معلومة

ما هي حياة الدوائر الجينية الخالية من الخلايا؟

ما هي حياة الدوائر الجينية الخالية من الخلايا؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل يمكن اختبار الدوائر الجينية في بيئة خالية من الخلايا؟ ماذا ستكون حياتهم إذا أبقيناهم في درجة حرارة الغرفة؟

يشار إلى الدوائر التي تتكون من مكونات قائمة على الحمض النووي عادة باسم الدوائر الجينية. من خلال الاختبار ، قصدت أن أقول اختبار سلوكه ، أي تطبيق إشارات الإدخال (ربما بروتينات) لمعرفة ما إذا كان يولد إشارة خرج (بروتين آخر ، قد يكون بروتين فلوري).

عن طريق الحياة ، قصدت أن أقول ، إلى متى يمكن لمثل هذه الدائرة (التي تحتوي على سلاسل من الحمض النووي) أن تعيش في درجة حرارة الغرفة العادية.


البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا: الهندسة في عالم مفتوح

تظهر البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا كتقنية تمكين قوية ومرنة يمكنها هندسة الأجزاء والأنظمة البيولوجية لتطبيقات علوم الحياة دون استخدام الخلايا الحية. إنه يوفر حلولًا هندسية أبسط وأسرع مع حرية تصميم غير مسبوقة في بيئة مفتوحة مقارنة بنظام الخلية. تركز هذه المراجعة على التطورات الأخيرة في البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا في مجالات الهندسة البيولوجية على المستويات الجزيئية والخلوية ، بما في ذلك هندسة البروتينات ، وهندسة التمثيل الغذائي ، وهندسة الخلايا الاصطناعية. في هندسة البروتينات الخالية من الخلايا ، يسمح التحكم المباشر في ظروف التفاعل في النظام الخالي من الخلايا بالتركيب السهل للبروتينات المعقدة والبروتينات السامة والبروتينات الغشائية والبروتينات الجديدة ذات الأحماض الأمينية غير الطبيعية. توفر الأنظمة الخالية من الخلايا القدرة على تصميم مسارات التمثيل الغذائي لإنتاج المنتجات المرغوبة. سيؤدي تراكم الخلايا الاصطناعية القائمة على أنظمة خالية من الخلايا إلى تحسين فهمنا للحياة واستخدامها في التطبيقات البيئية والطبية الحيوية.


منذ أن تم اكتشاف أن مستوى أيونات الكالسيوم داخل الخلية يمكن أن يتأرجح (وودز وآخرون ، 1986) ، كان علماء الأحياء مفتونين بالطبيعة الدورية للعديد من الإشارات الخلوية. بينما نبدأ ببطء في فهم الأدوار العديدة والمتنوعة التي تلعبها هذه التذبذبات الدورية في الاتصال الخلوي ، يبقى سؤال مفتوح: كيف يمكن لشبكات الجينات أن تولد تذبذبات مستمرة؟ الآن ، في eLife ، أفاد سيباستيان ميركل وزملاؤه - بما في ذلك Henrike Niederholtmeyer و Zachary Sun كمؤلفين أول مشتركين - أنهم استخدموا نهج البيولوجيا التركيبية للكشف عن كيف يمكن للدوائر الجينية البسيطة أن تنتج اهتزازات قوية في الخلايا (Niederholtmeyer et al. ، 2015).

في البداية ، قيل إن التذبذبات الدورية في مستوى أيونات الكالسيوم والمكونات الخلوية الأخرى ليس لها دور في إرسال الإشارات ، لكن عقودًا من البحث كشفت أن الإشارات الدورية أفضل في نقل المعلومات من الإشارات غير الدورية (Rapp، 1987 Behar and Hoffman) ، 2010 Purvis and Lahav، 2013 Levine et al.، 2013). يمكن لكلا النوعين من الإشارات ترميز المعلومات في حجم (اتساع) الإشارة ، ولكن يمكن أيضًا للتردد والمرحلة للإشارات الدورية تشفير المعلومات. نتيجة لذلك ، قد تكون الإشارات الدورية قادرة على تنظيم العمليات الخلوية المعقدة بشكل أكثر دقة من الإشارات غير الدورية. الأهم من ذلك ، أن التطورات الحديثة في تحليل الخلية الواحدة وعلم البصريات الوراثي قد أدت إلى العديد من الدراسات المتعمقة التي تكشف عن كيفية التحكم في الأحداث الحرجة ، مثل تحديد مصير الخلية والتواصل متعدد الخلايا ، بواسطة إشارات دورية (مراجعة بواسطة Sonnen and Auleha ، 2014 يصف أمثلة أخرى).

يُظهر التحليل الرياضي أن أحد العناصر الأساسية للدائرة المتذبذبة هو حلقة ردود الفعل المثبطة: إذا زاد نشاط جين واحد في حلقة التغذية الراجعة ، فإنه ينشط الجينات الأخرى في الدائرة التي تمنعه ​​في النهاية (Rapp، 1987 Novak and Tyson، 2008 بورسيل وآخرون ، 2010). تحتاج حلقة التغذية الراجعة هذه إلى تأخير زمني مدمج لتمكين أنشطة الجينات في الدائرة من التقلب في الدورات المنتظمة.

جعل ظهور البيولوجيا التركيبية من الممكن تصميم وبناء شبكات تركيبية في الخلايا الحية التي تؤدي دورًا محددًا. في مثال مبكر على ذلك ، ذكر باحثون في جامعة برينستون أنهم أنشأوا شبكة جينات متذبذبة في بكتريا قولونية استنادًا إلى شبكة دورية من ثلاثة جينات تسمى المكبِع (Elowitz and Leibler ، 2000 الشكل 1). تتنبأ النظرية بأن المكبِع ومذبذبات الحلقة الأخرى التي تحتوي على عدد فردي من الجينات (العقد) يجب أن تكون قادرة على إنتاج تذبذبات مستمرة. ومع ذلك ، نظرًا لأن تصميم وبناء واختبار شبكات جينية جديدة في الخلايا الحية عملية طويلة ، لم يتم الإبلاغ عن مذبذبات الحلقة التي تحتوي على أكثر من ثلاث عقد.

شبكات الجينات الاصطناعية التي تحتوي على ثلاثة وأربعة وخمسة جينات.

يتم ترجمة الجينات في كل دائرة (أعلى) إلى منتجات بروتينية ، حيث يقوم كل منتج بروتيني بقمع نشاط جين آخر في الشبكة (كما هو موضح بواسطة الأسهم). تتنبأ النظرية بأن شبكات الجينات الدورية تعرض سلوكًا تذبذبًا عندما يكون عدد العقد في الشبكة غريبًا. نيدرهولتمير وآخرون. وجد أن دائرة تتكون من ثلاثة جينات أدت إلى تذبذبات محددة جيدًا لمدة تصل إلى 8 ساعات ، وأن الدائرة التي تحتوي على خمسة جينات تتأرجح مع فترة 19 ساعة. في المقابل ، وتماشياً مع التوقعات النظرية ، لم تتأرجح الشبكة المكونة من أربع عقد: وبدلاً من ذلك وصلت إلى حالة مستقرة حيث كان نشاط جميع الجينات ثابتًا بمرور الوقت.

