معلومة

لماذا يتم إجراء عملية هضم البروتيناز K عند 50 درجة مئوية؟

لماذا يتم إجراء عملية هضم البروتيناز K عند 50 درجة مئوية؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تستخدم العديد من بروتوكولات عزل الحمض النووي عملية هضم بروتين K لإزالة البروتينات. يتم إجراء ذلك غالبًا عند 50 درجة مئوية. لماذا هذا؟


يزداد نشاط بروتين K بشكل كبير عن طريق إضافة عوامل تغيير طبيعة مثل SDS أو اليوريا (Hilz et al. ، 2008) ، مما يشير إلى أن التمسخ الطبيعي للركائز يساعد Proteinase K على تحللها.

ستؤدي زيادة درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية أيضًا إلى كشف بعض البروتينات بالفعل ، مما يسهل على بروتين K تحللها. يبدو أن بروتيناز K إنزيم مستقر جدًا ، ولا يزال بإمكانه العمل في درجة الحرارة هذه.


في مقالتك على موقع wiki المرتبط: "قد يؤدي ارتفاع درجة حرارة التفاعل من 37 درجة مئوية إلى 50-60 درجة مئوية إلى زيادة نشاط (بروتيناز K) عدة مرات". يعمل الإنزيم بشكل أسرع عند 50 درجة مئوية.


بروتيناز Thermolabile K.

Thermolabile Proteinase K هو بروتين سيرين هندسي مرتبط بالسبتيليزين والذي من شأنه أن يحلل مجموعة متنوعة من روابط الببتيد ويستخدم بشكل متكرر لتنظيف التفاعلات الأنزيمية أو الخلايا الخلوية.

  • يتم تعطيل الحرارة بعد فترة الحضانة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  • نشاط واستقرار مثاليان لمدة تصل إلى 24 شهرًا.
  • نشط في مجموعة واسعة من محاليل التفاعل ذات النشاط الأمثل بين 20-40 درجة مئوية ودرجة الحموضة 7.0 - 9.5.
  • لا توجد أنشطة ملوثة يمكن اكتشافها في نوكلياز داخلي أو نوكلياز خارجي أو DNase أو RNase.

قد يكون التغليف بالجملة متاحًا أيضًا ويُطلب للطلبات المتكررة الكبيرة.
يتعلم أكثر

Thermolabile Proteinase K عبارة عن بروتين سيرين مصمم هندسيًا مرتبط بالسبتيليزين والذي من شأنه أن يحلل مجموعة متنوعة من روابط الببتيد. إنه يشق بشكل مفضل رابطة الببتيد في جانب الكربوكسيل لمخلفات الأحماض الأمينية الأليفاتية أو العطرية. ومع ذلك ، يمكن أن تكون خصوصية بروتين Thermolabile K واسعة.

يمكن تعطيل بروتين Thermolabile K (TLPK) تمامًا عن طريق الحضانة عند درجة حرارة 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، مما يسمح بالخطوات الأنزيمية اللاحقة في وعاء التفاعل نفسه. يوضح الشكل 1 أن نشاط نوكليازات التقييد ، بما في ذلك نوكليازات داخلية مستقرة الحرارة ، يمكن إلغاؤها تمامًا باستخدام TLPK.

الشكل 1: بروتين Thermolabile K يحط تمامًا نشاط إنزيم التقييد

المسار L: 1 كيلوبايت DNA Ladder (NEB # N3232) المسار 1: & lambda DNA المحتضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية المسار 2: & lambda DNA المحتضن مع PvuII-HF أو PstI-HF لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية المسار 3: & lambda DNA المحتضن مع PvuII -HF أو PstI-HF الذي تم علاجه بـ 1 & muL Thermolabile Proteinase K (TLPK) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في المسار 4: & lambda DNA المحتضن أولاً باستخدام TLPK المعالج بـ PvuII-HF أو PstI-HF متبوعًا بالحضانة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتعطيل TLPK ، متبوعًا بالعلاج بـ PvuII-HF أو PstI-HF لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. تشير النتائج إلى أن Thermolabile Proteinase K يحط تمامًا نشاط إنزيم التقييد ، مما يسمح بالخطوات الأنزيمية اللاحقة في وعاء التفاعل نفسه.


تفاصيل الطريقة

خلفية

يعتبر الترسيب المناعي للحمض النووي الميثيلي (MeDIP) أحد أكثر الطرق استخدامًا لتقييم مثيلة الحمض النووي على نطاق الجينوم بأكمله. يتضمن MeDIP التقاط الجزء الميثلي من الحمض النووي بواسطة جسم مضاد خاص بالميثيل السيتوزين [1]. تم اقتران الطريقة في البداية مع تهجين المصفوفة الدقيقة للحمض النووي الميثلي الملتقط من أجل اكتشاف إثراء مثيلة الحمض النووي المحلي على طول الجينوم. عند المقارنة مع تهجين إدخال DNA ، تم استخدام الطريقة لتحديد مستويات مثيلة الحمض النووي المطلقة [2] ، [3] ، [4]. في سيناريوهات أخرى ، تم إجراء التهجين التنافسي. في تلك الحالات ، تتم مقارنة تهجين عينات MeDIP من حالة تجريبية واحدة مع عينات MeDIP من ظروف تجريبية أخرى ، من أجل تحديد التغيرات النسبية لمثيلة الحمض النووي [5] ، [6] ، [7]. في الآونة الأخيرة ، تم ربط الطريقة مع تسلسل الجيل التالي [8] ، والذي يسلط الضوء على قابلية التطبيق الحالية والمستقبلية في العديد من نماذج الكائنات الحية والتصاميم التجريبية. في المقالات السابقة التي تم فيها تطبيق MeDIP [5] ، [6] ، [7] ، [9] استغرق البروتوكول حوالي 3 أيام ليتم تنفيذه. نظرًا لأهمية التقنية في الدراسات التي تتضمن مثيلة الحمض النووي ، كان من المهم تحسين الطريقة من أجل تحقيق إقبال أسرع. توضح المقالة الحالية خطوات تحسين طريقة MeDIP. تم تقليل طول الإجراء إلى نصف الوقت دون المساومة على جودة النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار أوقات حضانة مختلفة مع الجسم المضاد من أجل تحديد الظروف الأكثر كفاءة.

حلول بدء التشغيل والكواشف والمواد

  • & # x02022 100 & # x000a0mM Na-Phosphate pH 7 buffer
  • & # x02022 5 & # x000a0M كلوريد الصوديوم
  • & # x02022 تريتون X-100
  • & # x02022 1 & # x000a0M تريس & # x02013HCl
  • & # x02022 0.5 & # x000a0M EDTA
  • & # x02022 10٪ SDS
  • & # x02022 0.1 & # x000a0M ديثيوثريتول (DTT)
  • & # x02022 بروتيناز K (20 & # x000a0mg / مل)
  • & # x02022 TE عازلة (10 & # x000a0mM Tris & # x02013HCl ، pH 7.5 1 & # x000a0mM EDTA)
  • & # x02022700 & # x000a0W مفكك صوتي من فيشر ، مع مسبار متصل بقرن كوب تبريد (الشكل 1 أ و ب) وسعة لـ 8 أنابيب نابذة فائقة السرعة (الشكل 1 ج)

الإعداد من أجل صوتنة: Fisher ultra-sonicator (أ) متصل بغرفة التبريد (بوق الكأس) (ب) بسعة 8 أنابيب microfuge (c).

إعداد العازلة

100 & # x000a0mL من 5 & # x000d7 IP عازلة: مزيج 50 & # x000a0mL من 100 & # x000a0mM Na-Phosphate (pH 7.0) ، 14 & # x000a0mL of 5 & # x000a0M NaCl ، 250 & # x000a0 & # x003bcL من Triton X-100 و 35.75 & # x000a0mL من المياه الخالية من dnase. حرك المحلول حتى لا تظهر أي مواد صلبة. مرشح تعقيم مع مرشح 0.2 & # x000a0 & # x003bcm حجم المسام.

100 & # x000a0mL من المخزن المؤقت للهضم: امزج 5 & # x000a0mL من 1 & # x000a0M Tris & # x02013HCl (pH 8.0) ، 2 & # x000a0mL من 0.5 & # x000a0M EDTA ، 5 & # x000a0mL من 10٪ SDS ومياه خالية من dnase.

إجراء

الخطوة 1 (اليوم 1). صوتنة الحمض النووي

Sonicate DNA الجينومي المنقى باستخدام Fisher Sonicator (الشكل 1 أ & # x02013c):

تمييع 0.5 & # x020138 & # x000a0 & # x003bcg الحمض النووي الجيني في 80 & # x000a0 & # x003bcL المياه منزوعة الأيونات في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 & # x000a0mL.

اضبط Sonifier على سعة 20٪.

Sonicate مع نبضات من 1 & # x000a0s تشغيل / إيقاف لما مجموعه 2 سلسلة 110s في وجود الجليد في الغرفة (الشكل 1 ب) ، وتجديدها بين السلاسل. يجب أن يكون الرف معلقًا من الغرفة وليس ملامسًا للمسبار (الشكل 1 ب).

قم بتشغيل 4 & # x000a0 & # x003bcL (300 & # x000a0ng) DNA و 100 & # x000a0ng DNA غير مصحح (سلم) على 1.5 ٪ من المواد الهلامية agarose ، أو 1 & # x000a0 & # x003bcL من DNA الموصوف في bioanalyzer ، للتحقق من حجم جزء 200 & # x020138 x000a0bp. إن التحقق من التجزئة باستخدام جهاز التحليل الحيوي يوفر قدرًا كبيرًا من الوقت ومواد الحمض النووي مقارنة مع المواد الهلامية agarose.

الخطوة 2 (اليوم 1). حضانة الحمض النووي مع الأجسام المضادة للميثيل سيتيدين

تفسد الحرارة لمدة 10 & # x000a0min عند 95 & # x000a0 & # x000b0C ، وتبرد على الفور على الجليد لمدة 5 & # x000a0min.

