معلومة

تحضير عينة لـ SDS PAGE


لدي أكثر من 10 عينات من الخلايا المحللة (70 ميكرولتر لكل منها) التي يتراوح تركيزها من 1.9 مجم / مل إلى 4.8 مجم / مل. لدي مخازن مؤقتة 5X و 2 X SDS. أود تحضير عينات SDS PAGE بطريقة تجعل التركيز النهائي لجميع عينات البروتين متساويًا. أنا أكافح للتعامل معها.

ما أعرفه هو أثناء استخدام المخزن المؤقت 5X ، لأربعة أجزاء من العينة ، نستخدم جزءًا واحدًا من المخزن المؤقت لجعله أخيرًا 1X. وبالمثل ، بالنسبة للمخزن المؤقت 2X ، نستخدم كميات متساوية من المخزن المؤقت والعينة لعمل 1X. أيضا ، أود أن أعرف هل ستكون مشكلة إذا جعلتها أكثر من 1X؟ لماذا نحتاج 1X؟


عادة ما تريد الاحتفاظ بامتداد كمية نفسه ، ليس التركيز. ومع ذلك ، إذا كنت لا تزال تريد أن يكون التركيز هو نفسه ، فيمكنك إضافة كميات مناسبة من PBS أو محلول التحلل.

على سبيل المثال إذا كان لديك عينتان بتركيزات 1 مجم / مل و 4 مجم / مل وتريد تحميل 20 ميكروغرام من البروتين الكلي ، فيمكنك أخذ 20 ميكرولتر من العينة الأولى وإضافة 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل 5x. بالنسبة للعينة الثانية ، ستأخذ 5 ميكرولتر من العينة ، و 5 ميكرولتر من مخزن التحميل 5x و 15 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.

لماذا 1x؟

لأن الباحثين قبلنا وجدوا أن هذا التكوين هو الأمثل (أو ببساطة تمسك به كمسألة ممارسة).

هل ستكون مشكلة إذا كان التركيز النهائي لمخزن التحميل أكثر من 1x؟

على ما يبدو لا ، في تجربتي إذا كان يصل إلى 1.5x. لم تقم بفحص التركيزات الأعلى.


تأتي المخازن المؤقتة الخاصة بك مركزة بحيث يمكن تعبئة كميات أصغر وشحنها وتخزينها. هم مقصود للاستخدام بتركيز 1X ، ما لم يذكر خلاف ذلك. لذلك على سبيل المثال ، إذا حصلت على مخزن مؤقت 5X ، فيجب عليك استخدام مخفف مناسب للحصول على تركيز 1X في الحجم الذي تحتاجه. قد يكون هذا 5 مل (جزء واحد) من المخزن المؤقت 5X إلى 20 مل (4 أجزاء) من المادة المخففة للحصول على 25 مل من المخزن المؤقت 1X.

سيتعين عليك دراسة تأثير استخدام مخزن مؤقت أكثر تركيزًا في عمليتك ، ولكنه قد يؤثر على نتائجك ، وسيكلفك بالتأكيد المزيد من المال.

سيكون السؤال الجيد الذي تطرحه بنفسك هو: إذا كنت أستخدم مخزنًا مؤقتًا أكثر تركيزًا لـ SDS-PAGE الخاص بي ، وكان هناك تباين في النتائج ، كيف يمكنني معرفة ما إذا كان التباين ناتجًا عن تركيز المخزن المؤقت أم لا؟

بدلاً من ذلك ، يمكنك محاولة إحضار عينات البروتين الخاصة بك إلى نفس التركيزات أولاً ، ثم تخفيفها في المحاليل المنظمة حسب الحاجة.