الآن ، قام ميركل وزملاؤه - الذين يوجد مقرهم في École Polytechnique Fédérale de Lausanne ومعهد كاليفورنيا للتكنولوجيا - بتصميم حلقات تحتوي على ثلاثة وأربعة وخمسة جينات (الشكل 1). قاموا ببناء نماذجهم الأولية للدارات الجينية في نظام خالٍ من الخلايا عن طريق الجمع بين مفاعلات تدفق الموائع الدقيقة مع مقتطفات من بكتيريا E. coli (Niederholtmeyer et al، 2013 Noireaux et al.، 2003). الميزة الرئيسية لهذا النهج هي أنه يقلل بشكل كبير من الوقت المستغرق لكل دورة تصميم - بناء - اختبار لأنه يلغي الحاجة إلى العديد من المهام الشاقة ، مثل الاستنساخ الجزيئي وجمع القياسات من الخلايا الفردية.

باستخدام هذه الإستراتيجية Niederholtmeyer ، Sun et al. كانت قادرة على تأكيد التنبؤ بأن المذبذبات ذات العقد الثلاثة أو الخمس قادرة على توليد التذبذبات ، في حين أن المذبذبات ذات العقد الأربعة ليست كذلك. تبلغ فترة مذبذب العقد الخمس حوالي ضعف طول مذبذب العقد الثلاثة ، مما يشير إلى أن الخلايا يمكنها ضبط وتيرة الإشارات عن طريق زيادة تعقيد دوائرها الجينية. بعد ذلك ، نقل الباحثون تصميماتهم النموذجية إلى الحياة بكتريا قولونية وأظهرت أن فترة التذبذب في الخلايا تتطابق مع فترة التذبذب في الأنظمة الخالية من الخلايا. هذه نتيجة مهمة لأنها تُظهر أنه يمكن استخدام الأنظمة الخالية من الخلايا لالتقاط سلوك الخلايا بدقة ، مما يمهد الطريق للباحثين لاستخدام مناهج البيولوجيا التركيبية في الأنظمة الخالية من الخلايا لاستكشاف الآليات التنظيمية المعقدة التي تعمل داخل الخلايا. (فان رويكل وآخرون ، 2015). يجب أن يُسرع العمل الأخير بشكل كبير في بناء شبكات جينية معقدة جديدة في البكتيريا ، والتي يمكن أن يكون لها تطبيقات في إنتاج الوقود الحيوي ، والتشخيص الطبي والتجارب لاستكشاف الطرق التي تعالج بها الخلايا المعلومات.


تصور الدوائر الجينية في المكان والزمان ، بترجمة ورقية خالية من الخلايا

نحن زوجان من العلماء في مختبر مجلس البحوث الطبية للبيولوجيا الجزيئية (MRC LMB) ، متحمسون لمساعدة الطلاب على التعرف على العلوم الحديثة.

تعتبر البيولوجيا التركيبية مثيرة للاهتمام بشكل خاص بالنسبة لنا لأن كلانا يعمل في طليعة هذا المجال ونقدر كيف تحول علم الأحياء إلى تخصص هندسي أكثر ، حيث نتعلم عن الحياة من خلال بناء أنظمة بيولوجية. نفس المبدأ ، أي تعلم علم الأحياء من خلال القيام بذلك ، فعال للغاية لدراسة المفاهيم المعقدة في المدارس. ومع ذلك ، فإن إجراء تجارب البيولوجيا التركيبية الحديثة في الفصل الدراسي يعد نشاطًا مكلفًا ، بسبب الكواشف والوسائط والبكتيريا وأدوات المختبر اللازمة ، ناهيك عن عبء الأعمال الورقية للتعامل مع الكائنات المعدلة وراثيًا.

نعتقد أن تدريس العلوم الحديثة يمكن أن يكون متاحًا ورخيصًا ومباشرًا. نحن لسنا وحدنا في هذا وهناك تطورات مهمة تم إجراؤها بواسطة Amino Labs والتكنولوجيا الخالية من الخلايا و Biobits ، والتي تسعى لتحقيق نفس الهدف الذي نسعى إليه: جعل العلم المتطور متاحًا وبأسعار معقولة. لقد اخترنا العمل مع نظام ترجمة النسخ الخالي من الخلايا (TXTL) لأنه رخيص الصنع ، وليست هناك حاجة إلى لوائح السلامة وهي قابلة للتخصيص بدرجة كبيرة: الشيء الوحيد الذي تحتاجه هو التركيب الجيني.

هدفنا هو تعليم الطلاب مبادئ التحكم الجيني ، أساس علم الأحياء التركيبي. أول ما أدهشنا هو السهولة التي يدرس بها الأطفال الدوائر الكهربائية عن طريق توصيل الأجزاء الكهربائية بالسلاسل مباشرة وتجريبها. أردنا تكرار هذا المنطق في علم الأحياء. لحسن الحظ ، تم بالفعل وضع المبادئ الرئيسية للتنظيم الجيني مع وضع الهندسة الكهربائية في الاعتبار أن قطعة اللغز الوحيدة المفقودة: لربطها ماديًا على لوح التجارب.

الشكل أ: نظام ترجمة النسخ الخالي من الخلايا (TXTL) باستخدام ورق الترشيح

من المفترض أن يكون TXTL مزيجًا سحريًا ينتج عمليا أي جزء وراثي (مثل البروتين الفلوري الأخضر أو ​​T7 RNA polymerase). كدعم مادي حيث يتم احتواء التفاعل ، اخترنا ورق ترشيح. كانت الفكرة هي تحويل هذه القطع من الورق إلى وحدات وظيفية عن طريق التعبير عن البروتينات فيها. لذلك ، فإن توصيل قطع الورق لاحقًا سيسمح للبروتينات المعبر عنها بالانتقال من قطعة ورقية إلى أخرى مع تدفق الماء (الشكل أ).

في النهاية ، يمكن للبروتين المعبر عنه في وحدة واحدة أن يؤثر على التفاعل في الوحدة الأخرى. يبسط هذا الإعداد التجريبي دراسة الدوائر الجينية ، حيث يتم فصل المشغلات ونواتج الدائرة ماديًا ، وبالتالي ، من الناحية النظرية ، يجب أن يكون التعامل مع هذا النوع من النظام أسهل من التعامل مع خليط الصندوق الأسود في الأنبوب. أيضًا ، الاحتمالات لا حصر لها عمليًا لأن هذا النظام قابل للتخصيص بدرجة كبيرة ويمكن توصيل القطع بأي طريقة من شأنها أن تساعد الأطفال على تجربة المواد بطريقة غير مقيدة.

الشكل (ب): مقارنة النشاط بين المزيج التجاري (Promega T7 عالي الغلة S30) والداخلية بكتريا قولونية خليط.

بدأ المشروع بإنتاج مادة TXTL عالية النشاط بكتريا قولونية مخاليط. لمساعدة المختبرات الأخرى التي لديها إمكانية الوصول إلى المعدات الأساسية فقط ، استخدمنا بروتوكولًا رخيصًا وسهلاً لإعداد المستخلصات الخلوية ، بحيث يكون عملنا قابلاً للتكرار بسهولة. لقد أعددنا مستخلصات الخلايا إما تقليديًا باستخدام مكبس فرنسي (Emulsiflex) وطرد مركزي عالي السرعة ، أو باستخدام نهج أرخص وأكثر انسيابية باستخدام تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية وطرد مركزي مبرد على سطح الطاولة. بغض النظر عن البروتوكول الذي استخدمناه لإعداد بكتريا قولونية lysate ، كان النشاط على قدم المساواة مع الخليط التجاري (Promega T7 عالي الغلة S30) (الشكل B).