إلى الحمض النووي المصلب المشوه:

احتضان خليط DNA & # x02013 بين عشية وضحاها على منصة دوارة في 4 & # x000a0 & # x000b0C. قم بالتدوير بسرعة منخفضة بما يكفي لمنع رغوة كبيرة.

الخطوة الثالثة (اليوم الثاني). ربط حبات الاغاروز بالحمض النووي: مجمع الجسم المضاد

هز زجاجة حبات الاغاروز لإعادة تعليقها.

انقل 80 & # x000a0 & # x003bcL إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 & # x000a0mL وطرد مركزي عند 6000 & # x000a0rpm لـ 2 & # x000a0min في 4 & # x000a0 & # x000b0C.

قم بإزالة المادة الطافية وتجاهلها.

أضف 500 & # x000a0 & # x003bcL من خليط DNA & # x02013 من الخطوة 2 إلى الخرز.

احتضان 2 & # x000a0h على منصة دوارة في 4 & # x000a0 & # x000b0C.

الخطوة 4 (اليوم 2). الغسل وهضم بروتيناز K للحمض النووي: الجسم المضاد: حبات المركب

اغسل الخرز مرتين باستخدام المخزن المؤقت 1 & ​​# x000d7 IP على النحو التالي:

الطرد المركزي رد الفعل من الخطوة 3.10 في 6000 & # x000a0rpm لمدة 2 & # x000a0min في 4 & # x000a0 & # x000b0C وتجاهل طاف.

احتضان 5 & # x000a0min على منصة دوارة في 4 & # x000a0 & # x000b0C.

الطرد المركزي عند 6000 & # x000a0rpm لمدة 2 & # x000a0min في 4 & # x000a0 & # x000b0C. قم بإزالة المادة الطافية بعناية مع عدم إزعاج الحبيبات.

كرر الخطوات المذكورة أعلاه مرتين أكثر.

أعد تعليق الخرز في 210 & # x000a0 & # x003bcL من المخزن المؤقت للهضم.

أضف 20 & # x000a0 & # x003bcL بروتيناز K (20 & # x000a0mg / mL) إلى الخرز المعاد تعليقه. إذا كان نوع الخلية المستخدم هو خلايا الحيوانات المنوية ، أضف 23 & # x000a0 & # x003bcL من DTT 0.1 & # x000a0M ، مما سيؤدي إلى تعطيل روابط الكبريت في طلاء هذه الخلايا.

احتضان لـ 2 & # x000a0h على منصة دوارة عند 55 & # x000a0 & # x000b0C (تأكد من إغلاق الأغطية لتجنب التسرب).

الخطوة 5 (اليوم 2). تنقية الحمض النووي

قم بتصفية كل محتوى التفاعل السابق باستخدام أعمدة الترشيح الدوراني Pierce بأقصى سرعة لمدة 30 & # x000a0 ثانية ، في RT. تجاهل العمود وحافظ على التدفق من خلاله.

إلى التدفق من خلال إضافة 3 & # x000a0 & # x003bcL الجليكوجين (5 & # x000a0mg / مل) وتخلط جيدًا.

أضف 20 & # x000a0 & # x003bcL 5 & # x000a0M NaCl ثم 750 & # x000a0 & # x003bcL الإيثانول وامزج جيدًا. من المهم تنفيذ هذه الخطوة باستخدام الكواشف الباردة.

تعجيل الحمض النووي لمدة 30 & # x000a0min. يمكن إجراء ذلك على الجليد أو في درجة حرارة الغرفة (انظر المناقشة حول هذه الخيارات في القسم & # x0201c الخطوة 5. تنقية الحمض النووي & # x0201d)

الطرد المركزي عند 14000 & # x000a0rpm لمدة 30 & # x000a0min في 4 & # x000a0 & # x000b0C. قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، مع عدم إزعاج الحبيبات.

عينات جافة تمامًا في كتلة التسخين عند 50 & # x000a0 & # x000b0C لمدة 5 & # x000a0min.

إعادة التعليق في 30 & # x000a0 & # x003bcL H.2احتضان في كتلة التسخين عند 50 & # x000a0 & # x000a0 & # x000b0C لمدة 5 & # x000a0min وقياس تركيز الحمض النووي. العائد المتوقع هو 300 & # x02013500 & # x000a0ng (10 & # x0201315 & # x000a0ng / & # x003bcL).

الملاحظات وتدابير التحسين التفصيلية المتخذة في كل خطوة من البروتوكول

كميات عينة المدخلات من الحمض النووي

قمنا ببناء منحنى بناءً على اختبار البيانات باستخدام كميات مختلفة من الحمض النووي كمدخلات تتراوح من 0.5 إلى 8 & # x000a0 & # x003bcg. أسفرت جميع الكميات المختلفة لمدخلات الحمض النووي المستخدمة عن كميات قابلة للقياس من ناتج MeDIP DNA (الشكل 2). لذلك ، يجب اختيار كمية إدخال الحمض النووي في نطاق 0.5 & # x020138 & # x000a0 & # x003bcg ، بناءً على توفر DNA المدخلات وكميات MeDIP DNA اللازمة لمزيد من التسلسل. كان الحمض النووي المستخدم في التحسين الحالي من الدجاج (جالوس جالوس) دم.

الارتباط بين كمية الحمض النووي المستخدمة كمدخلات لإجراء MeDIP والحمض النووي المخصب لمثيلة الحمض النووي التي تم الحصول عليها كمخرجات.

الخطوة 1. صوتنة الحمض النووي

نستخدم حاليًا جهاز الموجات فوق الصوتية من فيشر (جهاز تفكيك الصوت الصوتي 700 & # x000a0W) المرفق بغرفة التبريد (بوق الكأس) بسعة 8 أنابيب ميكروفوج (الشكل 1 أ & # x02013c). تم اختيار هذا الإعداد نظرًا لحقيقة أن هذا الجهاز لا يحتاج إلى إدخال المسبار داخل العينة من أجل الصوتنة ، وبالتالي تجنب التلوث المتبادل وتقليل أوقات المعالجة. يمكن صوت ثماني عينات في وقت واحد مع هذا الجهاز. كما أن تكلفة هذا الجهاز أقل بكثير مقارنة بالخيارات المماثلة من الشركات الأخرى (على سبيل المثال Bioruptor من Diagenode ، M220 Focused-ultrasonicator من Covaris).

الخطوة 2. حضانة الحمض النووي مع الأجسام المضادة لميثيل سيتوزين

الجسم المضاد المستخدم (الفأر أحادي النسيلة المضاد 5-ميثيل سيتوزين من Diagenode) مخصص للفأر ولكن يبدو أنه يربط الحمض النووي الميثلي بغض النظر عن الأنواع. تظهر ورقة البيانات من الشركة ارتباطًا بالحمض النووي للإنسان والفأر. لقد اختبرناها بشكل إيجابي في الحمض النووي من الفئران [6] ، [7] ، وعصافير داروين [9] والدجاج (المجموعة الحالية من العينات).

يستخدم بروتوكولنا المعتاد الحضانة الليلية للحمض النووي مع الجسم المضاد. نظرًا لأن بعض البروتوكولات وصفت أوقات حضانة مخفضة باستخدام الجسم المضاد لميثيل سيتوزين [1] ، [4] ، [10] ، قمنا باختبار 2.5 & # x000a0h مقابل حضانات بين عشية وضحاها. أجرينا MeDIP على عينتين من دم الدجاج ، تم اختبار كل منهما في كلتا فترتي الحضانة. تم تقييم تغطية العينات المتسلسلة باستخدام البرنامج النصي R MEDIPS. وجدنا أن نسبة CpGs غير المشمولة في الجينوم قد زادت بشكل كبير مع قصر وقت الحضانة. علاوة على ذلك ، تم زيادة جزء CpGs المغطاة للغاية (& # x0003e5X) بشكل كبير مع الحضانة بين عشية وضحاها (الشكل 3).

تحليل المعلومات الحيوية لتحديد الاختلافات في تغطية CpGs بعد تسلسل مادة MeDIP باستخدام مرتي حضانة مع الجسم المضاد (2.5 & # x000a0h و بين عشية وضحاها).

الخطوة 3. ربط حبات الاغاروز بالحمض النووي: معقد الأجسام المضادة

كانت هذه إحدى خطوات التحسين الرئيسية التي تم تنفيذها في البروتوكول. في السابق [5] ، [6] ، [7] ، [9] ، أجرينا سلسلة من أربع عمليات غسل من حبات agarose مع 2٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) في المخزن المؤقت IP 1 & # x000d7 لتجنب الارتباط غير المحدد بـ الخرز. نظرًا لأن حبات Santa Cruz agarose مطلية مسبقًا بـ BSA ، فقد أجرينا اختبارات للربط غير المحدد من أجل تحديد الحاجة إلى إجراء هذه الغسلات. في هذه الاختبارات ، تم تحضين الحمض النووي المجزأ مع حبيبات الاغاروز في غياب الجسم المضاد لتحديد درجة الارتباط غير النوعي. لوحظ أن حبات الاغاروز ترتبط بشكل غير محدد بما يقرب من 3 & # x020136٪ من DNA المدخلات ، على الرغم من عدد الغسلات (0 ، 1 أو 4) (الشكل 4).

اختبار الارتباط غير المحدد للحمض النووي المجزأ بحبات الاغاروز. تُظهر المؤامرة الحمض النووي الذي تم الحصول عليه من خرز agarose في غياب الجسم المضاد ، بعد المعالجة المسبقة للخرز بشروط مختلفة (بدون غسل ، أو غسل 1 أو 4 باستخدام PBS-BSA).