14.3: تشغيل المواد الهلامية SDS-PAGE

  • بمساهمة من Clare M. O & rsquoConnor
  • أستاذ مشارك فخري (علم الأحياء) في كلية بوسطن

قم بإعداد جهاز التفريد الكهربائي

  1. أحضر أحد أنواع الجل SDS-PAGE من الثلاجة.
  2. قم بإزالة المشط بعناية من هلام المباعد.
  3. قم بإزالة إطار الصب من شطيرة علبة الهلام وضع الساندويتش مقابل الحشية على جانب واحد من مجموعة القطب الكهربائي ، بحيث تكون اللوحة القصيرة متجهة للداخل. ضع كاسيت جل ثاني أو سد عازل ضد الحشية في الجانب الآخر من تجميع القطب.
  4. ثبت المشابك الخضراء على جانبي مجموعة القطب الكهربائي (أدناه).
  5. اخفض الحجرة في الخزان الكهربائي.
  6. املأ الفراغ بين الهلامين باستخدام المخزن المؤقت Tris-glycine. هذا يشكل الغرفة العلوية للرحلان الكهربي.
  7. أضف عازلة تشغيل Tris-glycine إلى الغرفة الخارجية (السفلية) حتى يصبح المستوى مرتفعًا بما يكفي لتغطية السلك البلاتيني في مجموعة القطب.

تحميل وتشغيل العينات على هلام SDS-PAGE

    استرجع مستخلصات الخلايا من الفريزر. تذكر أن العينات قد تم خلطها بالفعل مع صبغة التتبع والجلسرين. السماح للمستخلصات بالذوبان والدوامة بقوة من أجل

ملاحظة: تأكد من تسجيل ترتيب العينات المحملة على الجل.


آسف ، أنت ممنوع

يستخدم موقع الويب هذا خدمة CloudFilt لحماية نفسه من هجمات الروبوتات. أدى الإجراء الذي قمت به للتو إلى تشغيل حل CloudFilt. هناك العديد من الإجراءات التي يمكن أن تؤدي إلى حدوث هذا الحظر ، بما في ذلك السلوك غير الإنساني (الروبوت السيئ) أو الهجوم الإلكتروني.

ماذا يمكنني أن أفعل لحل هذا؟

يمكنك النقر فوق الزر "اسمح لي" واتباع الخطوات. سيتم إعادة فحص التنقل يدويًا.

يمكنك منع البرامج الضارة واكتشافها وحظرها في الوقت الفعلي باستخدام التعلم الآلي السلوكي

عنواننا
  • +33 4 34 43 11 29
  • [email protected]
  • زيويت ساس ،
    CloudFilt.com
    40 AV Theroigne de mericourt ،
    34000 مونبلييه ، فرنسا
روابط اضافية

آسف على السؤال ، لكننا بحاجة إلى منع برامج البريد العشوائي.

CloudFilt هي ملكية حصرية لشركة ZIWIT SAS ، وهي شركة برأس مال قدره 190 ألف يورو ، ومسجلة في السجل التجاري والشركات في مونبلييه تحت رقم B 525202917 ومقرها الرئيسي في 40 Avenue Théroigne de Méricourt 34000 MONTPELLIER FRANCE.

هاتف: +33.805.693.333
الفاكس: +33.411.934.504.70
البريد الإلكتروني: [email protected]
مدير النشر: السيد محمد بومديان ، رئيس ZIWIT SAS

يخضع ZIWIT SAS للقانون الفرنسي.
المضيف: ZIWIT SAS، 40 Avenue Théroigne de Méricourt، 34000 MONTPELLIER، France
لأية شكاوى حول هذا الموقع و / أو محتواه: [email protected]

لاحترام الحياة الخاصة لمستخدميها ، تلتزم CanFilt بضمان أن يتم جمع واستخدام المعلومات الشخصية ، التي يتم إجراؤها في هذا الموقع الحالي ، وفقًا للقانون المعدل اعتبارًا من 6 يناير 1978 ، فيما يتعلق بالحوسبة والملفات والحرية ، لذلك يسمى قانون "الحوسبة والحريات".