الشكل ج: تظهر مخاليط TXTL نشاطًا في المحلول أكثر من الورق.

بدأت التحديات عندما حاولنا تشغيل تفاعل TXTL على الورق: تكون الخلائط الخالية من الخلايا نشطة دائمًا في الحل ، بينما تعطي نظيرتها الورقية إشارة منخفضة فقط لا يمكن تصورها إلا باستخدام أجهزة باهظة الثمن وبالتالي لا يمكن استخدامها في أي بيئات منخفضة الموارد (الشكل ج).

في الوقت الحالي ، وجدنا بديلاً قابلاً للتطبيق ومناسبًا للتوعية: على عكس تجفيف TXTL بالتجميد على الورق ، نقوم بتجميد TXTL وتجفيفه في الأنبوب. من المثير للدهشة أن خليط التفاعل كان نشطًا مثل المزيج الأصلي ، ووفقًا للتقارير السابقة ، احتفظت مكونات التفاعل بنشاطها لأسابيع وحتى شهور. وبالتالي ، فإننا نهدف إلى استخدام منتج TXTL "في منتصف الطريق" هذا في التوعية الصيفية القادمة. ومع ذلك ، فإن المعركة لم تنته بعد ، فقد وجهنا انتباهنا الآن إلى مواد دعم أخرى مثل agarose ، التي لا تتداخل مع TXTL ، وهي رخيصة الثمن ، ويمكن تجفيفها بالتجميد ويمكن إلقاؤها بأي شكل.


تصنيع المداواة

مجال آخر نشط في أبحاث CFS هو التصنيع الحيوي للعلاجات وغيرها من الكواشف القائمة على البروتين. طورت النظم البيولوجية الطبيعية قدرة رائعة على تصنيع مجموعة متنوعة من الجزيئات تتراوح من المستقلبات إلى البوليمرات الحيوية. تسمح أنظمة التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا بدمج مثل هذه التفاعلات في عملية مضبوطة للغاية تسمح بإنتاج الجزيئات حسب الحاجة وفي المجال. سيكون تركيزنا الأساسي هنا على مجموعة فرعية من البوليمرات الحيوية ، وهي البروتينات العلاجية. يعتمد العمل الجاري في هذا المجال على عقود من البحث أدت إلى الأنظمة الإنتاجية والعملية المتاحة حاليًا [28 ، 29 ، 36 ، 37 ، 38 ، 40]. جعلت التطورات الأخيرة في تقنيات التحضير عالية الإنتاجية [40 ، 45] وفي تطوير الأنظمة التي يمكنها استخدام مصادر طاقة أكثر اقتصادا [64 ، 65] جعلت المساحات الصديقة لألطفال سهلة الوصول للغاية. وفي الوقت نفسه ، يتم اتخاذ خطوات كبيرة نحو حل العديد من مشكلات طي البروتين وأوجه القصور في التعديلات اللاحقة للترجمة [66] المرتبطة بـ CFS التقليدية. أظهرت التطورات الحديثة إمكانية زيادة التفاعلات الخالية من الخلايا ، حيث أظهر البعض أحجام تفاعل تصل إلى 100 لتر [67 ، 68] إلى 1000 لتر [69]. تم استخدام التعبير الخالي من الخلايا كمنصة لإنتاج مجموعة واسعة من العلاجات المحتملة ، والتي تم تلخيص بعضها في الجدول 1. تم التحقق من صحة عدد من هذه المنتجات في النماذج الحيوانية [49 ، 76].

تم اتباع طريقتين أساسيتين من المساحات الصديقة لألطفال. الأول ، الذي استخدمته الجهود التجارية مثل Sutro [94] ، يركز على الإنتاج المركزي الكبير. يستفيد هذا النهج من مزايا التوليف خارج الخلية للتصنيع الحيوي. بالنسبة لهذه التطبيقات ، لا تسمح المساحات الصديقة لألطفال بالإنتاج السريع فحسب ، بل إنها تسرع أيضًا بشكل كبير عملية تطوير الدواء [95]. ومن اللافت للنظر أن شركة Sutro قد زادت إنتاجها الخالي من الخلايا إلى 1000 لترًا لا يصدق [69] ، مما يُظهر قابلية التوسع في الإنتاج المركزي الخالي من الخلايا. يستخدم الوضع الثاني أنظمة FD-CF لإلغاء مركزية قدرة التصنيع الحيوي لإنتاج دفعة صغيرة من العلاجات ، مع تطبيقات في الصحة العالمية والاستجابة للطوارئ [49 ، 73 ، 96 ، 97]. باستخدام هذا النمط من الإنتاج ، أظهرنا مؤخرًا قدرة إثبات المفهوم لتصنيع أكثر من 50 علاجًا وكواشف معملية ، بما في ذلك البروتينات (مثل اللقاحات والأجسام المضادة والببتيدات المضادة للميكروبات) والجزيئات الصغيرة [49] ، مع تطبيقات خارج إعداد المختبر.

يعتبر التصنيع الحيوي الخالي من الخلايا مناسبًا بشكل خاص لإنتاج اللقاحات نظرًا لإمكانية توسيعه السريع استجابة لحالات الطوارئ الصحية العامة. تم إثبات التعبير الناجح الخالي من الخلايا لعدد من اللقاحات المؤتلفة (على سبيل المثال ، البوتولينوم ، والدفتيريا ، والجمرة الخبيثة) [49 ، 86 ، 87 ، 88 ، 89 ، 90 ، 98] ، مع التحقق من صحة بعضها في نماذج حيوانية ، مثل الفئران [49 ، 90]. بالنظر إلى متطلبات الجرعات المنخفضة (نطاق ميكروغرام) للعديد من هذه العلاجات ، فمن المرجح أن يشهد تسويق اللقاحات المشتقة من CFS نموًا سريعًا في السنوات القادمة. كان إنتاج الأجسام المضادة أيضًا أحد مجالات التركيز للمجتمع الخالي من الخلايا [20 ، 49 ، 51 ، 74 ، 75 ، 76 ، 77 ، 78 ، 79 ، 80 ، 99 ، 100]. نظرًا لحجمها الصغير ومستويات التعبير المرتفعة نسبيًا في CFS ، فقد حظيت الأجسام المضادة أحادية المجال باهتمام خاص ويبدو أنها في وضع جيد استراتيجيًا لخدمة الاحتياجات الناشئة في الطب الشخصي ، أي للعلاجات والتشخيصات.

