal. This result provided direct evidence for single-strand ligation of the hydroxyl group of the 3′ overhang to the 5′ phosphate of the blunt end. Remarkably, Ku, XL, and Cernunnos ligated blunt-3′ ends with an efficiency of 5%, even in the absence of DNA-PKcs. For comparison, T4 ligase ligated blunt ends with an efficiency of 14%.


Associated Data

Targeted nucleases are powerful tools for mediating genome alteration with high precision. The RNA-guided Cas9 nuclease from the microbial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) adaptive immune system can be used to facilitate efficient genome engineering in eukaryotic cells by simply specifying a 20-nt targeting sequence within its guide RNA. Here we describe a set of tools for Cas9-mediated genome editing via nonhomologous end joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR) in mammalian cells, as well as generation of modified cell lines for downstream functional studies. to minimize off-target cleavage, we further describe a double-nicking strategy using the Cas9 nickase mutant with paired guide RNAs. This protocol provides experimentally derived guidelines for the selection of target sites, evaluation of cleavage efficiency and analysis of off-target activity. Beginning with target design, gene modifications can be achieved within as little as 1𠄲 weeks, and modified clonal cell lines can be derived within 2𠄳 weeks.


Funding for this work was provided by the National Institutes of Health (R01GM121698 to D.A.B, R21AG056706 to D.A.B, R01GM106081 to X.W.) and the Arizona Biomedical Research Commission (ADHS16-162401 to D.A.B). ملحوظة. was supported by a fellowship from the International Foundation for Ethical Research.

Nicholas Brookhouser, Toan Nguyen, Stefan J. Tekel and Kylie Standage-Beier contributed equally to this work.

الانتماءات

School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University, 501 E. Tyler Mall, ECG 334A, Tempe, AZ, 85287, USA

Nicholas Brookhouser, Toan Nguyen, Stefan J. Tekel, Kylie Standage-Beier, Xiao Wang & David A. Brafman

Graduate Program in Clinical Translational Sciences, University of Arizona College of Medicine-Phoenix, Phoenix, AZ, 85004, USA

Molecular and Cellular Biology Graduate Program, Arizona State University, Tempe, AZ, 85287, USA