لهذا السبب ، يتم إبلاغ مستخدم هذا الموقع أن هذا الاستخدام التلقائي للمعلومات قد تم الإعلان عنه إلى اللجنة الوطنية للحساب والحريات (CNIL) تحت المرجع رقم 1587953 بتاريخ 16/05/2012.

وفقًا للقانون المعدل اعتبارًا من 6 يناير 1978 ، يحق للمستخدم الوصول إلى بياناته الشخصية والاعتراض عليها وتعديلها. يمكن ممارسة هذا الحق عن طريق الكتابة إلى ZIWIT SAS (40 Avenue Théroigne de Méricourt 34000 MONTPELLIER FRANCE) ، بما في ذلك نسخة من وثيقة هويته مع الإشارة إلى اسمه الأول ولقبه وعنوانه.


الكهربائي

هلام الكهربائي

الرحلان الكهربائي للهلام هو رحلان كهربائي للمنطقة في مصفوفة هلامية خاملة كيميائيًا ، مثل بولي أكريلاميد أو الاغاروز. يتم تطبيق العينة في حجم صغير كمنطقة ضيقة ، على سبيل المثال ، في فتحات هلام. مع تطبيق المجال الكهربائي ، ينتقل كل مكون من مكونات العينة وفقًا لحركته الخاصة في وسط هلامي ذي درجة حموضة ثابتة وقوة أيونية. يتم تحقيق الفصل إلى "مناطق نقية" من خلال تعظيم المعدل التفاضلي للهجرة ، مع تقليل انتشار المنطقة (التشتت) بسبب الحمل الحراري والانتشار.

في الوقت الحاضر ، هناك ثلاثة أشكال هندسية مختلفة يمكن من خلالها تنفيذ الرحلان الكهربائي للهلام: ألواح أفقية ، أو ألواح عمودية ، أو أسطوانات عمودية (قضبان) من الجل ، وغالبًا ما يشار إليها أيضًا باسم هلام الأنبوب. يُفضل استخدام الألواح الهلامية في الطبقات الرقيقة على الألواح السميكة أو المواد الهلامية الأنبوبية ، لأنها توفر فصلًا أسرع ، ومناطق أكثر حدة ، وتبريدًا أكثر سرعة وكفاءة وتلطيخًا لاحقًا. في الرحلان الكهربي PAG ، هناك تفضيل واضح للنظام الأفقي الذي يستخدم طبقات هلامية فائقة الرقة مبلمرة إلى رقائق حاملة. تتمثل مزايا الأنظمة الأفقية مقابل الأنظمة الرأسية في سهولة التعامل ، واستخدام المواد الهلامية المُصنَّعة مسبقًا ، والتبريد الأكثر كفاءة ، وتكاليف المواد المنخفضة ، وتوافر أنظمة مؤتمتة بالكامل ، والمرونة تجاه الأشكال الأخرى من الرحلان الكهربائي مثل التركيز الكهربي.

الرحلان الكهربائي PAG

الرحلان الكهربائي PAG (PAGE) هو الطريقة الأكثر استخدامًا في تحليل المخاليط المعقدة من البروتينات. يمكن تصنيف PAGE من البروتينات على نطاق واسع بالطريقة التالية:

أنظمة متجانسة مع جل فصل واحد فقط وباستخدام وسائط عازلة مستمرة.

أنظمة متعددة الأطوار (غير متصلة) ، حيث يتم وضع هلام التراص ، وهو جل مسام كبير غير مقيد ، فوق هلام الفصل ، وهو هلام ذو مسام صغيرة. كل طبقة هلامية مصنوعة من مخازن مختلفة ، والتي قد تختلف في درجة الحموضة ، و / أو حركة الأيونات ، و / أو القوة الأيونية (الموصلية).