تم التعرف على مقاومة المضادات الحيوية كتهديد رئيسي للصحة العالمية ، مما أدى إلى ما يقرب من مليوني مرض و 23000 حالة وفاة في الولايات المتحدة وحدها كل عام [101]. وفقًا لذلك ، أصبح إنتاج المركبات المضادة للميكروبات الخالية من الخلايا ، بما في ذلك الببتيدات المضادة للميكروبات والأدوية الجزيئية الصغيرة ، محور تركيز بعض المجموعات [49 ، 93]. أظهر عدد من المعامل أيضًا قوة المساحات الصديقة لألطفال في التعبير عن العاثيات [56 ، 102 ، 103 ، 104]. أدى الاتجاه التصاعدي في حالات مقاومة المضادات الحيوية المبلغ عنها إلى عودة ظهور العلاج بالعاثيات كبديل محتمل لأنظمة المضادات الحيوية الحالية [101 ، 105]. كما تم تقييم استخدام العاثيات كإستراتيجية علاج فعالة لعدد من أمراض النبات ، مع توفر بعض العاثيات الآن تجاريًا للاستهلاك الشامل [106]. يمكن أن يلعب إنتاج مضادات الميكروبات غير التقليدية هذه على أساس المساحات الصديقة لألطفال دورًا مهمًا في مكافحة أزمة مقاومة المضادات الحيوية ويمكن أن يساعد أيضًا في تحسين األمن الغذائي في جميع أنحاء العالم.

أدناه ، سوف نسلط الضوء على بعض المجالات التي أظهرت فيها المساحات الصديقة لألطفال إمكانات كبيرة لتعزيز الطرق الحالية لتطوير وتصنيع العالج. تعمل هذه التطورات على تحويل المساحات الصديقة لألطفال بسرعة إلى جزء ال يتجزأ من النظام البيئي للتصنيع.

بروتينات الغشاء

في حين أن ما يقرب من 70٪ من جميع الأدوية تعمل على بروتينات الغشاء [107] ، فإن العمل مع هذه البروتينات صعب بسبب إثرائها في الأسطح الكارهة للماء. غالبًا ما يكون التعبير الخلوي لبروتينات الغشاء محفوفًا بالتحديات ، مثل السمية الناتجة عن دمج الغشاء أو عدم توافقها مع فسيولوجيا المضيف [108]. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام الأساليب الخالية من الخلايا لمعالجة هذه الفئة الصعبة من البروتينات ، والتي تشكل تسلسلها الترميز 20-30٪ من جميع الجينات المعروفة [107]. عند مقارنتها بالطرق القائمة على الخلايا الحالية ، يمكن أن تكون CFS أداة قوية في إنتاج بروتينات الغشاء النشط القابلة للذوبان [109]. تعتبر القدرة على دمج الخطوات التي يمكن أن تعالج الجوانب الصعبة لتخليق البروتين الغشائي ذات قيمة خاصة. على سبيل المثال ، أظهرت الجهود السابقة في الأنظمة القائمة على الخلايا أنه يمكن استخدام محاكيات الأغشية بنجاح لتخليق وتثبيت مجموعة واسعة من بروتينات الغشاء مثل المستقبلات المقترنة ببروتين G [110 ، 111] ، مستقبل عامل نمو البشرة [71] ] ، وبروتينات غشاء فيروس التهاب الكبد الوبائي C [112] ، ومركب ATP synthase [109 ، 113]. تتضمن هذه المحاكاة المواد الخافضة للتوتر السطحي ، والجسيمات الشحمية ، والأقراص النانوية [114،115،116] ويمكن إضافتها مباشرةً إلى المساحات الصديقة لألطفال بشكل مشترك أو بعد متعدية. هناك أيضًا دليل يشير إلى أنه يمكن تصنيع بروتينات غشاء وحيد الامتداد تعمل ببساطة في وجود واجهة بين الزيت والماء (على سبيل المثال ، من خلال استخدام المستحلبات) [117].

إنتاج الجزيئات

سلط البحث الجزيئي الضوء على أهمية تفاعلات البروتين والبروتين والمركبات الناتجة التي يمكن أن تولدها هذه التفاعلات. سواء كان ذلك للدراسة الفيزيائية الحيوية لهذه المجمعات أو كوسيلة لتقديم علاجي جديد (على سبيل المثال ، السقالات الشبيهة بالفيروس للقاحات) ، هناك حاجة متزايدة لتطوير أدوات قوية تهدف إلى تخليق مثل هذه المجمعات. كما في حالة بروتينات الغشاء ، أظهرت CFS أيضًا عوائد أعلى ، مقارنة باستراتيجيات الجسم الحي ، في إنتاج مجموعات الجزيئات الكبيرة مثل الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) [109]. عمل رائد من قبل مجموعة شوارتز ، يوضح التعبير الخالي من الخلايا لمستضد التهاب الكبد B الأساسي VLP (وحدتان فرعيتان) [91] في بكتريا قولونية- نظام خالٍ من الخلايا ، فتح الباب للباحثين الآخرين الذين يعبرون عن مجموعة متنوعة من التجميعات الجزيئية بما في ذلك بكتريا قولونية بوليميراز الحمض النووي الريبي (5 وحدات فرعية) [118] وسينثاز ATP (25 وحدة فرعية) [113]. أظهر العمل السابق مع محلل الخلايا الشبكية أيضًا تعبيرًا خالٍ من الخلايا لمستقبلات الخلايا التائية البشرية (7 وحدات فرعية) [119]. بشكل ملحوظ ، تم الآن أيضًا التعبير عن عدد من العاثيات بنجاح في CFS ، بما في ذلك الملتهمة T4 ، التي تحتوي هيكليًا على 1500 بروتين من 50 جينًا [56 ، 102103104] (الشكل 3).

تخليق مركب البروتين متعدد الوحدات الفرعية في CFS. أظهرت مجموعات مختلفة إنتاج مجمعات بروتينية معقدة بشكل متزايد. وقد اشتملت على مستضد التهاب الكبد B الأساسي (HBc) VLP (وحدتان فرعيتان) [91] ، بكتريا قولونية بوليميراز الحمض النووي الريبي (5 وحدات فرعية) [118] ، مستقبل الخلايا التائية البشرية (7 وحدات فرعية) [119] ، سينثيز ATP (25 وحدة فرعية) [113] ، والعقم T4 (1500 وحدة فرعية) [102،103،104]

غالبًا ما يشار إلى الوحدات الفرعية غير المتطابقة لمركب البروتين بالوحدات الفرعية غير المتجانسة. في بعض الحالات ، تتطلب مثل هذه الوحدات الفرعية غير المتجانسة ترجمة مشتركة لإنتاج مجمعات نشطة [120]. وبالتالي ، فإن قدرة CFS على ترجمة mRNAs المتعددة بشكل متزامن تسهل إنتاج مجمعات نشطة تتكون من عدد من الوحدات الفرعية المختلفة [121]. بعض CFS مثل بكتريا قولونيةالمستحضرات القائمة على أساس غير قادرة بشكل عام على إنتاج البروتينات التي تحتوي على روابط ثاني كبريتيد ، والتي تعتبر ضرورية للعديد من البروتينات ذات الصلة الصيدلانية (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة والعديد من السيتوكينات) [121]. ومع ذلك ، فقد عززت الجهود الأخيرة هذه الأنظمة لتمكين إنتاج البروتينات المعقدة التي تتطلب روابط ثنائي كبريتيد متعددة [85 ، 99 ، 122] ، مما أدى إلى توسيع نطاق العلاجات التي يمكن إجراؤها في CFS.