الخطوة 4. غسل وهضم بروتيناز K للحمض النووي: الجسم المضاد: معقد حبات

في هذه الخطوة ، تم اختبار عدد الغسلات باستخدام المخزن المؤقت 1 & ​​# x000d7 IP المطلوب حقًا للتخلص التام من الحمض النووي غير المرتبط بالحمض النووي: الجسم المضاد: مجمع الخرز. وجد أن عدد الغسلات المستخدمة سابقًا ، أي ثلاثة ، كان مناسبًا لإزالة كل الحمض النووي غير المرتبط بالحمض النووي المعقد: الجسم المضاد: الخرز (الشكل 5). كما تم تحسين هضم بروتيناز K. في البداية أجرينا تفاعل الهضم طوال الليل عند 55 & # x000a0 & # x000b0C. ومع ذلك ، وجدنا أنه يتم الحصول على نفس الكفاءة من خلال تفاعل 2 & # x000a0h ، المحتضن عند نفس درجة الحرارة.

اختبار شروط غسل الحمض النووي: الجسم المضاد: معقد الخرز. تُظهر المؤامرة الحمض النووي غير المنضم المتبقي بعد كل خطوة غسيل باستخدام المخزن المؤقت 1 & ​​# x000d7 IP.

الخطوة 5. تنقية الحمض النووي

كانت الخطوة الأخيرة لتحسين بروتوكول MeDIP هي تحسين إجراء ترسيب الحمض النووي ، والذي كان في البداية طويلًا ، ويتم إجراؤه باستخدام الكواشف السامة مثل الفينول والكلوروفورم: كحول أيزو أميل ، وتضمنت حدثين من ترسيب الإيثانول. ألغى التحسين هذه الخطوات وأدخل التصفية من حبات agarose مباشرة بعد تفاعل الهضم مع البروتين K. بعد اختبار مجموعة واسعة من الأعمدة والطرق الأخرى ، أنتجت أعمدة Pierce لمرشح الدوران نتائج مثالية لفصل حبات agarose عن الحل. في هذه المرحلة ، من المهم جدًا تعجيل الحمض النووي بطرق لا تبالغ في قراءة الامتصاصية ، نظرًا لضآلة كمية الحمض النووي التي يتم قياسها. حققت أعمدة بيرس هذا لأنه لم يتم إدخال أي كواشف أخرى إلى الخليط. أخيرًا ، نظرًا لأن الخليط كان أنظف من البداية ، كانت هناك حاجة إلى خطوة واحدة فقط من ترسيب الإيثانول من أجل الحصول على عينة نقية من الحمض النووي المخصب من أجل المثيلة ، وبالتالي تقليل الخسائر المتأصلة التي تحدث مع كل حدث من حالات الترسيب.

أيضًا ، نظرًا لانخفاض كمية الحمض النووي التي يتم ترسيبها ، فمن المهم جدًا أن يتم اختيار معلمات ترسيب الإيثانول بعناية. تم إجراء الترسيب على الجليد أو في درجة حرارة الغرفة بدلاً من درجات الحرارة السلبية ، بناءً على الدراسات السابقة التي قيمت ترسيب الإيثانول في الحمض النووي [11] ، [12]. ذكرت هذه الدراسات أن الحضانة ذات درجات الحرارة المرتفعة (0 & # x020134 & # x000a0 & # x000b0C) تنتج عائدًا أفضل من الحضانات ذات درجات الحرارة المنخفضة للغاية (& # x0221220 أو & # x0221280 & # x000a0 & # x000b0C). بالتوافق ، تم الحصول على أفضل النتائج مع الحضانات على الجليد أو حتى درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك ، يبدو أن هطول الأمطار في درجة حرارة الغرفة يعطي منحنى امتصاص أنظف قليلاً ، وبالتالي ، فهي الحالة التي نستخدمها بالفعل في تجاربنا. من المهم أيضًا الإشارة إلى أنه عند إضافة المحاليل المحفوظة مسبقًا في درجة حرارة الغرفة ، انخفض العائد بشكل كبير. لذلك ، على الرغم من إجراء الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، يبدو من المهم أن الحلول المستخدمة لترسيب الإيثانول تبقى باردة مسبقًا.


دور هضم بروتيناز K في استخلاص الحمض النووي

بالطبع إنه يهضم البروتين ولكن كيف؟

يتكون الجزء الأكبر من الخلية من البروتين. يتكون البروتين الوحيد من الغشاء النووي والإنزيمات والروابط والمستقبلات والمرافقين والأجسام المضادة والأساطير الأخرى الخاصة بالمستقبلات.

أيضًا ، يتكون غشاء الخلية والغشاء النووي من البروتين المركب مثل الفوسفوليبيد والبروتين السكري والسفينجوميلين. هذه هي الجزيئات المتعددة التي تتكون من البروتينات مع بعض الدهون والكربوهيدرات والجزيئات الأخرى.

إن بروتيناز K يهضم جزء البروتين من هذه الجزيئات. علاوة على ذلك ، فإنه يهضم البروتين المرتبط بالحمض النووي. يتكون البروتين من سلسلة طويلة من الأحماض الأمينية. اعتمادًا على طبيعة تفاعلها مع الماء ، يتم تصنيفها إلى أحماض أمينية محبة للماء (تجذب الماء) وكارهة للماء (مقاومة الماء).

إن بروتيناز K يهضم بشكل أساسي الأحماض الأمينية الطاردة للماء (العطرية وكذلك الأليفاتية). يوفر العامل المساعد ، أيون الكالسيوم استقرارًا للإنزيم ، ومع ذلك ، لا يمكنه زيادة نشاط التفاعل.

تم الإبلاغ عن أعلى نشاط للبروتين K عند درجة حرارة 60 درجة مئوية تتراوح من 37 درجة مئوية إلى 70 درجة مئوية. يظهر الرسم البياني لدرجة الحرارة مقابل النشاط الأنزيمي أدناه.

علاوة على ذلك ، سجل استقرار الإنزيم أعلى مستوى له عند درجة الحموضة 8.0 (وهو أمر مطلوب في استخراج الحمض النووي). ومع ذلك ، فإن الإنزيم نشط عند درجة الحموضة 4.0 حتى 10.0. يظهر الرسم البياني لدرجة الحموضة مقابل نشاط الإنزيم أدناه ،

يعطي بروتيناز K أفضل النتائج في وجود العديد من المواد الكيميائية الأخرى. يمكن استخدام المواد الكيميائية مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم و EDTA واليوريا و CTAB و Nonidet P40 في هضم البروتين. بالاقتران مع هذه المواد الكيميائية ، يزيد بروتيناز K من كفاءة النتيجة عن طريق زيادة نقاء الحمض النووي.

علاوة على ذلك ، يعمل بروتيناز K بشكل جيد بشكل لا يصدق مع العديد من الإنزيمات الأخرى مثل التربسين وكيموتريبسين و RNase. يعتمد الأمر علينا ، ما هي أنواع الأنسجة التي نستخدمها لاستخراج الحمض النووي. يمكننا استخدام مزيج مختلف من بروتيناز K والإنزيم والمواد الكيميائية.


بروتيناز Thermolabile K.

Thermolabile Proteinase K هو بروتين سيرين هندسي مرتبط بالسبتيليزين والذي من شأنه أن يحلل مجموعة متنوعة من روابط الببتيد ويستخدم بشكل متكرر لتنظيف التفاعلات الأنزيمية أو الخلايا الخلوية.

  • تعطل الحرارة بعد فترة الحضانة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  • نشاط واستقرار مثاليان لمدة تصل إلى 24 شهرًا.
  • نشط في مجموعة واسعة من محاليل التفاعل ذات النشاط الأمثل بين 20-40 درجة مئوية ودرجة الحموضة 7.0 - 9.5.
  • لا توجد أنشطة ملوثة يمكن اكتشافها في نوكلياز داخلي أو نوكلياز خارجي أو DNase أو RNase.

قد يكون التغليف بالجملة متاحًا أيضًا ويُطلب للطلبات المتكررة الكبيرة.
يتعلم أكثر

Thermolabile Proteinase K هو بروتين سيرين هندسي مرتبط بالسبتيليزين والذي من شأنه أن يحلل مجموعة متنوعة من روابط الببتيد. إنه يشق بشكل مفضل رابطة الببتيد في جانب الكربوكسيل لمخلفات الأحماض الأمينية الأليفاتية أو العطرية. ومع ذلك ، يمكن أن تكون خصوصية بروتين Thermolabile K واسعة.

يمكن تعطيل بروتين Thermolabile K (TLPK) تمامًا عن طريق الحضانة عند درجة حرارة 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، مما يسمح بالخطوات الأنزيمية اللاحقة في وعاء التفاعل نفسه. يوضح الشكل 1 أن نشاط نوكليازات التقييد ، بما في ذلك نوكليازات داخلية مستقرة الحرارة ، يمكن إلغاؤها تمامًا باستخدام TLPK.

الشكل 1: بروتين Thermolabile K يحط تمامًا نشاط إنزيم التقييد

المسار L: 1 كيلوبايت DNA Ladder (NEB # N3232) المسار 1: & lambda DNA المحتضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية المسار 2: & lambda DNA المحتضن مع PvuII-HF أو PstI-HF لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية المسار 3: & lambda DNA المحتضن مع PvuII -HF أو PstI-HF الذي تم علاجه بـ 1 & muL Thermolabile Proteinase K (TLPK) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في المسار 4: & lambda DNA المحتضن أولاً باستخدام TLPK المعالج بـ PvuII-HF أو PstI-HF متبوعًا بالحضانة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتعطيل TLPK ، متبوعًا بالعلاج بـ PvuII-HF أو PstI-HF لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. تشير النتائج إلى أن Thermolabile Proteinase K يحط تمامًا نشاط إنزيم التقييد ، مما يسمح بالخطوات الأنزيمية اللاحقة في وعاء التفاعل نفسه.