في هلام التراص لنظام متعدد الأطوار ، يتم فصل مكونات العينة في وضع الرحلان المتساوي مع عدم وجود تأثير الغربلة الجزيئية. بعد تجاوز الحد بين التراص وفصل الهلام ، يتم بعد ذلك فصل مكونات العينة حسب الحجم والشحنة بالطريقة المعتادة. ترجع قوة الحل العالية جدًا لهذه الطريقة ، والتي يشار إليها غالبًا باسم القرص PAGE ، إلى تكوين مناطق حادة جدًا ينتجها هلام وانقطاع المخزن المؤقت. يجعل إنتاج مناطق البدء الرقيقة القرص PAGE مناسبًا جدًا للاستخدام مع حلول العينات المخففة.

يوفر Gradient PAGE دقة تفوق تلك الموجودة في هلام بتركيز واحد. يمكن صب بولي أكريلاميد في ألواح أو أنابيب يزيد فيها تركيز مادة الأكريلاميد بشكل مستمر (على سبيل المثال ، خطي أو مقعر) على طول الهلام ، مما يؤدي إلى زيادة تأثير الغربلة بسبب انخفاض حجم المسام.

تعد PAGE من البروتينات الغذائية أكثر فاعلية في وجود SDS للمنظف الأنيوني. يلتف SDS حول العمود الفقري متعدد الببتيد ، ويفكك مجاميع البروتين غير التساهمية (الثنائيات ، الرباعية ، إلخ) ، ويلغي الاختلافات في الشحنة الذاتية للبروتينات. بهذه الطريقة ، يحول SDS البروتينات إلى قضبان ذات شحنات سالبة بكثافة شحنة متساوية ، أي أنه يمنح شحنة سالبة لسلاسل البولي ببتيد بما يتناسب مع طولها ويضفي نفس القدرة على نقل المحلول المجاني لجميع البروتينات ، بغض النظر عن هويتها. يحدث فصل البروتينات المشوهة SDS بشكل أساسي عن طريق تأثيرات الغربلة ، مع انتقال البروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض بسرعة أكبر عبر الهلام. يمكن مقارنة معدل هجرة البروتين بمعدل هجرة البروتينات المعيارية ذات الوزن الجزيئي المحدد ، ويمكن الحصول على تقديرات دقيقة إلى حد ما للوزن الجزيئي للبروتين. بالاقتران مع تدرجات حجم المسام والأنظمة العازلة غير المستمرة ، يمكن أن تكون SDS-PAGE طريقة أكثر قوة وفعالية لفصل البروتين.

نظرًا لأن SDS-PAGE يفصل الجزيئات وفقًا للحجم ، فهي تقنية مفضلة للغاية في إعداد خرائط البروتين ثنائية الأبعاد ، خاصة عند اقترانها بطريقة الفصل بشكل أساسي وفقًا لاختلافات الشحن في البعد الثاني.


الملخص

كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) هي واحدة من الكواشف المختبرية الأكثر شيوعًا المستخدمة في استخراج العينات البيولوجية ، ومع ذلك ، فإن وجود هذا الكاشف في العينات يتحدى تحليلات البروتينات القائمة على LC-MS لأنه يمكن أن يتداخل مع فصل LC عكسي الطور والتأين بالرش الكهربائي. تشير هذه الدراسة إلى طريقة بسيطة لإعداد عينة البروتينات بمساعدة SDS والتي تم تسهيلها بواسطة خطوة إزالة SDS جديدة على مستوى الببتيد. في عرض توضيحي أولي ، تمت إزالة SDS بشكل فعال (& gt99.9٪) من عينات الببتيد من خلال DS بوساطة استبدال الأيونات - الترسيب باستخدام كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، ولوحظ استخلاص الببتيد الممتاز (& gt95٪) لـ & lt20 ميكروغرام من الببتيدات. أظهرت تجارب أخرى توافق هذا البروتوكول مع تحليلات LC-MS / MS. كانت التغطية البروتينية الناتجة التي تم الحصول عليها لكل من أنسجة الثدييات والعينات البكتيرية مماثلة أو أفضل من تلك التي تم الحصول عليها لنفس أنواع العينات المحضرة باستخدام طرق تحضير البروتينات القياسية وتحليلها باستخدام LC-MS / MS. تشير هذه النتائج إلى أن البروتوكول المدعوم بـ SDS هو طريقة معالجة عينة بروتينية عملية وبسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع ، والتي يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص عند التعامل مع العينات التي يصعب حلها بطرق أخرى.