تعديل البروتينات وجداول الكودون

تتوقف فعالية العديد من العلاجات القائمة على البروتين على التحكم الدقيق في التعديل الطبيعي أو غير الطبيعي لتسلسل الببتيد. أحد الاستخدامات الأكثر إلحاحًا لمثل هذه التعديلات هو تطوير اقترانات الأجسام المضادة والأدوية (ADCs) ، والتي تكتسب شهرة بسرعة كفئة جديدة من العلاجات ضد السرطان. تؤدي تقنيات الاقتران التقليدية إلى خليط غير متجانس من الأجسام المضادة المصنفة نظرًا لاعتمادها على الاقتران التعسفي لسلاسل جانبية متعددة للأحماض الأمينية. ومع ذلك ، تشير الدراسات الحديثة إلى أنه يمكن تحسين الخصائص الدوائية لـ ADCs من خلال الاقتران الخاص بالموقع. توفر الأحماض الأمينية غير الطبيعية وسيلة فعالة لمثل هذا الاقتران الخاص بالموقع [123]. حتى الآن ، تم إثبات التضمين المشترك لأكثر من 100 من الأحماض الأمينية غير الطبيعية المختلفة في الجسم الحي [124] ، مما يسمح بمجموعة واسعة من التعديلات [125،126،127،128،129]. تم إثبات العديد من هذه التعديلات في السياق الخالي من الخلايا لمجموعة متنوعة من التطبيقات ، بما في ذلك التثبيت الذي يتم التحكم فيه عن طريق التوجيه [92 ، 98] والوظيفة الخاصة بالموقع (على سبيل المثال ، الفسفرة [130] ، PEGylation [131] ، أو اقتران الأدوية [81]) [132،133،134].

تتحايل منصات CFS على بعض قيود السمية والنفاذية المستندة إلى الخلايا وتوفر تحكمًا أكبر وتنوعًا في إجراء تعديلات البروتين [109 ، 135]. يعتمد دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية في الأساليب القائمة على الخلايا عادةً على إعادة استخدام أكواد الإيقاف لتقليل الآثار السلبية لإعادة الترميز على قابلية الخلية للحياة [109]. ومع ذلك ، في نظام خالٍ من الخلايا ، يمكن من الناحية النظرية إعادة برمجة جدول الكودون بأكمله ، مما يسمح ليس فقط بدمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية ، ولكن أيضًا لإنشاء جداول كودون جديدة تمامًا.

إذا أخذنا في الاعتبار أقصى درجاته ، يمكن أن يساعد هذا الأخير في حماية الملكية الفكرية. يمكن تشويش تسلسل الحمض النووي بحيث تصبح غير وظيفية خارج سياقها المتخصص الخالي من الخلايا. هذا الرمز المبهم سيجعل من الصعب نسخ التصميمات المسجلة الملكية. يمكن أن يشكل تشويش الكودون أيضًا تحديات خطيرة للكشف عن تسلسل الحمض النووي الذي قد تستخدمه كيانات خبيثة. على سبيل المثال ، ستواجه شركات تصنيع الحمض النووي وقتًا أكثر صعوبة في الفحص ضد تسلسلات الحمض النووي التي يمكن استخدامها في الأنشطة الشائنة (على سبيل المثال ، الإرهاب البيولوجي). أظهر العمل الأخير أن حجم جدول الكودون يمكن أيضًا توسيعه عن طريق زيادة الأبجدية الجينية المكونة من أربعة أحرف بأزواج قاعدة غير طبيعية [136 ، 137]. وهكذا ، يمكن للبروتينات المصنوعة في متلازمة التعب المزمن - على الأقل من الناحية النظرية - أن تحتوي على عدد غير محدود من الأحماض الأمينية غير الطبيعية.

يمكن أيضًا استخدام CFS لإجراء تعديلات تحدث بشكل طبيعي على البروتينات. مثال على ذلك هو تطعيم السكريات (أي الجليكانات) المشار إليها باسم الارتباط بالجليكوزيل. غالبًا ما يعتمد الإنتاج الناجح للعديد من العلاجات على الارتباط بالجليكوزيل عالي الكفاءة ، حيث إن الافتقار إلى الارتباط بالجليكوزيل المناسب يمكن أن يقلل من الفعالية والعمر النصفي للعديد من البروتينات العلاجية [138]. بعض CFS (على سبيل المثال ، الحشرات ، مبيض الهامستر الصيني ، والأنظمة القائمة على استخراج K562 البشري) قادرة بطبيعتها على الارتباط بالجليكوزيل. ومع ذلك ، فإن ذخيرتهم من الهياكل الجليكان تميل إلى أن تقتصر على تلك التي تم توليفها بشكل طبيعي من خلال نوع خلية مصدر المحللة. بالإضافة إلى ذلك ، غالبًا ما يتطلب الارتباط بالجليكوزيل في هذه الأنظمة إعادة تلخيص آليات تهريب البروتين في الخلية المصدر [109]. وبالتالي ، أصبح إنشاء مسارات ارتباط بالجليكوزيل الاصطناعية في CFS مجالًا للتركيز في السنوات الأخيرة [135 ، 139]. من المرجح أن يكون النجاح في هذا المجال بمثابة حافز رئيسي في جلب لقاحات خالية من الخلايا وغيرها من العلاجات إلى الجماهير. يوضح الشكل 4 بعض تعديلات البروتين الممكنة في CFS.

تعديلات البروتين في CFS. تشمل تعديلات البروتين المحتملة على سبيل المثال لا الحصر الارتباط بالجليكوزيل ، وتكوين رابطة ثنائي الكبريتيد ، والأستلة [140] ، والفسفرة [141] ، والربط [131] (والذي يمكن تحقيقه من خلال استخدام الأحماض الأمينية غير الطبيعية). يمكن أيضًا استخدام الأحماض الأمينية غير الطبيعية لاقتران مجموعة كبيرة من المركبات مثل الأدوية (على سبيل المثال ، من خلال كيمياء النقر) [81] أو جزيئات الفلورسنت [142]. الشكل مقتبس من Pagel et al. [143]

التطور الموجه

التطور الموجه هو أداة قوية ل aptamer وهندسة البروتين التي تستخدم جولات تكرارية من الطفرات والاختيار لتعديل أو ضبط خصائص جزيئية معينة (على سبيل المثال ، نشاط ركيزة إنزيم). غالبًا ما توصف فائدة الأبتاميرات أو البروتينات ، في سياق معين ، فيما يتعلق بتسلسلات النيوكليوتيدات المقابلة لها على أنها منظر طبيعي للياقة البدنية. يوفر التطور الموجه طريقة متوازية بشكل كبير للبحث من خلال مشهد اللياقة البدنية للعثور على المتغيرات المثلى والأنماط الجينية المقابلة لها [144]. يتطلب هذا عمومًا تخطيطًا فرديًا للنمط الظاهري للنمط الجيني. على الرغم من أن الخلايا لديها قدرة مضمنة على مثل هذا التعيين بسبب طبيعتها المجزأة ، فإن استخدام الخلايا لإجراء التطور الموجه يمكن أن يفرض قيودًا على حجم المكتبات المرشحة التي تم فحصها ، ويقيد نوع المذيبات ، والمخازن المؤقتة ، ودرجات الحرارة التي يمكن أخذ عينات منها [ 145]. نتيجة لذلك ، اكتسبت منصات التطور الموجه الخالية من الخلايا تفضيلًا [145] ، بدءًا من أول أنظمة خالية من الخلايا حقًا تم نشرها في أواخر التسعينيات [146 ، 147]. في الآونة الأخيرة ، تم تحقيق ربط النمط الظاهري بالنمط الجيني من خلال التقسيم الاصطناعي (على سبيل المثال ، باستخدام المستحلب ، والميكروبيدات ، والجسيمات الشحمية) [145 ، 148،149،150،151]. تضمنت التطبيقات تصميم وتحسين شظايا الجسم المضاد Fab [77 ، 152] ، وبروتينات الغشاء [151] ، وكما سنناقش أدناه ، اكتشاف الإنزيم [52].