تقنيات تحضير الحمض النووي

للتنميط الجيني الجزيئي ، يمكن الحصول على الحمض النووي الجيني من الفئران باستخدام مجموعة متنوعة من الأنسجة وطرق الاستخراج. لقد نجحت الطرق التالية بشكل جيد بالنسبة لنا ، على الرغم من أن الطرق الأخرى قد تكون موثوقة بنفس القدر.

جمع الأنسجة

يجب وصف طريقة جمع الأنسجة في بروتوكول استخدام الحيوان المستثمر & # 8217s والموافقة عليه من قبل UCI & # 8217s IACUC. تشمل الأنسجة التي يمكن استخدامها كمصدر للحمض النووي الجيني ما يلي:

يستخدم TMF قص إصبع القدم البعيد عند أخذ خزعة الفئران التي تتراوح أعمارها بين 7 و 11 يومًا إذا كان العمر. & # 160 يتم أخذ خزعة من جميع الفئران الأخرى عبر مقاطع الذيل. هناك حاجة إلى عينة ذيل من 1-2 مم فقط عند إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ولكن يوصى بحوالي 5 مم للنشاف الجنوبي. لا تتطلب سياسة IACUC تخديرًا لخزعات الذيل التي يقل طولها عن 1 سم في الجراء حتى عمر 21 يومًا. ومع ذلك ، يستخدم TMF تخدير الأيزوفلورين. نحن نعتبر أن هذا أمر أكثر إنسانية ، ويجعل من السهل قص الذيول ووضع علامة على الجراء بواسطة لكمة الأذن في نفس الوقت. بروتوكولنا كالتالي:

  1. حمل التخدير في القفص المنزلي عن طريق إدخال أنبوب من مبخر isoflurane في فتحة زجاجة الماء. تتم جميع الإجراءات في غطاء دخان لتجنب تعرض المشغل لأبخرة الأيزوفلورين.
  2. مع الحفاظ على كل الجراء تحت التخدير ، قم بإزالة الجراء واحدًا تلو الآخر.
  3. امسح شفرة سكين Xacto والحرارة في لهب موقد بنسن للمساعدة في كي الجرح ومنع انتقال التلوث.
  4. قطع 1-2 مم من أنسجة الذيل بسكين Xacto ونقله بالملقط إلى أنبوب microfuge المسمى.
  5. حدد الجرو بنمط فريد لكمة الأذن.
  6. سجل جنس ولون الجراء على ورقة تسجيل قطع الذيل.

تم اعتماد قص إصبع القدم البعيدة مؤخرًا من قبل FELASA باعتباره أكثر إنسانية من قص الذيل. تتمثل ميزة قص إصبع القدم البعيد في أنه يمكن استخدامه كمصدر للحمض النووي وطريقة لتحديد الهوية. العيب الوحيد هو أنه يجب إجراؤه عندما يبلغ عمر الحيوان & # 160 7-11 يومًا. يمكن أن يخدم تثقيب الأذن أيضًا كلا الغرضين ، ولكنه أكثر عرضة للتلوث المتبادل لعينات الأنسجة.

يجب تخزين عينات الأنسجة عند & # 821120C إذا لم يتم استخراجها على الفور.

طريقتان لجمع الدم لا تتطلب تخديرًا هما الوريد الصافن والوريد الفكي. تتمثل إحدى ميزات استخدام الدم كمصدر للحمض النووي في أنه يمكن جمع عينات متعددة من نفس الفأر ، مع القليل من الصدمات التي يتعرض لها الفأر. يقتصر قطع الذيل على عينتين ، بينما يقتصر قص إصبع القدم البعيدة وتثقيب الأذن على مجموعة واحدة إذا تم استخدامها أيضًا لتحديد الهوية.

يمكن العثور هنا على وصف جيد ، مع صور ، لجمع الدم من الوريد الصافن ، ويمكن العثور على مقطع فيديو هنا.

استخراج الحمض النووي

تتوفر مجموعة متنوعة من مجموعات لاستخراج الحمض النووي من أنسجة الفأر. هذا الحمض النووي العائد مناسب لمعظم التطبيقات النهائية ، مثل PCR ، النشاف الجنوبي ، التسلسل ، إلخ. لقد حصلت منشأتنا على نتائج جيدة مع مجموعة Qiagen DNeasy Tissue Kit (أرقام الكتالوج 69504 أو 69506) ، والتي تحتوي على تعليمات خاصة بأنسجة الذيل أو إصبع القدم و دم.

يمكننا أيضًا أن نوصي بطريقتين باستخدام الكواشف محلية الصنع ، الموضحة أدناه. توفر هذه مزايا التكلفة المنخفضة ووقت التدريب العملي الأقل ، لكن الحمض النووي لن يكون نقيًا تمامًا مثل ذلك الموجود في مجموعة Qiagen. كلاهما ينتجان DNA مناسب لـ PCR.

  • التركيز النهائي لعزل هضم الذيل (TDB):
    • 50 ملي بوكل
    • 10 مم Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 9.0)
    • 0.1٪ تريتون X-100
    • 0.4 مجم / مل بروتيناز ك
    1. إضافة 100 ميكرولتر من TDB لكل قطعة ذيل (2-5 مم) في أنبوب ميكروسينتريفوجي. احرص على عدم قطع الكثير من الذيل.
    2. احتضان الأنبوب إما 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ، مع خلط لطيف كل 30 دقيقة ، أو 55 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    3. احتضان الأنبوب عند 94 درجة مئوية (أو الغليان) لمدة 10 دقائق لإفساد بروتين ك.
    4. تدور في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة بأقصى سرعة لمدة 15 دقيقة. استخدم قسامة من المادة الطافية مباشرة من الأنبوب (على سبيل المثال ، 1 ماي في تفاعل 25 ماي) من أجل تفاعل البوليميراز المتسلسل. إذا كانت النتائج مشكوك فيها ، جرب التخفيف بنسبة 1: 5 أو 1:10 من الحمض النووي.

    طريقة هوت شوت

    (GE Truett وآخرون ، BioTechniques 29: 52-54 ، يوليو 2000)

    1. قطع الذيل 1-2 مم ووضعه في أنبوب microfuge 0.5 مل. تحذير - قطع أكبر من الذيل يمكن أن تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    2. أضف 75 & # 181l كاشف تحلل قلوي. تأكد من أن جزء الذيل مغمور بالكامل.
    3. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل (قد تكون أطول & # 8211 انظر أدناه) ثم تخزينها في 4C حتى تنتقل إلى الخطوة التالية. يعد جهاز التدوير الحراري مناسبًا لهذه الخطوة.
    4. أضف 75 & # 181l كاشف تحييد باستخدام طرف جديد لحاجز الهباء الجوي لكل عينة. تخلط جيدا ، باستخدام طرف لتفتيت الأنسجة. يحب بعض الناس الطرد المركزي للأنابيب بعد هذه الخطوة ونقل المادة الطافية المحايدة إلى أنبوب جديد ، لكن هذا ليس ضروريًا.
    5. عند التنميط الجيني للحيوانات التي يبلغ عمرها 6 أسابيع وما فوق ، نجد أن زيادة وقت الحضانة 95 درجة مئوية إلى ساعتين يؤدي إلى نتائج أفضل. قد تمنع التحضيرات المصنوعة من قطع الذيل الأطول من 2 مم تفاعل البوليميراز المتسلسل. استخدم 1 & # 181l من المادة الطافية المحايدة لكل 20 & # 181l تفاعل PCR.

    كاشف تحلل قلوي
    يضاف إلى 25 مل من الماء
    62.5 & # 181 لترًا من 10 N هيدروكسيد الصوديوم (الحفرة النهائية 25 ملي مولار)
    10.0 & # 181 لتر من 0.5 م ثنائي الصوديوم EDTA (الحفرة النهائية 0.2 مم)
    (يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني حوالي 12 ، ولكن لا يجب تعديله)

    اجعله طازجًا كل شهر إلى شهرين. حافظ على الحل في RT.

    ملاحظة: نظرًا لوجود EDTA في كاشف التحلل القلوي ، فقد تحتاج إلى زيادة كمية كلوريد المغنيسيوم في مزيج PCR الرئيسي. قد تحتاج ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى إعادة تحسينها عند التبديل إلى طريقة تحضير الحمض النووي هذه.

    كاشف التحييد
    إلى 24 مل من الماء ، أضف 1 مل من 1 M Tris-HCl (التركيز النهائي 40 ملم)
    (يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني حوالي 5 ، ولكن لا يجب تعديله)
    حافظ على الحل في RT.

    اصنع 1 M Tris-HCl مع ملح تريس هيدروكلوريد.

    DNA البلازميد للحقن المجهري

    واحدة من أهم الخطوات في صنع الفئران المعدلة وراثيا هو تحضير الحمض النووي للحقن المجهري. يمكن أن يكون الحمض النووي المحضر بشكل سيئ سامًا للبويضة ويمكن أن تسد الملوثات إبرة الحقن ، والتي عادةً ما يكون قطرها الداخلي 0.5 ميكرون عند الحافة.

    يقوم TMF بتنفيذ خطوة التنقية النهائية لجميع البلازميدات المقدمة للحقن المجهري. نطلب من العملاء تقديم ملخص مقيد لا يقل عن 50 ميكروغرامًا من البلازميد ، مقطوعًا بطريقة تفصل الجين المحور عن أكبر قدر ممكن من العمود الفقري للبلازميد. يجب أن يكون هذا الملخص مصحوبًا بصورة لهلام تم تشغيل جزء منه (بمعايير MW مناسبة) ، مع الإشارة بوضوح إلى نطاق التحوير.

    سنقوم بتفريغ هضم التقييد بالكهرباء على هلام تحضيري وتنقية جزء التحوير.

    الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC) DNA للحقن المجهري

    لتلقي ضمان الخدمة القياسي ، يجب على TMF عزل الحمض النووي BAC للحقن المجهري. يجب على العملاء شحن مخزون من البكتيريا المحولة إلى TMF مع معلومات بما في ذلك حجم BAC وسلالة المضيف البكتيري وعلامة المضادات الحيوية المستخدمة لاختيار البكتيريا التي تحتوي على BAC. يمكن أيضًا تنقية BACs المخصصة للحقن المجهري من قبل العميل ، لكن في هذه الحالة لن يتم تطبيق ضمان الخدمة القياسي. يقوم TMF بتحليل جميع الحمض النووي BAC عبر PFGE قبل الحقن المجهري. تختلف طرق تحضير BAC للحقن المجهري في بيض الفئران عن تلك الخاصة بالبلازميدات الأصغر في عدة جوانب مهمة. تتلوث مستحضرات BAC بسهولة بالحمض النووي البكتيري أو الحمض النووي المتحلل ، وكلاهما يمكن أن يؤثر بشكل كبير على محصول الفئران المعدلة وراثيًا. يجب التعامل مع المحللات البكتيرية برفق شديد لتجنب قص الحمض النووي البكتيري (مما يجعل فصل الحمض النووي عن البكتيريا BAC أمرًا صعبًا للغاية).

    لتحضير DNA BAC ، نوصي باستخدام مجموعة تنقية DNA NucleoBond Xtra BAC من Macherey-Nagel.

    يمكن أيضًا العثور على بروتوكول مفصل لتحضير الحمض النووي BAC على موقع ويب University of Michigan Transgenic Core.

    يمكن حقن البنيات المعدلة وراثيا BAC كجزيئات دائرية. ليس من الضروري إزالة العمود الفقري البلازميد. على الرغم من أن أحداث تكامل النسخة المفردة قد تؤدي إلى فواصل مزدوجة الخيط داخل الجين المتحور ، فإن معظم العناصر المتكاملة تتكون من نسخ متعددة. في هذه الحالات ، يبدو أن إعادة التركيب بين جزيئات BAC الفردية يعيد تكوين الجينات المحورة السليمة. انظر المراجع التالية:

    1. المطران ج. 1996. إدخال الكروموسومات للحمض النووي الأجنبي. ريبرود نوتر ديف. 36: 607-18
    2. Brinster RL و Chen HY و Trumbauer ME و Senear AU و Warren R و Palmiter RD. 1985. العوامل المؤثرة في كفاءة إدخال الدنا الغريب إلى الفئران عن طريق حقن البيض المجهري. بروك. ناتل. أكاد. علوم. (الولايات المتحدة الأمريكية) 82: 4438-4442.
    3. كامبر ، سا و سوندرز ، تل. 2000. "الإنقاذ المعدّل وراثيًا للأنماط الظاهرية الطافرة باستخدام شظايا كبيرة من الحمض النووي." في: المعالجة الجينية لتعبير ووظيفة المستقبلات. Accili. د (محرر) جون وايلي وأولاده ، نيويورك. ص 1 - 22.
    4. Hammer RE ، Krumlauf R ، Camper SA ، Brinster RL ، Tilghman SM. 1987. يتم إنشاء تنوع التعبير الجيني لبروتين ألفا فيتوبروتين في الفئران من خلال مجموعة من عناصر مُحسِّن منفصلة. علم. 235: 53-8.
    5. Smith K. 2001. الآليات النظرية في التكامل المستهدف والعشوائي للحمض النووي المحور. ريبرود نوتر ديف. 41: 465-85.

    DNA البلازميد للتثقيب الكهربائي في الخلايا الجذعية الجنينية

    يجب أن يقوم العميل بإعداد الإنشاءات المستهدفة للتثقيب الكهربائي باستخدام إحدى طريقتين:

    سنقوم بخطي DNA البلازميد وإجراء التنقية النهائية قبل التثقيب الكهربائي. يجب توفير ما لا يقل عن 100 ميكروغرام من DNA البلازميد فائق الالتفاف إلى منشأتنا للتثقيب الكهربائي. قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الحمض النووي إذا كان العميل يحتاج إلى أكثر من العدد المعتاد من الخلايا المنتقاة بعد النمو في ظل ظروف انتقائية.

    نحتاج أيضًا إلى صورة هلامية للبلازميد ، غير المقطوع والمقطع باستخدام نوكلياز التقييد الذي سنستخدمه لخطي البلازميد ، لإثبات أن الإنزيم يقطع مرة واحدة فقط.

    الحمض النووي الجيني من خلايا ES من أجل النشاف الجنوبي أو PCR

    وصفة العازلة التحلل:
    10 مم تريس ، درجة الحموضة 7.5
    10 ملم يدتا
    10 ملي كلوريد الصوديوم
    0.5٪ و / ح ساركوسيل
    مرشح معقم للتخزين طويل الأجل
    قبل الاستخدام مباشرة ، أضف بروتيناز K (Sigma cat # P2308) إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل.


    Ceulemans S ، van der Ven K ، Del-Favero J: الفحص المستهدف والتحقق من اختلافات رقم النسخ. طرق Mol Biol. 2012 ، 838: 311-328. 10.1007 / 978-1-61779-507-7_15.

    Diskin SJ، Li M، Hou C، Yang S، Glessner J، Hakonarson H، Bucan M، Maris JM، Wang K: تعديل الموجات الجينومية في شدة الإشارة من منصات التنميط الجيني SNP للجينوم الكامل. الدقة الأحماض النووية. 2008 ، 36: e126-10.1093 / nar / gkn556.

    Komura D، Shen F، Ishikawa S، Fitch KR، Chen W، Zhang J، Liu G، Ihara S، Nakamura H، Hurles ME، Lee C، Scherer SW، Jones KW، Shapero MH، Huang J، Aburatani H: Genome- الكشف على نطاق واسع عن الاختلافات في عدد النسخ البشرية باستخدام صفيفات قليلة النوكليوتيد DNA عالية الكثافة. الدقة الجينوم. 2006 ، 16: 1575-1584. 10.1101 / غرام 5629106.

    Marioni JC و Thorne NP و Valsesia A و Fitzgerald T و Redon R و Fiegler H و Andrews TD و Stranger BE و Lynch AG و Dermitzakis ET و Carter NP و Tavare S و Hurles ME: كسر الموجات: تحسين الكشف عن اختلاف رقم النسخ من التهجين الجيني المقارن القائم على ميكروأري. جينوم بيول. 2007 ، 8: R228-10.1186 / gb-2007-8-10-r228.

    van de Wiel MA, Brosens R, Eilers PH, Kumps C, Meijer GA, Menten B, Sistermans E, Speleman F, Timmerman ME, Ylstra B: Smoothing waves in array CGH tumor profiles. Bioinformatics. 2009, 25: 1099-1104. 10.1093/bioinformatics/btp132.

    Benjamini Y, Speed TP: Summarizing and correcting the GC content bias in high-throughput sequencing. الدقة الأحماض النووية. 2012, 40: e72-10.1093/nar/gks001.

    Jacobs KB, Yeager M, Zhou W, Wacholder S, Wang Z, Rodriguez-Santiago B, Hutchinson A, Deng X, Liu C, Horner MJ, Cullen M, Epstein CG, Burdett L, Dean MC, Chatterjee N, Sampson J, Chung CC, Kovaks J, Gapstur SM, Stevens VL, Teras LT, Gaudet MM, Albanes D, Weinstein SJ, Virtamo J, Taylor PR, Freedman ND, Abnet CC, Goldstein AM, Hu N, et al: Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer. نات جينيه. 2012, 44: 651-658. 10.1038/ng.2270.

    Laurie CC, Laurie CA, Rice K, Doheny KF, Zelnick LR, McHugh CP, Ling H, Hetrick KN, Pugh EW, Amos C, Wei Q, Wang LE, Lee JE, Barnes KC, Hansel NN, Mathias R, Daley D, Beaty TH, Scott AF, Ruczinski I, Scharpf RB, Bierut LJ, Hartz SM, Landi MT, Freedman ND, Goldin LR, Ginsburg D, Li J, Desch KC, Strom SS, et al: Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer. نات جينيه. 2012, 44: 642-650. 10.1038/ng.2271.

    Baillie JK, Barnett MW, Upton KR, Gerhardt DJ, Richmond TA, De Sapio F, Brennan PM, Rizzu P, Smith S, Fell M, Talbot RT, Gustincich S, Freeman TC, Mattick JS, Hume DA, Heutink P, Carninci P, Jeddeloh JA, Faulkner GJ: Somatic retrotransposition alters the genetic landscape of the human brain. طبيعة سجية. 2011, 479: 534-537. 10.1038/nature10531.

    Liu GE, Hou Y, Robl JM, Kuroiwa Y, Wang Z: Assessment of genome integrity with array CGH in cattle transgenic cell lines produced by homologous recombination and somatic cell cloning. Genome Integr. 2011, 2: 6-10.1186/2041-9414-2-6.

    Ryba T, Hiratani I, Lu J, Itoh M, Kulik M, Zhang J, Schulz TC, Robins AJ, Dalton S, Gilbert DM: Evolutionarily conserved replication timing profiles predict long-range chromatin interactions and distinguish closely related cell types. الدقة الجينوم. 2010, 20: 761-770. 10.1101/gr.099655.109.

    Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, Devon K, Dewar K, Doyle M, FitzHugh W, Funke R, Gage D, Harris K, Heaford A, Howland J, Kann L, Lehoczky J, LeVine R, McEwan P, McKernan K, Meldrim J, Mesirov JP, Miranda C, Morris W, Naylor J, Raymond C, Rosetti M, Santos R, Sheridan A, Sougnez C, et al: Initial sequencing and analysis of the human genome. طبيعة سجية. 2001 ، 409: 860-921. 10.1038/35057062.

    Smit AF: Interspersed repeats and other mementos of transposable elements in mammalian genomes. العملة الجينية Opin Dev. 1999, 9: 657-663. 10.1016/S0959-437X(99)00031-3.