SDS PAGE المعروف أيضًا باسم Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis هي تقنية تستخدم لفصل البروتينات على أساس وزنها الجزيئي. إنها تقنية مستخدمة على نطاق واسع في الطب الشرعي وعلم الوراثة والتكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا الجزيئية لفصل جزيئات البروتين على أساس حركتها الكهربي.

مبدأ SDS-PAGE

ينص مبدأ SDS-PAGE على أن الجزيء المشحون يهاجر إلى القطب مع الإشارة المعاكسة عند وضعه في مجال كهربائي. سيتم الفصل على أنه تنقل الأنواع المشحونة. تميل الجزيئات الصغيرة إلى التحرك بشكل أسرع بسبب مقاومتها الأقل في وقت الرحلان الكهربائي. يؤثر معدل الهجرة على هيكل وشحنة البروتين.

تساعد كبريتات دوديسيل الصوديوم وبولي أكريلاميد على القضاء على تأثير بنية البروتينات وشحنها ، ويتم فصل البروتينات بناءً على طول سلسلة البولي ببتيد.

وظيفة SDS في SDS-PAGE

يمكن تعريف SDS على أنه منظف موجود في المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE. تتمثل وظيفة SDS في كسر روابط ثاني كبريتيد البروتينات التي تعطل البنية الثلاثية للبروتينات جنبًا إلى جنب مع بعض عوامل الاختزال.

المواد المطلوبة

مزودات الطاقة: يستخدم لتحويل التيار المتردد إلى تيار مستمر.

المواد الهلامية: يتم تحضيرها ذاتيًا في المختبر أو يتم شراؤها من السوق.

غرف الرحلان الكهربائي: يجب استخدام غرف المواد الهلامية SDS-PAGE الملائمة جيدًا.

عينات البروتين: يذوب البروتين مع محلول SDS-PAGE ويغلى لمدة 10 دقائق. يتم أيضًا إضافة عامل الاختزال مثل ثنائي ثيوثريتول أو 2-مركابتوإيثانول لتقليل روابط ثاني كبريتيد لمنع أي طي للبروتين العالي.

تشغيل المخزن المؤقت: يتم تشغيل عينات البروتين المملوءة على الجل في المخزن المؤقت للتشغيل SDS-PAGE.

محلول التلوين والوجه: يستخدم محلول البقع Coomassie للتلوين. يتم استخدام محلول تقضي على مادة هلامية. يمكن بعد ذلك ملاحظة عصابات البروتين بالعين المجردة.

سلم البروتين: يتم استخدام سلم البروتين المرجعي لتحديد البروتين المطلوب بناءً على الحجم الجزيئي.

بروتوكول SDS-PAGE

تحضير الجل

يتم الجمع بين جميع الكواشف ، باستثناء TEMED ، لتحضير الجل.

عندما يكون الجل جاهزًا للوضع ، أضف TEMED.

يُسكب الجل المستخدم للفصل في غرفة الصب.

تحتاج إلى وضع البيوتانول قبل البلمرة لإزالة فقاعات الهواء غير المرغوب فيها الموجودة.

بين اللوح الزجاجي ، يتم إدخال المشط.

"الكاسيت الهلامي" عبارة عن جل مبلمر.

اغلي بعض الماء في دورق.

أضف 2-مركابتويثانول إلى المخزن المؤقت للعينة.

ضع محلول العازلة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وأضف عينات البروتين إليها.

خذ علامات MW في أنابيب منفصلة.

اترك العينات تغلي لمدة أقل من 5 دقائق لتفسد البروتينات تمامًا.

الكهربائي

يتم إخراج علبة الهلام من حامل الصب وتوضع بشكل منفصل في مجموعة القطب الكهربي.