الملخص

يتم تصميم الشبكات التنظيمية التركيبية ذات الوظائف المحددة من خلال تجميع مجموعة مخفضة من العناصر الوظيفية. يمكننا أيضًا تجميعها حسابيًا إذا كانت النماذج الرياضية لتلك العناصر الوظيفية تنبؤية بدرجة كافية في سياقات جينية مختلفة. فقط بعد تحقيق ذلك سيكون لدينا مكتبات من نماذج الأجزاء البيولوجية القادرة على توفير السلوكيات الديناميكية التنبؤية لمعظم الدوائر التي يتم إنشاؤها باستخدامها. وبالتالي نحتاج إلى أدوات يمكنها استكشاف السياقات الجينية المختلفة تلقائيًا ، بالإضافة إلى القدرة على استخدام مثل هذه المكتبات لتصميم دوائر جديدة بديناميكيات مستهدفة. لقد قمنا بتنفيذ أداة جديدة ، AutoBioCAD ، تهدف إلى التصميم الآلي للدوائر التنظيمية للجينات. يقوم AutoBioCAD بتحميل مكتبة من نماذج العناصر الجينية وينفذ استراتيجيات التصميم التطوري لإنتاج (1) تسلسلات النوكليوتيدات التي تشفر الدوائر بديناميكيات مستهدفة يمكن بعد ذلك اختبارها تجريبيًا و (2) نماذج الدوائر لاختبار مبادئ التنظيم في الأنظمة الطبيعية ، وتوفير أداة جديدة للبيولوجيا التركيبية. يمكن استخدام AutoBioCAD لنمذجة وتصميم الدوائر الجينية بسلوك ديناميكي ، وذلك بفضل دمج التأثيرات العشوائية أو المتانة أو الديناميكيات النوعية أو التحسين متعدد الأغراض أو تسلسل النوكليوتيدات المتدهورة ، وكل ذلك يسهل الارتباط مع الجزء البيولوجي / هندسة الدائرة.


اللبنات الأساسية للحياة ، كل ذلك في الجينات

بقلم ديبورا سميث

ما هو ضروري للحياة؟ ليس كثيرا ، على ما يبدو. تم الكشف هذا الأسبوع أن بعض البكتيريا - على الرغم من صغر حجمها - تحمل الكثير من الأمتعة الجينية الإضافية.

اكتشف الباحثون أن 12 في المائة فقط من الحمض النووي لميكروب شائع في المياه العذبة كان ضروريًا لبقائه ، بعد التخلص من الـ 88 في المائة الأخرى. بشكل غير متوقع ، تضمنت هذه الأجزاء الحيوية من الشفرة الجينية الجينات ، وأجزاء أخرى من الحمض النووي تعمل على تشغيل الجينات وإيقافها.

& # x27 & # x27 ولكن كانت هناك العديد من المفاجآت ، & # x27 & # x27 ، عالمة الأحياء بجامعة ستانفورد ، الدكتورة لوسي شابيرو ، كما تقول. & # x27 & # x27 على سبيل المثال ، وجدنا 91 مقطعًا أساسيًا من الحمض النووي حيث ليس لدينا أي فكرة عما يفعلونه. & # x27 & # x27

يعد تقليص المخطط الجيني للكائن الحي إلى أساسياته الأساسية جزءًا من مسعى جديد لفهم الحياة بشكل أفضل ، ثم إعادة تصميمها.

الوعد الكبير هو القدرة على بناء أشكال حياة اصطناعية جديدة يمكنها حل العديد من مشاكل العالم: لتنظيف انسكابات النفط والملوثات الأخرى ، وإنتاج الأطعمة والوقود والبلاستيك والأدوية.

يقول الدكتور جيم هاسيلوف ، خبير النباتات الأسترالي في جامعة كامبريدج ، إن مبادئ الهندسة الرسمية هي مفتاح هذا المسعى المثير للجدل ، والمعروف باسم البيولوجيا التركيبية ، والذي لا يزال في مهده.

& # x27 & # x27 المجال في وضع مشابه للهندسة الميكانيكية في أوائل القرن التاسع عشر والإلكترونيات الدقيقة في أوائل الخمسينيات ، & # x27 & # x27 كما يقول.

قبل قرنين من الزمان ، بنى المهندسون الميكانيكيون كل محرك بخاري على حدة. لكن تطوير الأجزاء المعيارية ، مثل الخيوط اللولبية في ثلاثينيات القرن التاسع عشر ، والبناء المعياري ، أدى إلى الإنتاج الضخم للمحركات من المخططات.

اتبعت الهندسة الكهربائية مسارًا مشابهًا ، مع تطوير المكونات الرئيسية ، مثل الترانزستورات والدوائر المتكاملة ، مما أدى إلى صناعة الإلكترونيات الدولية اليوم. & # x27 & # x27 والآن لديك نفس النوع من المسار الذي يحدث في علم الأحياء ، & # x27 & # x27 يقول الدكتور هاسيلوف.

مثل بناة المحرك الأوائل ، أصبح علماء الأحياء جيدًا جدًا في إنشاء كائناتهم المعدلة وراثيًا الخاصة عن طريق إضافة جين أو اثنين إلى نبات أو ميكروب.

يقول الدكتور هاسيلوف ، الذي ألقى حديثًا مؤخرًا في جامعة سيدني ، إن هناك حاجة إلى ثورة في تصميم الكائنات الحية الجديدة إذا أراد العالم أن يتجنب اعتماده على مصادر الطاقة والمواد غير المتجددة.

قدمت مكعبات Lego في صندوق لعب الأطفال & # x27s الإلهام الأول. في السنوات الأخيرة ، أنشأ العلماء مكتبة تضم الآلاف من وحدات البناء البيولوجية الموحدة. يمكن لأي باحث استخدام قطع غيار الحمض النووي الصغيرة هذه لتجميع ميكروبات جديدة يمكنها ، على سبيل المثال ، العمل في درجات حرارة أعلى ، أو امتصاص ثاني أكسيد الكربون أو الالتصاق بالمعادن الثقيلة.

& # x27 & # x27 فكرة بسيطة. لكنه أيضًا تغيير عميق في الطريقة التي تقوم بها بالأشياء - مثل الانتقال من علم الأحياء إلى الهندسة ، & # x27 & # x27 يقول الدكتور هاسيلوف.

تتضمن المرحلة الأحدث والأكثر تعقيدًا بناء دوائر وراثية معقدة ، مصنوعة من جينات وبروتينات متفاعلة ، للتحكم في سلوك الخلية.