    Veal CD, Freeman PJ, Jacobs K, Lancaster O, Jamain S, Leboyer M, Albanes D, Vaghela RR, Gut I, Chanock SJ, Brookes AJ: A mechanistic basis for amplification differences between samples and between genome regions. علم الجينوم BMC. 2012, 13: 455-10.1186/1471-2164-13-455.

    Schubeler D, Scalzo D, Kooperberg C, van Steensel B, Delrow J, Groudine M: Genome-wide DNA replication profile for Drosophila melanogaster: a link between transcription and replication timing. نات جينيه. 2002, 32: 438-442. 10.1038/ng1005.

    Lee KH, Chiu S, Lee YK, Greenhalgh DG, Cho K: Age-dependent and tissue-specific structural changes in the C57BL/6J mouse genome. Exp Mol Pathol. 2012, 93: 167-172. 10.1016/j.yexmp.2012.04.013.

    Piotrowski A, Bruder CE, Andersson R, Diaz de Stahl T, Menzel U, Sandgren J, Poplawski A, von Tell D, Crasto C, Bogdan A, Bartoszewski R, Bebok Z, Krzyzanowski M, Jankowski Z, Partridge EC, Komorowski J, Dumanski JP: Somatic mosaicism for copy number variation in differentiated human tissues. همهمة موتات. 2008, 29: 1118-1124. 10.1002/humu.20815.

    Chen Y, Negre N, Li Q, Mieczkowska JO, Slattery M, Liu T, Zhang Y, Kim TK, He HH, Zieba J, Ruan Y, Bickel PJ, Myers RM, Wold BJ, White KP, Lieb JD, Liu XS: Systematic evaluation of factors influencing ChIP-seq fidelity. طرق نات. 2012, 9: 609-614. 10.1038/nmeth.1985.

    Li H, Durbin R: Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 2009, 25: 1754-1760. 10.1093/bioinformatics/btp324.

    Flicek P, Amode MR, Barrell D, Beal K, Brent S, Carvalho-Silva D, Clapham P, Coates G, Fairley S, Fitzgerald S, Gil L, Gordon L, Hendrix M, Hourlier T, Johnson N, Kahari AK, Keefe D, Keenan S, Kinsella R, Komorowska M, Koscielny G, Kulesha E, Larsson P, Longden I, McLaren W, Muffato M, Overduin B, Pignatelli M, Pritchard B, Riat HS, et al: Ensembl 2012. Nucleic Acids Res. 2012, 40: D84-90. 10.1093/nar/gkr991.

    Pohl AA, Sugnet CW, Clark TA, Smith K, Fujita PA, Cline MS: Affy exon tissues: exon levels in normal tissues in human, mouse and rat. Bioinformatics. 2009, 25: 2442-2443. 10.1093/bioinformatics/btp414.


    Effect of Homogenization Method on DNA Yield and Fragment Size

    A comparison of four methods used to homogenize mouse muscle for DNA isolation was performed. Liquid nitrogen chilled mortar and pestle, liquid nitrogen chilled CryoGrinder, rotor-stator, and high throughput bead beater were compared using the parameters of DNA yield, purity, and fragment size. Rotor-stator homogenizer generated the smallest fragments while the CryoGrinder produced the largest. The bead beater generated the highest yield while the traditional liquid nitrogen chilled mortar and pestle produced the least. The highest purity sample was produced with the bead beater while the rotor-stator had the lowest. No one method produced the greatest yield, purity, and fragment size. Depending upon the application, different homogenization methods can be matched to selected assays to gain the best results.

    Sample disruption is a necessary early step in the isolation of RNA, DNA, and proteins. Both chemical and physical methods are used to disrupt samples. Chemical methods typically rely on detergents and chaotropes while tools for physically disrupting samples include mixer mills (bead beaters), sonicators, mortar and pestles, and hand-held homogenizers (rotor-stators).

    Though chemical lysis is often the most efficient method, it is not always completely reliable for disrupting solid tissues. An alternative approach involves mechanically disrupting the sample. Two common methods of mechanical disruption are shearing through the use of a rotor-stator, which involves slicing, dicing, and/or cutting, and pulverizing/smashing through the use of a mixer mill or a mortar and pestle.

    Rotor-stators are used to quickly shear samples. They have a blade inside of a stationary, perforated tube which rotates at high speeds. It is essentially a circular scissor, very similar to a handheld blender. Rotor-stators are a classical and widely used tool for homogenizing samples. Mixer mills, or bead beaters, are used for individual samples and high throughput applications. Paint shakers and dental amalgamators were the original mixer mills, but have been replaced with machines designed for scientific use. The paint shakers' figure "8" motion has been superseded by the mixer mill's reciprocating linear motion. The mortar and pestle is a historic tool used for grinding samples. It is still popular, and when partnered with liquid nitrogen, it is effective for disrupting samples for DNA and RNA isolation. A miniaturized version of the mortar and pestle, the CryoGrinder&trade is now available for grinding very small samples (up to 100 mg).

    Much effort has been expended to optimize the conditions for isolating DNA from various tissues, however little has been reported as to the best homogenization method. In an effort to clarify the effect homogenization has on DNA isolation, a comparison was made between four tissue homogenization methods used to disrupt solid tissue in preparation for processing using a commercially available kit.

    المواد والأساليب

    عينات الأنسجة: Female CD1 mice, 42 days (Charles River Laboratories) were used and leg muscles were extracted, frozen, and stored at -140°C until use. For homogenization, tissue was thawed and processed as described below.

    DNA Purification from Tissue: Mouse muscle (25 mg) was homogenized as described below and DNA was purified using a modified QIAamp DNA Mini Kit protocol to isolate RNA-free DNA. As an alternative to the QIAamp DNA Mini Kit ATL lysis buffer which contains SDS and foams extensively during homogenization, 140μl TEN9 lysis buffer (50mM Tris pH 9, 100mM EDTA, 200mM NaCl) was used during homogenization or added to pulverized tissue following grinding. To this mixture, 20 &mul SDS and 20 &mul Proteinase K (10 mg/ml in water) were added. This TEN9 buffer with SDS and Proteinase K is essentially the same as ATL lysis buffer.

    Muscle homogenized cryogenically with the CryoGrinder or mortar and pestle were transferred to a container containing TEN9. Sample processing with rotor-stator and HT Homogenizer (bead beater) were homogenized in TEN9 buffer. In both instances, SDS and Proteinase K were added subsequently.

    Purified DNA was analyzed spectrophotometrically at 260 and 280 nm to measure concentration and purity. Agarose gel electrophoresis (1% agarose in 1X TAE buffer) was used to assess the fragment sizes of isolated DNA. For visualization, DNA samples were concentrated 20X by alcohol precipitation before electrophoresis.

    Homogenization: Homogenization was performed with liquid nitrogen chilled mortar and pestle (Coors), liquid nitrogen chilled CryoGrinder (OPS Diagnostics), rotor-stator homogenizer (Virtis), and HT Homogenizer mixer mill (OPS Diagnostics). A summary of each method is found in Table 1.

    الجدول 1. Methods used to homogenize mouse muscle.

    The sample (25 mg) was frozen with liquid nitrogen, placed in a cryogenically chilled 150 mm mortar, and then pulverized with a chilled pestle. Pulverized muscle was transferred to a chilled 2ml microfuge tube and suspended in 140 &mul TEN9 lysis solution followed by 20 &mul SDS and 20 &mul Proteinase K.

    CryoGrinder&trade (miniature mortar and motorized pestle)

    The sample (25 mg) was frozen in a CryoCooler with liquid nitrogen, placed into a pre-chilled CryoGrinder mortar, and then pulverized first with the small and then large motor driven pestles. Ground sample was transferred to a chilled 2ml microfuge tube and suspended in 140 &mul TEN9 lysis solution followed by 20 &mul SDS and 20 &mul Proteinase K.

    The sample (25 mg) was placed in a 96-well plate with one 5/32" stainless steel grinding ball (OPS Diagnostics, GBSS 156-5000-01), 140μl TEN9 (without 20 &mul SDS and 20 &mul Proteinase K), and then capped with a press on mat. The plate with sample was placed into the mixer mill (HT Homogenizer, OPS Diagnostics) and homogenized at 1200 rpm for 2 minutes. The lysate was then transferred to a 2ml microfuge tube, followed by the addition of 20 &mul SDS and 20 &mul Proteinase K.

    The sample (25 mg) was placed into a 4 ml plastic tube containing 140 &mul TEN9 (without SDS and Proteinase K) and mechanically homogenized with a 6mm tip (generator) at 10 K rpm for 2 min with a Tempest rotor-stator homogenizer (Virtis, Gardner, NY). The lysate was transferred to a 2 ml microfuge tube and 20 &mul SDS and 20 &mul Proteinase K were added.

    DNA yield, purity and fragmentation are affected by the method used to homogenize the sample. The greatest DNA yield was obtained by bead beating samples with the HT Homogenizer followed by the rotor-stator and CryoGrinder while the mortar and pestle had the lowest yield (Table 2). Likewise, the HT Homogenizer generated the DNA with the highest purity as measure by 260/280 ratio (Table 2). The CryoGrinder also had good purity followed by the mortar and pestle. The rotor-stator was had the poorest purity.

    Fragment size was significantly impacted by the homogenization method as the shearing method (rotor-stator) generated a continuum of fragments starting at a high of around 15 kb (Fig. 1). The HT Homogenizer generated a narrower range of larger fragments than the rotor-stator, as did the mortar and pestle. The CryoGrinder produced a much broader range of large fragments than the other methods. In addition to the fragments, significant fluorescence (larger molecular weight molecules) was present in the wells corresponding to the samples of the HT Homogenizer, rotor-stator, and CryoGrinder.

    Lane 1 - Lambda HinDIII digest

    Lane 4 - Mortar and pestle

    Lane 6-Lambda HinDIII digest

    الجدول 2. Optical Density, Ratio, and Yield of Purified DNA.