تم تثبيت حامل المشبك على مجموعة القطب.

يضاف عازلة 1X الكهربائي إلى فتحة إطار الصب لملء آبار الهلام.

احتواء 30 مل من العينة المشوهة في البئر.

الخزان مغطى بغطاء والوحدة متصلة بمصدر طاقة.


أهمية تحضير العينة واختيار الجل المناسب لـ SDS-PAGE

من المعروف على نطاق واسع أن المواد الهلامية مسبقة الصب أو المصنوعة يدويًا من البروتين خاملة كيميائيًا ولا تسبب تعديلات في البروتين أثناء الرحلان الكهربي. ومع ذلك ، فقد أبلغت منشورات متعددة عن تعديل كيميائي للسلاسل الجانبية للأحماض الأمينية أثناء فصل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربي ، بما في ذلك deamidation ، وانقسام رابطة الأسبارتات والبرولين ، وأكسدة الميثيونين والتربتوفان ، وإضافة مايكل لمجموعات السلفهيدريل أو الأمينية إلى الرابطة المزدوجة للأكريلاميد التي غير مبلمر في مصفوفة الهلام. يمكن أن تغير هذه التعديلات التنقل الكهربي للبروتينات مما يؤدي إلى عدم وضوح أو نطاقات متعددة وتكون ضارة لتطبيقات البحث المصب. على سبيل المثال ، ينتج عن قياس الطيف الكتلي لعينة البروتين المعدلة ظهور الببتيدات المتوقعة في عدة كتل بسبب تنوع التعديلات غير المرغوب فيها. يمكن أن يساعد اختيار كيمياء الهلام المناسبة لتطبيق بحث معين في تقليل تعديل البروتين. على سبيل المثال ، يوصى باستخدام المواد الهلامية ذات الأس الهيدروجيني المحايد Bis-Tris للعينات ذات الوفرة المنخفضة من البروتينات المستهدفة أو عندما تتطلب تطبيقات المصب سلامة عالية للبروتين (قياس الطيف الكتلي أو تعديل ما بعد الترجمة أو تسلسل البروتين). وبالمثل ، يمكن حل البروتينات عالية الوزن الجزيئي (حتى 500 كيلو دالتون) على النحو الأمثل باستخدام المواد الهلامية Tris-Acetate بينما يمكن حل البروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض (منخفضة تصل إلى 2.5 كيلو دالتون) على النحو الأمثل باستخدام المواد الهلامية Tricine. ستسلط هذه الندوة عبر الويب الضوء على تعديلات البروتين المختلفة التي تحدث أثناء الرحلان الكهربائي ، وأهمية الرقم الهيدروجيني في سلامة العينة ، وكيفية اختيار كيمياء الهلام المناسبة لتطبيقات بحثية محددة ، وكيفية إدخال كيمياء الهلام الجديدة الصحيحة في سير عمل البحث. أهداف التعلم كيفية اختيار كيمياء الهلام مسبقة الصب المناسبة لتطبيقك البحثي المحدد. لماذا تعتبر كيمياء هلام Bis-Tris مثالية لتطبيقات التعديل بعد الترجمة. لماذا لا تعتبر كيمياء هلام Tris-glycine مثالية لجميع تطبيقات البحث.


ما & # 8217s في المخزن المؤقت لتحميل البروتين؟

ماذا سيكون كاشف البيولوجيا الجزيئية بدون المخزن المؤقت؟ ليس جيدًا كثيرًا ، أتخيل.

يحتوي المخزن المؤقت لتحميل البروتين على اثنين من المكونات المفيدة التي تسمح لك بتحميل وتتبع البروتينات بسهولة أثناء الرحلان الكهربائي. والأهم من ذلك ، أن المخزن المؤقت يحتوي أيضًا على عوامل تفسد طبيعة البروتينات وتضمن أن البروتينات تنفصل حسب الحجم في الهلام. يتم خلط جميع المكونات مع محلول جل لصنع محلول مخزون مركّز يتم تخفيفه بعينات البروتين الخاصة بك.