تقوم الدوائر الطبيعية ، على سبيل المثال ، بتوجيه الخلايا للنمو أو الانقسام أو إنتاج إشارة أو التحول إلى نوع مختلف من الخلايا. Synthetic circuits might be able to be integrated with natural circuits to ''rewire'' cells and get a plant or microbe to produce the fuel, medicine or material that is desired.

Dr Haseloff is particularly interested in how to modify the shape of plants, by altering the number of cells that proliferate or change type during development, to increase the amount of certain tissues, such as fruit.

He points to the remarkable differences between the ancient, small tomatoes of Peru and the large, red juicy ones we enjoy today, achieved by traditional breeding. ''The question is whether you can rationally engineer and produce those changes [with synthetic circuits].''

Medical researchers have already begun to use synthetic biology techniques in the laboratory, to try to tackle infectious disease and cancer, researchers report this week in the journal, علم.

For example, bacteria have been engineered to produce a protein that allows them to invade cancer cells, and to then produce a small piece of RNA that turns down the effect of a gene in the cell that stimulates colon cancer.

Concerns about synthetic biology focus on bioterror - the potential for development of new deadly microbes as weapons - and bioerror - their escape into the environment or unforseen harm to human health.

Some environmental groups have called for a moratorium on the science, but many researchers say the technology is an extension of genetic modification techniques widely used now. 'ɺnd we already have a very efficient framework of regulation and governance for these kinds of manipulations,'' Dr Haseloff says.


What is the life of cell-free genetic circuits? - مادة الاحياء

Store, Exchange, and Interact with Synthetic Biological Data

mv2.png/v1/fill/w_146,h_80,al_c,usm_0.66_1.00_0.01,blur_3/logo-cello-color.png" />

As synthetic biology techniques become more powerful, researchers are anticipating a future in which the design of biological circuits will be similar to the design of integrated circuits in electronics. Cello is a framework that describes what is essentially a programming language to design computational circuits in living cells. The circuits generated on plasmids expressed in Escherichia coli required careful insulation from their genetic context, but primarily functioned as specified. The circuits could, for example, regulate cellular functions in response to multiple environmental signals. Such a strategy can facilitate the development of more complex circuits by genetic engineering.

Cello converts electronic design specifications of combinational logic to complete DNA sequences encoding transcriptional logic circuits that can be executed in bacterial cells. A database of transcriptional repressors characterized in the Voigt lab provide genetic NOT gates and NOR gates that can be composed into any logic function.

The automated workflow and in-house genetic gates will make circuit design more reproducible and broadly accessible to biological engineering labs.

Generates a Boolean circuit as a Directed Acyclic graph from an HDL specification (Verilog).

Uses a database of second-generation genetic logic gates whose transfer functions are insulated from promoter context.

Allows users to upload custom UCF (User Constraint file) files.

Searches for the optimal assignment of transcriptional repressors to NOT/NOR gates by signal matching with the experimentally measured transfer functions.

Offers a wide range of assignment algorithms including Simulated annealing (default), Hill climbing, Breadth first search, Random permutations,etc.

Generates histograms for predicted gate REU for each row of the truth table for the best genetic circuit assignment.

Generates multiple plasmid versions using the Eugene language for constrained combinatorial enumeration of transcriptional unit orders and orientations.

Allows external applications to connect to Cello using a REST API.

Life Technologies (a Thermo Fisher brand): A114510

Office of Naval Research: Multidisciplinary University Research Initiative grant N00014-13-1-0074

Siebel Scholarship: Class of 2015

Air Force Office of Scientific Research: National Defense Science and Engineering Graduate fellowship FA9550-11-C-0028


Synthetic biologists extend functional life of cancer fighting circuitry in microbes

Bioengineers at the University of California San Diego have developed a method to significantly extend the life of gene circuits used to instruct microbes to do things such as produce and deliver drugs, break down chemicals and serve as environmental sensors.

Most of the circuits that synthetic biologists insert into microbes break or vanish entirely from the microbes after a certain period of time -- typically days to weeks -- because of various mutations. But in the September 6, 2019 issue of the journal علم, the UC San Diego researchers demonstrated that they can keep genetic circuits going for much longer.

The key to this approach is the researchers' ability to completely replace one genetic-circuit-carrying sub-population with another, in order to reset the mutation clock, while keeping the circuit running.

"We've shown that we can stabilize genetic circuits without getting into the business of fighting evolution," said UC San Diego bioengineering and biology professor Jeff Hasty, the corresponding author on the study. "Once we stopped fighting evolution at the level of individual cells, we showed we could keep a metabolically-expensive genetic circuit going as long as we want."

The circuit the UC San Diego researchers used in the علم study is one that this team, and others, are actively using to develop new kinds of cancer therapies.

"As synthetic biologists our goal is to develop gene circuits that will enable us to harness microorganisms for a wide range of applications. However, the reality today is that the gene circuits we insert into microbes are prone to fail due to evolution. Whether it be days, weeks, or months, even with the best circuit-stabilization approaches, it's just a matter of time. And once you lose functionality in your genetic circuit, there is nothing to do but start over," said Michael Liao, a UC San Diego bioengineering PhD student and the first author on the علم ورق. "Our work shows there is another path forward, not just in theory, but in practice. We've shown that it's possible to keep circuit-busting mutations at bay. We found a way to keep hitting reset on the mutation clock."

If the team's method can be optimized for living systems, the implications could be significant for many fields, including cancer therapy, bioremediation, and bioproduction of useful proteins and chemical components.

Rock Paper Scissors

To actually build a "reset button" for the mutation clock, the researchers focused on dynamics between strains of microbes, rather than trying to hold selective pressures at bay at the level of individual cells. The researchers demonstrated their community-level engineering system using three sub-populations of E. coli with a "rock-paper-scissors" power dynamic. This means that the "rock" strain can kill the "scissors" strain but will be killed by the "paper" strain.

Most published work tends to focus on stabilization strategies that act at the level of single cells. While some of these approaches may be sufficient in a given therapeutic context, evolution dictates that single cell approaches will naturally tend to stop working at some point. However, since the rock-paper-scissors (RPS) stabilization acts at a community level, it can also be coupled with any of the systems that act on a single cell level to drastically extend their lifespan.

Making Cancer Drugs and Delivering them to Tumors

In 2016 in طبيعة سجية, UC San Diego researchers led by Hasty, along with colleagues at MIT, described a "synchronized lysis circuit" that could be used to deliver cancer-killing drugs that are produced by bacteria that accumulate in and around tumors. This led the UC San Diego group to focus on the synchronized lysis platform for the experiments published in علم.

These coordinated explosions only occur once a predetermined density of cells has been reached, thanks to "quorum sensing" functionality also baked into the genetic circuitry. After the explosion, the approximately 10% of the bacterial population that did not explode starts growing again. When the population density once again reaches the predetermined density (more "quorum sensing"), another drug-delivering explosion is triggered and the process encoded by the researchers' synchronized lysis circuit restarts.

The challenge, however, is that this cancer killing genetic circuit -- and other genetic circuits created by synthetic biologists -- eventually stop working in the bacteria. The culprit. Mutations driven by the process of evolution.