    260 nm 280 nm نسبة DNA Yield (&mug)
    HT Homogenizer 1.50 0.85 1.77 30.1
    Rotor-stator 0.71 0.55 1.29 14.2
    Mortar and Pestle 0.20 0.14 1.41 4.0
    CryoGrinder 0.46 0.29 1.60 9.2

    Methods used to homogenize tissue for DNA isolation impact yield, fragment size, and purity. Bead beating with the HT Homogenizer produced the highest yield and best purity. Cryogenic grinding with the CryoGrinder produced large DNA fragments, but lower yield and purity. The rotor-stator had a good yield, but the lowest purity and smallest fragments. The mortar and pestle had good size fragments, but relatively low purity and very poor yield. In short, no one method produced the highest yield, the highest purity, and largest fragments.

    A significant effect as a direct consequence of homogenization is DNA fragment size. Rotor-stators, which rely on a rotating knife for shearing tissues produce relatively small fragments as compared to bead beating and grinding. This result is not particularly surprising as large molecular weight DNA can be easily sheared by the simple act of pipetting. While the other three methods evaluated also generated a range of fragment sizes, none were nearly as heterogeneous as those produced by the rotor-stator. The bead mill generated larger fragments which may be a result of the high impact of the grinding ball a limited number of times (approximately 2500) compared with 20,000 rotations of the rotor-stator "knife." The mortar and pestle, including the CryoGrinder, disrupt more by crushing and grinding, and as such generated relatively large fragments. This was very apparent with the CryoGrinder. Grinding and crushing apparently have less of a deleterious effect on DNA than shearing.

    All four homogenization methods started with the same mass of mouse tissue, yet the yields were significantly different. Bead beating the muscle has previously been demonstrated to very effectively disrupt muscle fibers for protein release (see link). In comparison, disrupting muscle with a rotor-stator produced homogenates that retain muscle fibers and filaments. These small pieces of tissue are not thoroughly disaggregated by further treatment with SDS and Proteinase K, thus significant DNA is lost when the lysate is cleared by centrifugation prior to purification. The CryoGrinder was less effective than both the rotor-stator and the HT Homogenizer. With the CryoGrinder, some sample is not recovered from the mortar while grinding efficiency is similar to the rotor-stator. This leads to overall lower yields. The mortar and pestle had the lowest yield. However, this poor showing is less a factor of grinding efficiency as it is recovery. With small sample mass, grinding in a relatively large mortar makes collecting the pulverized sample difficult. The result is very low DNA yields. This yield issue with the mortar and pestle was the rationale for developing the CryoGrinder. The CryoGrinder, which works on the sample principle as the mortar and pestle, has a miniature mortar (approximately 1/2 inch in diameter) that limits the spread of the pulverized sample and allows for efficient collection following grinding.

    The different degrees of sample purity resulting from the processing are difficult to explain (Table 2). Once homogenized, all samples had SDS and Proteinase K added and then were purified using the QIAamp DNA Mini Kit. This kit is designed to remove impurities yet results varied based on the 260/280 ratio from 1.29 to 1.77 OD260/OD280. It is possible that contaminants other than those from the sample were introduced from the rotor-stator and mortar and pestle, both of which have been routinely used. The HT Homogenizer relies on consumable plates and balls which would limit contamination. In this test, the CryoGrinder was relatively new. Regardless of the source, it is important to note that intrinsic or extrinsic factors can affect the final purity of the DNA.

    Depending upon the application, each of these disruption methods has value. For large samples, grinding with liquid nitrogen in a mortar and pestle is still a viable option for DNA isolation. Fragment size is relatively large, though potential purity problems must be considered. For smaller samples, the CryoGrinder yields large fragments and decent yield. Often small fragments are desirable, in which case the rotor-stator can be used. Bead beating with the HT Homogenizer was effective at generating the most DNA with relatively large fragment size. It has the further advantage of being capable of processing hundreds of samples per hour. Thus, depending upon the objective, each of these tools is valuable for isolating DNA.


    المواد والأساليب

    Prion-infected tissues

    Storage and biochemical analysis of human brain samples was performed with consent from relatives and with approval from the Local Research Ethics Committee of the Institute of Neurology/National Hospital for Neurology and Neurosurgery (London, U.K.). All procedures were carried out in a microbiological containment level III facility with strict adherence to safety protocols. Brain homogenates [10% (w/v)] from patients with neuropathologically confirmed vCJD or from control samples of normal human brain were prepared in DPBS (Dulbecco's PBS) lacking Ca 2+ or Mg 2+ ions by serial passage through needles of decreasing diameter or the use of tissue grinders (Anachem) [10,25]. Brains from 200 terminal CD-1 mice infected with the RML prion strain [26] were homogenized in DPBS lacking Ca 2+ or Mg 2+ ions using tissue grinders and pooled to produce 970 ml of 10% (w/v) RML brain homogenate (designated I6200). Two batches of 18 brains from uninfected CD-1 mice were homogenized to produce two pools of ∼90 ml of 10% (w/v) normal CD-1 brain homogenate (designated I7219 and I8402). Similar procedures were used to generate 10% (w/v) brain homogenates from hamsters terminally infected with the Sc237 prion strain or from normal uninfected hamsters. Pooled homogenates were dispensed as aliquots and maintained at −70 °C until use.

    Titration of RML prions in CD-1 mice

    All procedures were carried out in a microbiological containment level III facility with strict adherence to safety protocols. Care of mice was performed according to institutional and national animal care committee guidelines. RML brain homogenate (I6200) [10% (w/v)] was serially diluted (10 −1 to 10 −8 ) using 1% (w/v) normal CD-1 brain homogenate as diluent. Aliquots of each dilution were inoculated either intracerebrally (30 μl) or intraperitoneally (100 μl) into groups of 6 CD-1 mice as described previously [27–29]. Mice were examined daily and were killed if exhibiting signs of distress or once a diagnosis of clinical prion disease was established [30]. Infectious prion titre (LD50) was calculated using the Reed–Muench formula [31].

    الهضم الأنزيمي

    Thermolysin (EC 3.4.24.27) from Bacillus thermoproteolyticus rokko was obtained freeze-dried from Sigma–Aldrich. The specific enzymatic activity is 50–100 units/mg of protein (where 1 unit liberates 1 μmol of tyrosine/min at pH 7.5 and 37 °C using casein as a substrate). PK (EC 3.4.21.64) from Tritirachium album limber was obtained freeze-dried from Merck. The specific enzymatic activity is approx. 30 Anson units/g (where 1 Anson unit is the amount of enzyme that liberates 1 mmol of Folin-positive amino acids/min at pH 7.5 and 35 °C using haemoglobin as a substrate). Stock solutions of 1 mg/ml thermolysin or PK were prepared in water and aliquots were stored at −70 °C. Aliquots of 10% (w/v) brain homogenates in DPBS were digested for variable time periods with thermolysin at a final protease concentration of 100 μg/ml at 70 °C or 37 °C, or with PK at a final concentration of 50 μg/ml (mouse brain) or 100 μg/ml (human brain) at 37 °C. Aliquots of the digests were snap-frozen for infectivity studies, or processed immediately for analysis by either immunoblotting or ELISA. Enzymatic deglycosylation of PrP prior to immunoblotting was accomplished by incubating 20 μl aliquots of 2% (w/v) SDS and heat-denatured brain homogenate with 1000 units of recombinant PNGase F (peptide N-glycosidase F) (New England Biolabs) in buffer containing 1% Nonidet P40 for 2 h at 37 °C according to the manufacturer's instructions. Samples were precipitated with 100% acetone for 1 h at −20 °C and centrifuged at 16100 زfor 30 min in a microfuge. Pellets were resuspended in 1× SDS sample buffer and analysed by immunoblotting.

    PrP immunoblotting

    Aliquots of brain homogenate were mixed with an equal volume of 2× SDS sample buffer [125 mM Tris/HCl (pH 6.8), 20% (v/v) glycerol, 4% (w/v) SDS, 4% (v/v) 2-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol Blue containing 8 mM 4-(2-aminoethyl)-benzenesulphonyl fluoride] and immediately transferred to a 100 °C heating block for 10 min. Samples were analysed by electrophoresis (16% gels) and immunoblotting as described previously [22,25]. Blots were blocked in PBST [PBS containing 0.05% Tween 20] and 5% (w/v) non-fat dried skimmed milk powder and probed with the anti-PrP monoclonal antibodies ICSM 35 (D-Gen), 3F4 (Signet Laboratories) or SAF32 (Spibio) at 0.2 μg/ml final antibody concentration in PBST. Blots were developed using alkaline-phosphatase-conjugated anti-mouse IgG secondary antibody and chemiluminescent substrate CDP-Star (Tropix), and visualized on Biomax MR film (Kodak) as described previously [25]. Densitometric analysis of PrP was performed by using Scion Image analysis software (Scion Corporation).

    Detergent-solubility studies

    Aliquots of 10% (w/v) brain homogenate (20 μl) were treated with 0.5 μl of benzonase (Benzon nuclease, purity 1 Merck). Samples were subsequently adjusted with 80 μl of PBS and 100 μl of PBS containing 4% (w/v) sodium lauroylsarcosine (Calbiochem) and incubated for 30 min at 37 °C with constant agitation. Samples were then centrifuged at 16100 ز for 30 min in a microfuge to generate soluble (supernatant) or insoluble (pellet) fractions. Soluble protein in the supernatant was precipitated with 1 ml of cold methanol (−20 °C) and recovered by centrifugation at 16100 ز for 30 min in a microfuge. The original detergent-insoluble pellets and methanol-precipitated supernatant protein pellets were re-suspended to a final volume of 40 μl with PBS containing 0.1% (w/v) sodium lauroylsarcosine, and 10 μl aliquots were either left untreated or digested with thermolysin (100 μg/ml final protease concentration) at 70 °C for 30 min or PK (50 μg/ml final protease concentration) at 37 °C for 1 h. Samples were analysed by electrophoresis and immunoblotting as described above.