المكون الأكثر وضوحا لمخزن التحميل هو الصبغة التي يمكن رؤيتها بالعين المجردة. تساعدك الصبغة على التأكد من إسقاط عيناتك في الآبار الصحيحة وتتيح لك تتبع تقدم عملية الرحلان الكهربائي. الصبغة الأكثر استخدامًا هي البروموفينول الأزرق (تركيز BPB النهائي 0.01-0.02٪). يحتوي BPB على شحنة سالبة قليلاً أثناء الرحلان الكهربائي وسوف يهاجر في نفس اتجاه البروتينات الخاصة بك. يتحرك مع الجبهة الأيونية ، لذلك لا يمثل & # 8217t بروتينًا معينًا في حد ذاته، ولكن بمثابة علامة على الرحلان الكهربي.

في المقابل ، يحتوي Visio على صبغة ترتبط بكل بروتين في العينة ، بحيث يمكنك مشاهدة البروتينات الفردية وهي تنتقل عبر الهلام.

الجلسرين

هل تساءلت يومًا عن سبب عدم طفو عيناتك في المخزن المؤقت عند تحميلها في الآبار؟ أشكر السيد جلسرين على ذلك - بطل مجهول في المخزن المؤقت لتحميل البروتين! هذه المادة الخاملة ليس لها علاقة بالكيمياء المرتبطة بالرحلان الكهربائي ، ولها علاقة كبيرة بجعل حياتك أسهل. يعد الجلسرين (10٪ وزن / حجم) أكثر كثافة من المخزن المؤقت الجاري ، مما يسمح للعينات الخاصة بك بالغرق & # 8220 & # 8221 أسفل الآبار بدلاً من الانتشار في المخزن المؤقت.

تضع كبريتات دوديسيل الصوديوم (تسمى أحيانًا كبريتات لوريل الصوديوم) SDS في SDS-PAGE. يذوب SDS المناطق الكارهة للماء من البروتينات ويكسر الروابط الأيونية غير التساهمية. هذا يجعل البروتينات تفقد بنيتها الكروية وتصبح خطية. تغلف SDS البروتينات أيضًا ، مما يمنحها شحنة سالبة موحدة تتناسب مع وزنها الجزيئي. هذا ينفي أي آثار قد يكون لشحنة البروتينات على معدل الهجرة. يتم توفير SDS بكمية كافية لتشبع معظم البروتينات - 2 ٪.

تقليل الوكلاء

للتأكد من تكسير البروتينات بالكامل إلى أشكالها الخطية ، يحتوي المخزن المؤقت لتحميل البروتين أيضًا على أحد عوامل تقليل الرائحة الكريهة - عادةً بيتا مركابتوإيثانول (5٪) أو ديثيوثريتول (DTT 0.3M). عوامل الاختزال تكسر روابط ثاني كبريتيد التي تعطل الترابط داخل الجزيئات وفيما بينها.


هلام الكهربائي

7.1.8 تحضير العينة قبل SDS-PAGE

SDS-PAGE هو أكثر شاقة من الرحلان الكهربائي [اغروس) عندما يتعلق الأمر بإعداد الهلام والعينة. يجب تقليل البروتينات (يجب تعطيل روابط ثاني كبريتيد) قبل SDS-PAGE باستخدام عوامل الاختزال الشائعة مثل dithiothreitol (DTT) و beta-mercaptoethanol (BME) و dithioerythritol (DTE) و tris 2-carboxyethyl phosphine (TCEP). يضاف اليودواسيتاميد لمنع مجموعات الثيول الحرة.