"The fact that some bugs naturally grow in tumors and we can engineer them to produce and deliver therapies in the body is a game-changer for synthetic biology," said Hasty. "But we have to find ways to keep the genetic circuits running. There is still work to do, but we're showing that we can swap populations and keep the circuit running. This is a big step forward for synthetic biology."

Biomedical Research Advances

One of the research teams working to further advance and implement the synchronized lysis circuit is run by Tal Danino, now a professor at Columbia University, who also published seminal work on the development of quorum sensing for synthetic biology as part of his Ph.D. at UC San Diego.

"Tal recently showed that synchronized lysis technology can be used to deliver an immunotherapy to tumors in mice. To my knowledge, they are the first to show that bacterial drug production and delivery within a treated tumor can modify the immune system to attack untreated tumors. The results are fascinating. They also highlight how important it is for us to figure out how to keep the lysis circuit running as long as possible," said Hasty.

The current approach is not limited to a three-strain system. Individual sup-populations of microbes, for example, could each be programmed to produce different drugs, offering the potential of precise combination drug therapies to treat cancer, for example.

The researchers studied the dynamics of the populations using microfluidic devices that allow for controlled interactions between the different sub-populations. They also demonstrated the system is robust when tested in larger wells.

One next step will be to combine the approach with standard stabilizing approaches and demonstrate the system works in live animal models.

"We are converging on an extremely stable drug delivery platform with wide applicability for bacterial therapies," said Hasty.

Hasty, Din, and Danino are co-founders of GenCirq, a company which seeks to transfer this and related work to the clinic.


The Cell: A Molecular Approach. الطبعة الثانية.

Cells are divided into two main classes, initially defined by whether they contain a nucleus. Prokaryotic cells (bacteria) lack a nuclear envelope eukaryotic cells have a nucleus in which the genetic material is separated from the cytoplasm. Prokaryotic cells are generally smaller and simpler than eukaryotic cells in addition to the absence of a nucleus, their genomes are less complex and they do not contain cytoplasmic organelles or a cytoskeleton (Table 1.1). In spite of these differences, the same basic molecular mechanisms govern the lives of both prokaryotes and eukaryotes, indicating that all present-day cells are descended from a single primordial ancestor. How did this first cell develop? And how did the complexity and diversity exhibited by present-day cells evolve?

Table 1.1

Prokaryotic and Eukaryotic Cells.


Researchers create synthetic cells to isolate genetic circuits

Images for download on the MIT News office website are made available to non-commercial entities, press and the general public under a Creative Commons Attribution Non-Commercial No Derivatives license. You may not alter the images provided, other than to crop them to size. A credit line must be used when reproducing images if one is not provided below, credit the images to "MIT."

Previous image Next image

Synthetic biology allows scientists to design genetic circuits that can be placed in cells, giving them new functions such as producing drugs or other useful molecules. However, as these circuits become more complex, the genetic components can interfere with each other, making it difficult to achieve more complicated functions.

MIT researchers have now demonstrated that these circuits can be isolated within individual synthetic “cells,” preventing them from disrupting each other. The researchers can also control communication between these cells, allowing for circuits or their products to be combined at specific times.

“It’s a way of having the power of multicomponent genetic cascades, along with the ability to build walls between them so they won’t have cross-talk. They won’t interfere with each other in the way they would if they were all put into a single cell or into a beaker,” says Edward Boyden, an associate professor of biological engineering and brain and cognitive sciences at MIT. Boyden is also a member of MIT’s Media Lab and McGovern Institute for Brain Research, and an HHMI-Simons Faculty Scholar.

This approach could allow researchers to design circuits that manufacture complex products or act as sensors that respond to changes in their environment, among other applications.

Boyden is the senior author of a paper describing this technique in the Nov. 14 issue of Nature Chemistry. The paper’s lead authors are former MIT postdoc Kate Adamala, who is now an assistant professor at the University of Minnesota, and former MIT grad student Daniel Martin-Alarcon. Katriona Guthrie-Honea, a former MIT research assistant, is also an author of the paper.

Circuit control

The MIT team encapsulated their genetic circuits in droplets known as liposomes, which have a fatty membrane similar to cell membranes. These synthetic cells are not alive but are equipped with much of the cellular machinery necessary to read DNA and manufacture proteins.

By segregating circuits within their own liposomes, the researchers are able to create separate circuit subroutines that could not run in the same container at the same time, but can run in parallel to each other, communicating in controlled ways. This approach also allows scientists to repurpose the same genetic tools, including genes and transcription factors (proteins that turn genes on or off), to do different tasks within a network.

“If you separate circuits into two different liposomes, you could have one tool doing one job in one liposome, and the same tool doing a different job in the other liposome,” Martin-Alarcon says. “It expands the number of things that you can do with the same building blocks.”

This approach also enables communication between circuits from different types of organisms, such as bacteria and mammals.

As a demonstration, the researchers created a circuit that uses bacterial genetic parts to respond to a molecule known as theophylline, a drug similar to caffeine. When this molecule is present, it triggers another molecule known as doxycycline to leave the liposome and enter another set of liposomes containing a mammalian genetic circuit. In those liposomes, doxycycline activates a genetic cascade that produces luciferase, a protein that generates light.

Using a modified version of this approach, scientists could create circuits that work together to produce biological therapeutics such as antibodies, after sensing a particular molecule emitted by a brain cell or other cell.

“If you think of the bacterial circuit as encoding a computer program, and the mammalian circuit is encoding the factory, you could combine the computer code of the bacterial circuit and the factory of the mammalian circuit into a unique hybrid system,” Boyden says.

The researchers also designed liposomes that can fuse with each other in a controlled way. To do that, they programmed the cells with proteins called SNAREs, which insert themselves into the cell membrane. There, they bind to corresponding SNAREs found on surfaces of other liposomes, causing the synthetic cells to fuse. The timing of this fusion can be controlled to bring together liposomes that produce different molecules. When the cells fuse, these molecules are combined to generate a final product.

More modularity

The researchers believe this approach could be used for nearly any application that synthetic biologists are already working on. It could also allow scientists to pursue potentially useful applications that have been tried before but abandoned because the genetic circuits interfered with each other too much.

“The way that we wrote this paper was not oriented toward just one application,” Boyden says. “The basic question is: Can you make these circuits more modular? If you have everything mishmashed together in the cell, but you find out that the circuits are incompatible or toxic, then putting walls between those reactions and giving them the ability to communicate with each other could be very useful.”

Vincent Noireaux, an associate professor of physics at the University of Minnesota, described the MIT approach as “a rather novel method to learn how biological systems work.”

“Using cell-free expression has several advantages: Technically the work is reduced to cloning (nowadays fast and easy), we can link information processing to biological function like living cells do, and we work in isolation with no other gene expression occurring in the background,” says Noireaux, who was not involved in the research.

Another possible application for this approach is to help scientists explore how the earliest cells may have evolved billions of years ago. By engineering simple circuits into liposomes, researchers could study how cells might have evolved the ability to sense their environment, respond to stimuli, and reproduce.

“This system can be used to model the behavior and properties of the earliest organisms on Earth, as well as help establish the physical boundaries of Earth-type life for the search of life elsewhere in the solar system and beyond,” Adamala says.


شاهد الفيديو: 10 اسـرار مخـــفــية في الواتساب 99% من الناس لا تعرفها (أغسطس 2022).