    ELISA detection of PrP

    ELISA was performed using methods described previously [32] with adaptations. Brain homogenates were treated with thermolysin (100 μg/ml final protease concentration) at 70 °C or 37 °C or PK (50 or 100 μg/ml final protease concentration) at 37 °C for a range of incubation times. Subsequently, 10 μl aliquots of these samples or untreated brain homogenate and temperature controls were adjusted with 10 μl of 4% (w/v) SDS and heated at 100 °C for 10 min. Samples were centrifuged at 100 ز for 30 s before adjustment with 600 μl of 50 mM Tris/HCl (pH 8.4) containing 2% (v/v) Triton X-100, 2% (w/v) sodium lauroylsarcosine and 2% (w/v) bovine serum albumin (Fraction V, protease free, Sigma–Aldrich). Aliquots (50 μl) were transferred into the wells of microtitre plates (Microlon 96W, Greiner Bio-One) containing immobilized anti-PrP monoclonal antibody ICSM18 (250 ng/well D-Gen). After incubation at 37 °C for 1 h with constant agitation, wells were washed with 3×300 μl of PBST using an automated microplate washer, followed by the addition of 100 μl of PBS containing 1% Tween 20 and 1 μg/ml biotinylated anti-PrP monoclonal antibody ICSM35 (D-Gen). Following incubation at 37 °C for 1 h with constant agitation, wells were washed as detailed above, followed by the addition of 100 μl of PBS containing 1% Tween 20 and a dilution of streptavidin–horseradish-peroxidase conjugate (1:10000 dilution, Dako). After incubation at 37 °C for 30 min with constant agitation, wells were washed with 4×300 μl of PBST. Wells were developed with 100 μl of QuantaBlu working solution (Pierce) and the reactions were stopped by the addition of 100 μl of QuantaBlu stop solution (Pierce). Fluorescence (λالسابق=325 nm, λم=425 nm) was measured on a Tecan spectra image microplate reader.

    NaPTA (sodium phosphotungstic acid) precipitation

    The use of NaPTA was performed using a protocol adapted from Safar et al. [12] essentially as described previously [25]. Briefly, 100 μl aliquots of 10% (w/v) brain homogenate were treated with 1 μl of benzonase and were subsequently either digested with thermolysin (100 μg/ml final protease concentration) at 37 °C for 90 min or left untreated. Thermolysin digestion was stopped by the addition of EDTA (10 mM final concentration). Samples were subsequently adjusted with 100 μl of PBS containing 4% (w/v) sodium lauroylsarcosine, incubated at 37 °C for 30 min with constant agitation, and then further adjusted with 16.3 μl of a stock solution containing 4% (w/v) NaPTA (lacking magnesium chloride) (pH 7.4) to give a final concentration in the sample of 0.3% (w/v). Samples were incubated at 37 °C for 30 min with constant agitation before centrifugation at 16100 ز for 30 min in a microfuge. After careful isolation of the supernatant, the pellets were resuspended to 100 μl with PBS. Aliquots were processed immediately for analysis by ELISA.

    Scrapie cell assay

    High-sensitivity cell-culture assays for RML prion infectivity were performed as described previously by Klohn et al. [33]. Briefly, PK1 cells, a highly scrapie-susceptible N2a subclone, were exposed for 3 days in 96-well plates to serial dilutions (10 −3 and 10 −4 ) of 10% (w/v) RML brain homogenate either untreated or following digestion with thermolysin (100 μg/ml final protease concentration) at 37 °C or 70 °C or PK (50 μg/ml final protease concentration) at 37 °C for a range of incubation times. A serial dilution of untreated 10% (w/v) RML brain homogenate (3×10 −4 to 3×10 −6 ) of known infectivity titre was performed in parallel. Subsequently cells were split and passaged appropriately for the scrapie cell assay as described previously [33] and the infectivity titre of each sample was deduced from the reference preparation.

    تحليل احصائي

    All experiments were conducted at least three times. Figures show representative data and show means±S.E.M. or S.D.


    أساليب

    عينات

    The study conformed to the ethical guidelines of the 1975 Declaration of Helsinki and was approved by the Ribeirão Preto local Ethics Committee, Brazil, and Stanford University. Twenty-eight paraffin blocks containing breast cancers diagnosed in 1997 (n = 14 samples, ten years old) and 2007 (n = 14 samples, three to ten months old) were retrieved from the archives of the Pathology Service of the General Hospital of Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, Brazil. Each block contained one piece of breast cancer tissue measuring at least 1.5 × 1.5 cm in area. Using a conventional microtome (Leica RM2125), histological sections 10 microns in thickness were cut from each block according to protocol specifications (Table 7). A new sterile blade was used for each block to avoid contamination among the samples. All reactions were performed in an RNase-free environment benches, instruments, and pipetters were cleaned and treated with RNaseZap solution (Ambion Inc., Austin, TX) before each reaction, and RNase-free tips and microtubes were used.

    استخراج الحمض النووي الريبي

    All protocols were performed according to Manufacturer's instructions using their specified input of FFPE tissue sections (Table 7). Protocol 1 utilized the kit "RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Optimized for FFPE Samples" (Ambion Inc., Austin, TX) [27]. Protocol 2 utilized the "High Pure RNA Paraffin Kit" (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) [28]. Protocol 3 utilized the "Absolutely RNA ® FFPE Kit" (Stratagene, La Jolla, CA) [29]. Briefly, these three protocols share six steps: histological sectioning of FFPE tissue blocks, deparaffinization, Proteinase K digestion, RNA isolation, DNase incubation and RNA purification. Table 7 highlights the main differences among the three column purification-based protocols used in this work.

    Protocol 4 utilized the Agencourt ® "FormaPure™ Kit" (Agencourt, Beverly, MA) [30] followed by DNAse I digestion (Ambion Inc., Austin, TX). This kit utilizes Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI ® ) paramagnetic bead-based technology to isolate RNA from a maximum input of 10 mg of FFPE tissue (according to manufacturer's instructions, we used five 10 μm sections from each paraffin block). Similar to other protocols, a reagent (lysis buffer provided by the kit) is added to melt the paraffin and de-crosslink nucleic acids, and Proteinase K is added to complete tissue digestion and inactivate nucleases (60 minutes incubation time at 55°C). Contrary to the other three protocols, binding buffer is added to facilitate immobilization of the nucleic acids to the surface of paramagnetic beads and separation is magnetically-performed. This protocol does not require centrifugation.

    The RNA extraction from each of the 28 cases was done in triplicate: 84 extractions per protocol for each of the four protocols, for a total of 336 RNA extraction procedures.

    Evaluation of quantity and quality of the extracted RNA

    The RNA extracted in triplicate from the 28 breast cancer samples using the four protocols was analyzed (n = 336) for quantity and quality. To rapidly quantify RNA, the Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), a chip-based nucleic acid separation system, was used. The Bioanalyzer utilizes a combination of micro-fluidics, capillary electrophoresis, and fluorimetry to determine RNA length, distribution and concentration [22, 23]. The RNA 6000 Pico Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) was used together with a standardized RNA ladder (Ambion, Austin, TX) for RNA analysis and quantification. The quantity of RNA was expressed in pg/μl (per the PicoChip) and the quality was expressed by the RNA integrity number (RIN). For both quantity and RIN, the following parameters were evaluated: minimum value, maximum value, mean value, and median value using the statistical software GraphPad Prism, version 4.0 (San Diego, CA). Only samples which had measurable RINs were included in the analyses. Case success was defined for each protocol as the percentage of samples in the 14 sample set in which at least one of three RNA extraction attempts provided biologically useful RNA with a RIN ≥ 1.4.

    RT-PCR for assaying RNA fragment size using different target lengths for glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)

    To determine fragment sizes of RNA extracted from archival FFPE specimens, we targeted the housekeeping gene G6PD with different mRNA primer sets and performed RT-PCR as described by Liu وآخرون.[26]. From each of the 28 FFPE samples included in this study (14 ten year old samples and 14 months old samples), extracted RNA with RINs greater than 1.4 were used for RT-PCR analyses.

    All primers were designed by Liu et al. One sense primer (5'-GGC AAC AGA TAC AAG AAC GTG AA) and three antisense primers were used such that combinations of these primers would generate PCR amplicons of 67 bp (5'-CGC AGA AGA CGT CCA GGA T), 151 bp (5'-CCA GCT CAA TCT GGT GCA G), and 242 bp (5'-CCC TCA TAC TGG AAA CCC ACT), respectively. The sense primer was cleverly designed by Liu et al. to span two exons so that it would not anneal to or amplify genomic DNA.

    Multiplex RT-PCR was carried out using Superscript™III One-Step RT-PCR with Platinum Tag system (Invitrogen, Carlsbad, CA) and optimized using Universal Human Reference RNA (Stratagene, La Jolla, CA) prior to testing samples. The template consisted of 0.2–2 μg of RNA from the months old samples, depending on RNA quantity extracted, or 100 pg of RNA from 10 year old samples. Each reaction contained 250 pmol of sense primer and 100 pmol of each antisense primer. The first reverse transcription step was performed at 50°C for 30 min. The following PCR steps was carried out using a ''hot-start and touch-down'' program of 94°C for 2 minutes, followed by 1 cycle of denaturing at 94°C for 30 seconds, annealing at 66°C (one degree down per cycle until 59°C is reached) for 30 seconds, and extension at 68°C for 45 seconds, and then 30 cycles of 94°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, and 68°C for 45 seconds. A final extension was performed at 68°C for 10 minutes. PCR products were analyzed by electrophoresis on 2% agarose gels and visualized using ethidium bromide staining. Fragments that were not visible on the gel by multiplex RT-PCR were reassessed by PCR with single sets of primers using the first RT-PCR product as template.


    شاهد الفيديو: كمال أجسام. كم يحتاج جسمك من البروتين يوميا لبناء العضلات شرح مبسط (أغسطس 2022).