التركيز العالي للملح غير مرغوب فيه في أي نوع من عينات الرحلان الكهربي لأنه يرفع التيار أثناء عملية الفصل. نتيجة لذلك ، لوحظ وجود مسحات ونطاقات غير متجانسة ، وكذلك ترسيب البروتين. يجب تطبيق تركيز العينة المناسب للحصول على نتائج عالية الدقة وذات جودة عالية. علاوة على ذلك ، يمكن أن يتداخل وجود البروتينات الوفيرة مع مكونات العينة التي يمكن العثور عليها بتركيزات طفيفة. لا يمكن أن تكون كمية كل مكون أعلى من 10 ميكروغرام. المكملات مع الجلسرين ، إلى جانب صبغة البروموفينول الزرقاء ، تجعل تطبيق العينة أكثر ملاءمة. يعمل الجلسرين كوزن للعينة المطبقة ، حيث تسمح الصبغة بالتخيل بالإضافة إلى مراقبة الأس الهيدروجيني. باختصار ، يعتمد تحضير عينة SDS-PAGE أساسًا على إذابة البروتين وتمسخه.


شكر وتقدير

تم توفير الأدوات والكواشف الخاصة بـ CE-SDS و Simple Western بواسطة ProteinSimple ، وهي علامة تجارية لشركة Bio-Techne. نود أن نشكر Udo Burger و Susanne Doerks و Chris Heger على دعمهم الهائل. نود أن نشكر معهد البيولوجيا الصيدلانية بجامعة Technische Universität Braunschweig على توفيره للتصوير وفريق عمل الأستاذ الدكتور أوت من معهد الكيمياء الطبية والصيدلانية في جامعة براونشفايغ التقنية لإقراضنا نظام SDS-PAGE بيو راد. علاوة على ذلك ، نود أن نشكر ولاية ساكسونيا السفلى على تقديم الزمالة لريبيكا ويزنر. للدعم الفني والنصائح ، نشكر Holger Zagst و Matthias Stein. نود أن نشكر Nordilyn Lorenz على إعداد العينات وأداء العديد من التجارب على SDS-PAGE و CE-SDS و Simple Western.

تم تمكين تمويل الوصول المفتوح وتنظيمه بواسطة Projekt DEAL.

يحب Hermann Wätzig أن يذكر ، أنه يقف على اتصال وثيق وودود للغاية مع ProteinSim simple لفترة طويلة. لم يعلن الكتاب أي تضارب آخر في المصالح.

اسم الملف وصف
elps7314-sup-0001-SuppMat.docx2.2 ميجا بايت ملف المعلومات الداعمة: مقارنة بين MWs المرجعية وفقًا لمواصفات الشركة المصنعة مع MWs من UniProt Influence للعديد من المخازن المؤقتة للعينات على تحديد MW بنسبة 10 ٪ SDS-PAGE تأثير درجة حرارة التمسخ على تحديد MW على CE-SDS (ن = 3) تأثير درجة حرارة التمسخ على تحديد MW بواسطة CE-SDS و Simple Western (ن = 3) تأثير عوامل الاختزال على تحديد MW بواسطة CE-SDS و Simple Western (ن = 3) تم تقليل الرسوم البيانية الكهربية لفصل CE-SDS لماتوزوماب مع عوامل اختزال مختلفة و Matuzumab غير مخفضة مقارنة لعلامات MW لخمسة شركات مصنعة مختلفة بنسبة 10٪ SDS-PAGE ، مخطط كهربية لعلامات M5 على CE-SDS ، الانحدار الخطي المؤامرات بناءً على MW مقابل مسافة الترحيل النسبية (Rf) على التوالي وقت الترحيل النسبي المتبادل (RMT) لعلامات MW باستخدام مثال Precision Plus Protein Standard من Bio-Rad ، MW Marker Maurice CE-SDS بواسطة ProteinSimple ، ProteomeLab ™ MW معيار التحجيم من Sciex ، معيار البروتين غير الملوث من New England Biolabs وسلم البروتين غير الملوث Benchmark ™ من Novex بواسطة تقنيات الحياة.

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


شاهد الفيديو: Scary Teacher 3D u0026 Nick Super vs ZombieHulk Zomboss Animation. Coffin Dance COVER (كانون الثاني 2022).